Automatisierte radiochemische Synthese von [<sup&gt; 18</sup&gt; F] 3F4AP: Ein neuartiger PET-Tracer zur Bildgebung von demyelinisierenden Krankheiten

Zusammenfassung

Wir zeigen die halbautomatisierte radiochemische Synthese von [ ¹⁸ F] 3F4AP und Qualitätskontrollverfahren.

Zusammenfassung

3- [ ¹⁸ F] fluor-4-aminopyridin, [ ¹⁸ F] 3F4AP, ist ein radiofluoriertes Analogon des FDA-zugelassenen Arzneimittels für Multiple Sklerose 4-Aminopyridin (4AP). Diese Verbindung wird derzeit als PET-Tracer zur Demyelinisierung untersucht. Wir haben vor kurzem eine neuartige chemische Reaktion beschrieben, um metafluorierte Pyridine herzustellen, die aus einer direkten Fluorierung eines Pyridin-N-Oxids und der Verwendung dieser Reaktion für die radiochemische Synthese von [ ¹⁸ F] 3F4AP bestehen. In diesem Artikel zeigen wir, wie man diesen Tracer mit einem automatisierten Synthesizer und einem hauseigenen Durchfluss-Hydrierungsreaktor herstellt. Wir zeigen auch die Standard-Qualitätskontrollverfahren, die vor der Freisetzung des Radiotracers für präklinische Tierbildgebungsstudien durchgeführt wurden. Dieses halbautomatisierte Verfahren kann als Grundlage für die zukünftige Produktion von [ ¹⁸ F] 3F4AP für klinische Studien dienen.

Einleitung

Die Fähigkeit, ein kleines Molekül-Medikament nicht-invasiv innerhalb des menschlichen Körpers zu verfolgen, hat ein großes Potenzial für Präzisionsmedizin. Unter den molekularen Bildgebungsverfahren hat die Positronenemissionstomographie (PET) viele günstige Eigenschaften: Die hohe Empfindlichkeit von PET-Detektoren ermöglicht die Detektion und Quantifizierung von sehr geringen Mengen an radioaktivem Material und die Eigenschaften der Scanner ermöglichen eine genaue räumliche Abbildung der Arzneimittellokalisation ^{1 , 2 , 3} Beispielsweise ermöglicht PET die Detektion und Lokalisierung von Tumoren und Metastasen auf der Grundlage der Aufnahme eines radioaktiven Glukose-Analogons [ ¹⁸ F] FDG ⁴ . PET kann auch Lokalisation und Quantifizierung von spezifischen Hirnrezeptoren und deren Belegung bereitstellen, die für die Diagnose und das Verstehen neurologischer und psychiatrischer Störungen wertvoll sein können. Um zu entwickelnEin kleiner Molekül-PET-Tracer, muss die interessierende Verbindung mit einem Positronen emittierenden Isotop, typischerweise ¹¹ C oder ¹⁸ F, markiert werden. Zwischen diesen beiden Radioisotopen hat ¹⁸ F eine längere Halbwertszeit (109 min gegen 20,3 für ¹¹ C) , Die eine Mehrfachdosis- und Offsite-Produktion ermöglicht. Trotzdem kann das Hinzufügen von ¹⁸ F zu einem Molekül schwierig sein. ¹⁸ F-Etikettierung erfordert schnelle Reaktionen, die mit der Automatisierung kompatibel sind, wodurch der Chemiker die direkte Handhabung der Aktivität erleichtert und hochabsorbierte Strahlendosen empfängt.

Wir haben vor kurzem die Verwendung von Pyridin-N-Oxiden als Vorläufer für die Fluorierung von Pyridinen und die Verwendung dieser Chemie in der radiochemischen Synthese von [ ¹⁸ F] 3F4AP ⁶ beschrieben, ein radiofluoriertes Analogon des FDA-zugelassenen Arzneimittels für Multiple Sklerose, 4- Aminopyridin (4AP) ^{7 , 8 , 9} ThIst neuartiger Radiotracer wird derzeit als PET-Tracer zur Demyelinisierung ^{10 , 11 , 12} untersucht. In diesem Videoprodukt demonstrieren wir die halbautomatisierte Synthese dieser Verbindung unter Verwendung einer IBA Synthera Synthese Unit (im Folgenden als "Synthesizer" bezeichnet) und einer eigens entwickelten Strömungshydrierungsvorrichtung. Die Synthese basiert auf der in Abbildung 1 dargestellten Reaktion. Die Vorbereitung für das Verfahren dauert ca. 1 h, Radiomarkierung und Reinigung 1,5 h und Qualitätskontrollverfahren 0,5 h.

Protokoll

ACHTUNG: Alle Verfahren, die den Einsatz radioaktiver Stoffe beinhalten, müssen vom örtlichen Strahlenschutzamt genehmigt werden. Bei der Arbeit mit radioaktiven Materialien tragen Sie einen Laborkittel und persönliche Strahlungsabzeichen. Verwenden Sie zu jeder Zeit zwei Lagen Handschuhe und kontrollieren Sie die Hände mit einem Geiger-Zähler nach jedem Schritt, der die Handhabung der Radioaktivität beinhaltet. Wenn die Handschuhe mit Radioaktivität verunreinigt sind und ersetzen Sie Außenhandschuhe. Verwenden Sie eine geeignete Abschirmung, minimieren Sie die Zeit in Kontakt mit der Strahlungsquelle und maximieren Sie den Abstand.

1. Eine Woche vor dem Experiment: Vorbereitung der Materialien

1. Download [ ¹⁸ F] 3F4AP Sequenz: Synthera Benutzer können sich in der Benutzer Datenbank (http://www.iba-radiopharmasolutions.com/products/chemistry) anmelden und die Sequenzdatei für 3F4AP herunterladen. Benutzer von anderen Synthesizern müssen möglicherweise ihr eigenes Skript auf der Grundlage der Reihenfolge der Schritte schreiben. Durchsuchen Sie die kommentierte Sequenz, um sich mit dem s vertraut zu machenTeps in der Synthese beteiligt.
2. Stellen Sie sicher, dass für die Synthese genügend Gas vorhanden ist. Der Synthesizer benötigt komprimiertes Gas, entweder Helium oder Stickstoff. Es erfordert auch> 75 psi Druckluft. Stellen Sie sicher, dass der Druck innerhalb des vom Hersteller empfohlenen Drucks liegt.
3. Vorbereiten der HPLC-Mobilphase: Herstellung von 1 l 50 mM Natriumphosphat und 10 mM Triethylamin. Mit einem pH-Meter wird der pH-Wert durch Zugabe von tropfenweise gesättigtem Natriumhydroxid unter Rühren auf 8,0 ± 0,1 eingestellt. Die Lösung wird durch einen 0,22 μm-Bottletop-Filter filtriert und mit 5% Ethanol versetzt.
4. Trockene Glaswaren im Ofen über Nacht.

2. Tag des Experiments: Vor der Ankunft von Fluor-18

1. Mit 1 ml Spritzen die Reagenzgefäße mit den entsprechenden Reagenzien füllen. Für die Fläschchen 2 und 3 verwenden Sie mit Ofen getrocknete Fläschchen und wasserfreie Lösungsmittel unter Argon. Die Fläschchen mit Crimpdichtungen mit einem Crimper versiegeln.
   1. Füllfläschchen 1 (11 mm Durchmesser / 2 mL Volumen viAl) mit 400 & mgr; l TBA-HCO ₃ + 800 & mgr; l Acetonitril (MeCN).
   2. Füllen Sie die Durchstechflasche 2 (13 mm / 4 ml Durchstechflasche) mit 50 & mgr; l Vorläuferlösung 1,0 mg / ml + 450 & mgr; l MeCN.
   3. Füllung Vial 3 (11 mm / 2 mL Durchstechflasche) mit 500 μl MeCN.
   4. Füllen Sie die Durchstechflasche 4 (13 mm / 4 ml Durchstechflasche) mit 4 ml 0,2% Oxalsäure in Methanol (MeOH).
2. Bedingung der QMA (starker Anionenaustausch) und Alumina-N Festphasenextraktionskartuschen. Unter Verwendung einer 10-ml-Spritze werden 5 ml 8,4% NaHCO ₃ tropfenweise durch das QMA geleitet, gefolgt von 5 ml ultrareines deionisiertes Typ I Wasser (18,2 ΜΩ · cm bei 25 ºC). Führen Sie 5 ml ultrareines Wasser tropfenweise durch Alumina-N-Patrone, gefolgt von 5 ml MeOH + 0,2% Oxalsäure.
3. Schalte die HPLC ein und konditioniere die C-18 Säule mit 4 mL pro min der mobilen Phase für 30 min.
4. Laden Sie eine neue Katalysatorpatrone auf den Hydrierpatronenhalter und starten Sie einen Fluss von 0,5 ml / min 100% MeOH. SUnd den Wasserstoffregler auf 50 psi stellen und die Patrone für 15 min konditionieren (Abbildung 2 ).
5. Montieren Sie den integrierten Fluidprozessor (IFP), indem Sie die Fläschchen 1 bis 4 in ihre Positionen einführen, indem Sie die Patronen und die Sammelfläschchen wie in Abbildung 3 gezeigt anschließen. Bringen Sie eine Sammelfläschchen mit einer Entlüftungsnadel an die Ausgangsleitung des Hydrons an.
6. Starten Sie die Software des Synthesizers. Geben Sie Login und Passwort ein. Führen Sie die Vorlaufkontrollen des Synthesizers gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
7. Klicken Sie auf "Sequenzen" und dann auf "Öffnen", um die 3F4AP-Sequenz zu laden.
8. Laden Sie den IFP, indem Sie auf die Schaltfläche "Laden" auf dem Bildschirm klicken. Geben Sie einen Dateinamen für den Lauf ein und starten Sie die Sequenz, indem Sie auf "Start" klicken. (Der automatisierte Synthesizer pausiert automatisch vor dem ¹⁸ F Ladevorgang.)
9. Beobachten Sie, wie der Synthesizer durch die Routine-Selbst-Check-Schritte (Teil eins der Sequenz) geht. Schau dir das Geröll anUm sicherzustellen, dass es keine Warnungen oder Alarme gibt. Achten Sie auf Geräusche, da der Synthesizer Spuren und Vorwärmen Reaktionsgefäß in Vorbereitung für den Lauf. Die Temperaturanzeige sollte steigen und bei 65 ºC bleiben. Warten Sie auf das Signal (akustischer Signalton), der anzeigt, dass der Synthesizer für die ¹⁸ F-Übertragung bereit ist.

3. Tag des Experiments: ¹⁸ F Etikettierung

1. Fernübertragung der gewünschten Menge an Zyklotron-erzeugtem ¹⁸ F vom Zyklotron-Target auf ¹⁸ F-Durchstechflasche. Überprüfen Sie die Menge der Radioaktivität und notieren Sie sie mit dem Zeitpunkt der Lieferung.
   HINWEIS: Wenn Sie keine direkte Leitung für ¹⁸ F ^- Transfer verwenden, verwenden Sie eine vorgefüllte Spritze mit einer Nadel, die angebracht ist, um die Aktivität in die Durchstechflasche durch das Septum zu übertragen. Die Menge der anfänglichen Radioaktivität hängt von den vom Amt für Strahlensicherheit festgelegten Grenzwerten und der gewünschten Menge an Endtracer ab. Typische Menge liegt zwischen 50 und 500 mCi.
2. Fortsetzung der Sequenz auf dem Synthesizer durch Drücken von "Fortsetzen". Damit wird die Übertragung der ¹⁸ F in die QMA eingeleitet.
3. Überwachen Sie die Progression der Synthese in der automatisierten Sequenz auf dem Computerbildschirm.
   1. Beobachten Sie die Übertragung der ¹⁸ F aus der Durchstechflasche auf die QMA für 90 s. Nach dem Fangen von ¹⁸ F ^- auf QMA eluiert es mit TBA-HCO ₃ Lösung (Durchstechflasche 1). (Teil zwei der Sequenz)
   2. Überwachen Sie die Druck- und Temperaturspuren auf dem Synthesizer, während der TBA ¹⁸ F unter vermindertem Druck (5 kPa) und Erhitzen (100 ºC) getrocknet wird, gefolgt von zusätzlichen Trocknungs- und Abkühlschritten. (Teil 3 der Sequenz)
   3. Beobachten Sie die Übertragung von wasserfreiem MeCN (Fläschchen 3) und Vorläuferlösung (Fläschchen 2) in den Reaktor und wie es für 1 min bei Raumtemperatur reagiert. Die Lösung sollte farblos oder sehr schwach sein. (Teil 4 der Sequenz)
   4. Beobachten Sie den Transfer von OxalsäureLösung (Durchstechflasche 4) zum Reaktor. Beobachten Sie, wie die Lösung aus dem Reaktor durch die Aluminiumoxid-N-Patrone in die Endprodukt-Durchstechflasche überführt wird. (Teil 5 der Sequenz)
4. Am Ende der Sequenz den Bericht ausdrucken, den IFP auswerfen, die Gasbehälter abschalten und die Software schließen.
5. Während Sie zuerst das Verfahren festlegen, messen Sie die Radioaktivität in der Aluminiumoxid-N-Patrone und der Sammelfläschchen, indem Sie die Patrone und die Durchstechflasche separat in den Dosis-Kalibrator einführen. Notieren Sie die Aktivität und die Zeit der Messung. Legen Sie die gebrauchte Patrone in einen verbleiten Abfallbehälter. Legen Sie die Sammelfläschchen in einen geschirmten Behälter für den Transport zum nächsten Schritt.
6. Mit einer 1-ml-Spritze mit einer 2 "-Nadel befestigt, manuell über 100 μl Probe der Zwischenproduktlösung in eine Standard-HPLC-Durchstechflasche für die In-Prozess-Qualitätskontrolle. Injizieren Sie 10 μl dieser Probe in die HPLC, um die Reinheit zu bewerten Identität der intermeDiatverbindung
   HINWEIS: HPLC-Bedingungen: XDB 5 μm, 9,4 x 250 mm C18 Säule. Durchfluss 4 mL / min. Mobile Phase (50 mM Na ₂ HPO ₄ , 10 mM TEA, 5% EtOH). Isokratisch 15 min.

4. Tag des Experiments: Hydrierung

ACHTUNG: Die Einspritzung des Produkts in den Hydrator muss mit geeigneten Vorsichtsmaßnahmen durchgeführt werden. Wasserstoffgas muss ordnungsgemäß gehandhabt und entlüftet werden.

HINWEIS: Der Hydrierungsreaktor kann anstelle der HPLC-Säule auf dem Synthesizer angeschlossen und mit der Synthesizer-Software gesteuert werden.

1. Stellen Sie den Hydriermittelfluss mit 0,5 mL / min ein, indem Sie die Synthesizer-HPLC-Sequenz starten. Manuelles Einrichten des Wasserstoffdrucks auf 50 psi.
   1. Nach Beendigung der Etikettier- und Abschreckstufen überträgt der Synthesizer die Zwischenproduktlösung in Hydrier- / HPLC-Schleife.
2. Wenn der radioaktive Peak auf der HPL erscheintC Software schaltet das Sammelventil ein, um das Produkt zu sammeln. Messen Sie die Radioaktivität des Rohprodukts mit einem Dosiskalibrator.
   HINWEIS: Das Rohprodukt sollte in ein automatisiertes HPLC-System in einer heißen Zelle injiziert werden. Nach der Reinigung wird das Endprodukt dann gesammelt und in eine aseptische ISO-Klasse 5 laminare Luftströmungs-Heißzelle gemäß USP- und FDA-Vorschriften abgegeben.

5. Tag des Experiments: Reinigung und Vorbereitung der Dosis

1. Injizieren Sie Rohprodukt in die HPLC und verwenden Sie den automatisierten Fraktionssammler, um die Fraktionen zu sammeln, die dem Endproduktpeak entsprechen. Jede Röhre enthält 0,66 ml Lösung.
   HINWEIS: HPLC-Bedingungen: XDB 5 μm, 9,4 x 250 mm C18 Säule. Durchfluss 4 mL / min. Mobile Phase (50 mM Na ₂ HPO ₄ , 10 mM TEA, 5% EtOH). Isokratisch 15 min. 4-15 min sammeln
2. Messen Sie die Radioaktivität jeder Fraktion mit einem Dosis-Kalibrator und notieren Sie sie. Kombinieren Sie die Fraktionen mit der höchsten MengeS der Radioaktivität (typischerweise Röhrchen 14-18).
3. Ziehen Sie die Produktlösung mit einer 10 ml Spritze und führen Sie die Probe durch 0,22 μm Filter in eine sterile Durchstechflasche. Notieren Sie die Menge an Radioaktivität, Ende der Synthesezeit und Lösungsvolumen auf dem Fläschchenetikett. Dies ist die endgültige Dosis für die Injektion. Beiseite legen ~ 0,8 mL der Lösung für Qualitätskontrolle Tests.

6. Tag des Experiments: Qualitätskontrolle (QC) Tests

1. Vor der Freisetzung:
   Überprüfen Sie die Dosis durch Blei-geschirmtes Glas. Die Lösung muss klar, farblos und frei von Partikeln sein.
2. Radiochemische Identität:
   1. Für RadioTLC: Spot einen Tropfen der Probe auf einer TLC-Platte Seite an Seite mit dem Referenzstandard. Führen Sie die TLC-Platte auf einer DC-Kammer mit 95% MeOH: 5% Essigsäure. Den Referenzstandard unter UV-Beleuchtung visualisieren und mit Bleistift markieren.
   2. Tip die TLC-Platte auf die Stufe des RadioTLC ScannsEr und Rekordzeit des Gipfels. R _f -Werte des Referenzstandards und des radioaktiven Peaks müssen innerhalb von 5% übereinstimmen.
   3. Für RadioHPLC: 10 μl der Dosis mit und ohne Referenzstandard auf der HPLC durchführen. Die Retentionszeit des Referenzstandards und der radioaktive Peak müssen übereinstimmen. Ein einziger Coelution-Peak muss auf der Stachelprobe gesehen werden.
3. Für radiochemische Reinheit: Messen Sie den Bereich unter Kurve für die radioHPLC und radioTLC Zielspitzen. Der Bereich der Zielspitze muss> 95% der Fläche für alle radioaktiven Spitzen sein.
4. Für die spezifische Radioaktivität: Berechnen Sie die spezifische Radioaktivität als die Menge an Radioaktivität im Peak (gemessen in Schritt 5.2) über die Massenmenge, die aus dem Bereich unter der Kurve der UV-HPLC-Spur bestimmt wird, mit einer vorgegebenen Eichkurve. Die spezifische Radioaktivität muss höher als 50 mCi / μmol sein.
5. Für die restliche Lösemittelanalyse: die Menge des Restlösels messenTs (MeCN, MeOH) in der Dosis mittels Gaschromatographie. Die Lösungsmittelniveaus müssen <0,04% für Acetonitril und <3.000 ppm für Methanol sein. Die Menge an EtOH muss weniger als 10% w / v betragen.
6. Für den Sterilfilter-Integritätstest (Blasenpunkt): Verbinden Sie den in Schritt 5.3 verwendeten Filter mit einer Stickstoffversorgung, die mit einem Druckregler ausgestattet ist, und tauchen Sie die Nadel in Wasser ein. Allmählich das Gasventil öffnen, während man das Manometer beobachtet. Der Filter sollte Druck bis zu 50 psi widerstehen, ohne zu zerreißen, wie durch das Fehlen eines Stroms von Blasen von der Nadel belegt wird. Erhöhen Sie den Druck über 50 psi, bis ein Strom von Blasen aus der Nadel kommt. Notieren Sie diesen Druck, es ist der Berstdruck und es muss> 50 psi sein.
7. Für die Radionuklid-Halbwertszeit: Messung der Radioaktivität des Produkts zu zwei Zeitpunkten ≥10 min auseinander in einem Dosis-Kalibrator. Berechnen Sie die Halbwertszeit mit der folgenden Gleichung. Die Halbwertszeit muss mit der von ¹⁸ F innerhalb von 5 Minuten übereinstimmen (109 ± 5 min):
   T _½ ^berechnet = 0,693 t ÷ ln (A ₁ / A ₂ )
   Wobei t das Intervall zwischen den Messungen und A ₁ , A ₂ die zu jedem Zeitpunkt gemessene Aktivität ist.
8. Für die radionuklidische Identität und Reinheit: das γ-Strahlenspektrum einer Probe des Produktes mit einem Gammazähler erhalten. Das Spektrum sollte einen einzigen Foto-Peak bei einer Energie von 511 keV aufweisen. Es sollten keine anderen Foto-Peaks im Spektrum vorhanden sein.
9. Für die Endotoxinanalyse: Messen Sie die Endotoxinspiegel mit einem LAL-chromogenen Endotoxin-Quantifizierungstest. Endotoxinspiegel müssen <1,75 EU / ml für ein 1: 10 verdünntes Produkt mit einem Endproduktvolumen von 10 ml betragen.
10. Dokumentieren Sie die Ergebnisse von jedem QC-Test. Lassen Sie die Dosis für Tierversuche nur, wenn alle Tests bestanden haben.
11. Post-Dose-Freisetzung:
    Für den Sterilitätstest: Fügen Sie eine Probe der Dosis sowohl zu flüssigem Thioglycolat als auch zu Trypticase hinzuSoja-Brühe. Nach 14 Tagen ist kein Wachstum auf den Medien zu sehen.

7. Tag des Experiments: Berechnungen (Tabelle 1)

1. Für die nicht zerfallkorrigierte radiochemische Ausbeute (ndc RCY): berechnen Sie das ndc RCY als die Menge an Radioaktivität im Endprodukt über die Ausgangs-Radioaktivität.
2. Für die Radiomarkierungseffizienz: Berechnen Sie die Markierungsausbeute als Verhältnis der Radioaktivität in der Sammelfläschchen über die Radioaktivität in der Aluminiumoxid-N-Patrone (uneingetragene [ ¹⁸ F] F ^- ) und der Sammelfläschchen.
3. Für die Hydrierungsausbeute: Berechnen Sie die Hydrierungsausbeute als die Menge an Radioaktivität in dem gewünschten Peak über die in die HPLC injizierte Radioaktivität.
4. Für die Filterverluste: Die Filterung verliert, da die Radioaktivität im Filter verbleibt und vor der Filterung über Radioaktivität spritzt.

Ergebnisse

Die radiochemische Synthese von [ ¹⁸ F] 3F4AP besteht aus zwei Schritten (Abbildung 1 ). Der erste Schritt wird vollautomatisch mit der Syntheseeinheit durchgeführt (Abbildung 3 ). Dieses kassettenbasierte System verwendet vier Reagenzgefäße und eine Reaktorfläschchen und verfügt über computergesteuerte Ventile, die den Transfer und das Mischen von Reagenzien sowie die Erwärmung, Druckbeaufschlagung und Evakuierung des Reaktors ermöglichen. Darüber hinaus unterstützt es Standard-Festphasen-Extraktionskartuschen zur Trennung von Reagenzien. Die Computerschnittstelle ermöglicht es Benutzern, Skripte zu schreiben und zu modifizieren, um eigene Synthesen auszuführen. Im Falle von [ ¹⁸ F] 3F4AP besteht das Syntheseverfahren aus fünf Grundteilen. Im ersten Teil führt der Synthesizer Selbstkontrollschritte durch, wärmt den Reaktor vor und wartet auf das Signal des Bedieners, dass die ¹⁸ F bereit sind. Während des zweiten Teils wird das [ ¹⁸ F] Fluorid übertragenM die ¹⁸ F-Durchstechflasche in die Anionenaustauschpatrone geben und aus der Kartusche in den Reaktor unter Verwendung einer Lösung Tetrabutylammoniumbicarbonat eluieren. Der dritte Teil, der Synthesizer azeotropisch trocknet das [ ¹⁸ F] Fluorid unter Vakuum, um es reaktiv gegenüber nukleophilen Verschiebung zu machen. Im vierten Teil wird der Vorläufer automatisch dem Reaktor zugesetzt, wo er mit dem ¹⁸ F ^- reagiert, um die markierte Verbindung zu erzeugen. Schließlich wird die Reaktion durch Zugabe von 0,2% Oxalsäure in Methanol abgeschreckt, was eine Base-geförderte Zersetzung des Produkts verhindert, und die endgültige Lösung wird nach Durchlaufen einer Aluminiumoxid-N-Patrone, die irgendwelche einfließt, auf das Sammelfläschchen übertragen Nicht umgesetztes Fluorid

Nachdem der Etikettierungsschritt abgeschlossen ist, kann eine kleine Probe zur Qualitätskontrolle genommen werden. Das Ausführen einer Probe auf der HPLC gibt Bestätigung an, dass der Etikettierungsschritt funktioniert und ein SchätzwertOn der radiochemischen Reinheit (Abbildung 4 ). Auch aus der UV-Spur auf der HPLC kann die Massenmenge des Produktes mit einer vorgegebenen Eichkurve berechnet werden.

Während die in Betrieb befindliche Qualitätskontroll-HPLC läuft, wird der zweite Reaktionsschritt, die Reduktion der N-Oxid- und Nitrogruppen, durchgeführt. Um dies zu erreichen, wird das markierte Produkt automatisiert in eine hauseigene Hydrierungsvorrichtung auf der Grundlage der von Yoswathananont et al. ¹³ ( Fig. 2 ). Diese Vorrichtung besteht aus einer HPLC-Pumpe und einem komprimierten Wasserstofftank, der mit der Durchfluss-Hydrierungsvorrichtung verbunden ist, durch Leitungen, die mit Rückschlagventilen ausgestattet sind, um ein Rückströmen zu verhindern. Das Produkt wird durch die HPLC-Pumpe geschoben und mit Wasserstoff in einem T-förmigen Mischer vermischt. Diese Mischung wird dann durch eine kleine Patrone geführt, die 10% Pd / C-Katalysator auf einem festen Träger enthält. Nach dem Durchlaufen der CataLyst das reduzierte Produkt wird dann in kleinen Fraktionen gesammelt.

Nach der Hydrierung wird das Rohprodukt zur Reinigung des Endprodukts transportiert und manuell in die HPLC injiziert (Abbildung 5 ). Die mobile Phase der HPLC wurde so ausgewählt, dass sie mit der Tierinjektion kompatibel ist. Die dem Produkt entsprechenden Peaks werden dann gesammelt und filtriert-sterilisiert, um die endgültige Dosis zu erhalten.

Vor der Freisetzung der Dosis für PET-Imaging-Studien werden Qualitätskontrolltests durchgeführt. Diese Tests werden durchgeführt, um sicherzustellen, dass der Tracer die chemische Einheit ist, die es sein soll und dass es für die Injektion sicher ist. Einige dieser Tests sind möglicherweise nicht für die Injektion in Tiere erforderlich, aber es wird allgemein empfohlen, den Richtlinien für die menschliche Verwendung zu folgen. Damit sorgt die Qualität des Produktes, was das Vertrauen in die Ergebnisse erhöht und stark fokussiertIlitiert den künftigen Übergang zur Herstellung des Produkts für die menschliche Injektion.

Tabelle 1 enthält die typischen Syntheseparameter einschließlich Anfangsmenge Radioaktivität, Anfangsmenge des Vorläufers, Ausbeute für jeden Schritt, spezifische Aktivität, Filterung verliert, etc. Diese Parameter sind nützliche Fehlerbehebung gelegentliche Ausfälle und zukünftige Optimierung des Verfahrens.

Abbildung 1. Reaktionsschema. Die radiochemische Synthese besteht aus der Markierung durch ¹⁹ F / ¹⁸ F-Austausch, gefolgt von einer palladiumkatalysierten Hydrierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Hydrierungssystem. Schema des Gerätes. Dieses Gerät basiert auf der Veröffentlichung von Yoswathananont et al. (Ref 13).

Abbildung 3. Schema des Synthesizer-integrierten fluidischen Prozessors (IFP) und Reagenzien. IFP enthält vier Reagenzgefäße, eine QMA-Patrone und eine Reaktor-Durchstechflasche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. UV- und RadioHPLC-Tracer für Zwischenprodukt. 3-fluor-4-nitropyridin-N-oxid hat eine charakteristische Absorption bei 313 nm.E.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. UV- und RadioHPLC-Tracer für Endprodukt. 3-fluor-4-aminoopyridin absorbiert bei 254 nm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Konzept	Mittler (n = 4)	SD	Bemerkungen
Anfängliche 18 F-Aktivität (mCi)	148,0	44,9	Beginn der Synthese
Vorläufermenge (μg)	50		Verwenden Sie 50 μl 1,0 mg / mL Lager
Aktivität in QMA (mCi)	3,0	1.7	Gemessen am Ende des Etikettierungsschrittes
Radiomarkierungsausbeute	29,7%	6,3%	Act_collection_vial ÷ (Act_collection_vial + Act_AluN)
Radiochemische Reinheit (HPLC-1)	> 98%		Von HPLC-1 QC
Spez. Handlung. Zwischenprodukt (mCi / μmol)	122.9	29.7	Von HPLC-1 mit Kalibrierkurve
Hydrierungsrückgewinnung (dc)	74%	9,0%	Für den Verfall korrigiert
HPLC-radiochemische Reinheit (HPLC-2)	90,7%	2,9%	Berechnet aus HPLC-2
Trocknungseffizienz	> 98%		Für den Verfall korrigiert
Filterwiederherstellung	93,5%	1,7%	Für den Verfall korrigiert
Dosisvolumen (ml)	3.3		Sammeln Sie Fraktionen mit höchster Radioaktivität
Spez. Handlung. Endprodukt (mCi / μmol)	75,5	30.0	Von HPLC-3 mit Kalibrierkurve
Syntheseeffizienz	8,5%	3,6%	Nicht-Zerfall korrigiert
Synthesezeit (min)	104.	11.2

Tabelle 1. Radiochemische Syntheseparameter

Allgemeine Probleme	Mögliche Gründe und Lösungen
[ 18 F] Fluorid wird nicht effizient aus dem QMA eluiert	· TBA-HCO 3 wurde nicht richtig vorbereitet. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration ausreichend ist.
	· Es gibt Lecks auf der TBA-HCO 3 Durchstechflasche. Achten Sie darauf, dass die Crimpdichtung fest sitzt und das Septum nicht vor dem Einbau auf dem IFP durchbohrt wird.
	· TBA-HCO 3 ist nicht in gutem Zustand. Bestellen Sie eine neue Charge.
Die Markierungsausbeute ist gering	· Es gibt Feuchtigkeit in der Vorläuferlösung. Trockener Vorläufer und Lösungsmittel.
	· Die Temperatur ist zu niedrig.
Reaktionslösung ist gelb	· Das Produkt zersetzt sich aufgrund der Basis. Verwenden Sie weniger TBA-HCO 3 .
	· Es gibt tOo viel Vorläufer. Verwenden Sie weniger Vorläufer.
	· Es gibt zu wenig Lösungsmittel für die Menge von 18 F - . Verwenden Sie mehr Lösungsmittel.
Zusätzliche Spitzen auf radioHPLC	· Nitro-Gruppe wird substituiert: reduzieren die Reaktionstemperatur oder verkürzen die Reaktionszeit.
Die Hydrierungsreaktion funktioniert nicht	· Katalysator ist nicht gut Verwenden Sie eine neue Patrone.
	· Der Durchfluss ist zu schnell und erlaubt keinen ausreichenden Kontakt zwischen Katalysator und Substrat. Abfluss verringern
	· Der Wasserstoffdruck ist zu niedrig. H 2 Druck erhöhen
Der Wasserstoffdruck steigt während des Verfahrens dramatisch an	· Die Patronenintegrität ist kompromittiert und die feste Unterstützung verstopft die Linien. Stoppen Sie den Fluss und schalten Sie das Gas ab. Lassen Sie Radioaktivität abklingen. Entfernen Sie die Katalysatorpatrone und spülen Sie das System aus. Setzen Sie einEw Patrone
Die Hydrierungsausbeute ist gering	· Zu viele Verunreinigungen, die um den Katalysator konkurrieren (MeCN, Oxalsäure). Verringerung der Menge an Verunreinigungen oder Erhöhung der Masse des Vorläufers (Warnung: Erhöhung der Vorläufermenge verringert die spezifische Aktivität).
Die Wiederherstellung der Radioaktivität aus dem Hydrierungsschritt ist gering	· Es gibt ein Leck im System. Auf Dichtheit prüfen und in die Wasserstoffleitung zurückspülen.
	· Die Verbindung entleert sich im Reaktor. Auswertung verschiedener Reaktionsbedingungen (Druck, Temperatur, Durchfluss etc. ).
Zu viel Radioaktivität geht während der Filtration verloren	· Den Filter vor dem Gebrauch benetzen.
	· Verwenden Sie Filter mit einem niedrigeren Totvolumen.
Die Endproduktspitze auf der HPLC sieht breit aus	· Zu viel Volumen injiziert. Injizieren Sie tieferOunt Spalte mit größerem Durchmesser verwenden.
	· Die Säule ist nicht gut konditioniert. Bedingung der Spalte für mindestens 30 Spaltenvolumina.
	· Der pH-Wert der mobilen Phase ist niedrig. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert ≥ 8 ist.
	· Die Säule ist nicht in gutem Zustand. Spalte ersetzen Verwenden Sie die Säule mit dem basischen pH-Wert.

Tabelle 2. Fehlerbehebung.

Diskussion

Die Vorbereitung von PET-Tracern erfordert eine effiziente Etikettierung mit minimalem Eingriff des Benutzers zur Minimierung der Strahlenbelastung ¹⁴ . Hier haben wir das erste halbautomatisierte Verfahren zur radiochemischen Synthese von [ ¹⁸ F] 3F4AP, einem PET-Tracer, der derzeit zur Bildgebung der Demyelinisierung untersucht wird, beschrieben. Diese halbautomatisierte Methode erzeugt den Radiotracer mit hoher Reinheit und ausreichender spezifischer Aktivität für Tierversuche. Bisherige Verfahren zur Synthese dieser Verbindung beruhten auf der manuellen Synthese ⁶ , was die Menge an radioaktivem Tracer, die produziert werden kann, signifikant begrenzt. Mit einer automatisierten Methode für die Synthese bietet auch mehr reproduzierbare Ausbeuten und macht es einfacher, das Verfahren in andere Laboratorien mit ähnlichen Geräten zu übertragen. Zukünftige Bemühungen, das Verfahren vollständig zu automatisieren, werden für die Produktion des Tracers in hohen Mengen für Studien bei großen Tieren oder Menschen maßgeblich sein.

Dieses Verfahren verwendet einen nukleophilen Austausch von ¹⁹ F für ¹⁸ F, um das Radioisotop in das interessierende Molekül zu integrieren. Die Vorteile dieser Reaktion sind, dass es schnell ist und fast ausschließlich das gewünschte Produkt produziert, ohne dass ein potentiell langwieriger Reinigungsschritt durchgeführt werden muss, um den Überschuss des Vorläufers zu entfernen. Eine Einschränkung der Verwendung von Fluorid-Austausch-Markierungsreaktionen, wie die hier verwendete, ist, dass aufgrund der anfänglichen Masse der kalten Verbindung die endgültige spezifische Aktivität, die als die Menge an Radioaktivität in mCi über die Menge der Verbindung in μmol definiert ist, begrenzt sein kann. Unter unseren Standardbedingungen, beginnend mit 100-200 mCi von ¹⁸ F ^- und 50 μg Vorläufer, beträgt die typische spezifische Aktivität am Ende der Synthese bis zu 100-200 mCi / μmol, was für präklinische PET-Bildgebungsstudien ausreichend erscheint . Trotzdem kann sich die spezifische Aktivität durch Erhöhung des Ausgangsbetrags für ¹⁸ F ^- während die Massenmenge niedrig gehalten wird. Es gab mehrere Berichte über die Herstellung von Radioliganden durch Fluoridaustausch mit hoher spezifischer Aktivität (1-3 Ci / μmol), beginnend mit hoher Aktivität und niedrigen Vorläufermengen ^{15 , 16} .

Wie bei allen radiochemischen Synthesen von PET-Tracern ist es entscheidend, schnell zu arbeiten, um den radioaktiven Zerfall zu minimieren. Es ist auch wichtig, die zeitliche Handhabung der radioaktiven Materialien zu minimieren, die richtige Abschirmung zu verwenden und den Abstand zwischen dem radioaktiven Material und dem Benutzer zu maximieren, um die Strahlenbelastung zu minimieren. Diese Aspekte sind besonders wichtig während der zweiten Hälfte des Protokolls (Reinigung und Qualitätskontrolle), in denen der Benutzer die Lösung manuell in die HPLC injizieren muss, die Fraktionen sammeln und das Endprodukt filtern.

Wie bei allen radiochemischen Synthesen von PET-Tracern ist es entscheidend, schnell zu arbeiten, um mRadioaktiven Zerfall einatmen. Es ist auch wichtig, die zeitliche Handhabung der radioaktiven Materialien zu minimieren, die richtige Abschirmung zu verwenden und den Abstand zwischen dem radioaktiven Material und dem Benutzer zu maximieren, um die Strahlenbelastung zu minimieren. Diese Aspekte sind besonders wichtig während der zweiten Hälfte des Protokolls (Hydrierung und Reinigung), in denen der Anwender die Lösung manuell in den Hydrierer einspritzen, die Fraktionen sammeln, den Trocknungsvorgang aufstellen, das Produkt in Puffer wieder auflösen und filtrieren muss. Während des Filterungsschrittes ist es leicht, eine große Menge an radioaktivem Material in den Wänden der Fläschchen zu verlieren. So ist es wichtig zu versuchen, die gesamte Flüssigkeit vor dem Filtern zu sammeln. Die Verwendung einer größeren Menge an Puffer, um sich aufzulösen, kann die Ausbeute an Erholung verbessern, aber seine Verwendung wird entmutigt, da es erforderlich ist, ein größeres Volumen auf die HPLC zu injizieren, wodurch der Peak erweitert und das Volumen der Enddosis erhöht wird.

Um ein Problem zu behebenNd optimieren die Prozedur ist wichtig, um die Ausbeuten der einzelnen Schritte zu verfolgen. Für die meisten Schritte erfolgt dies einfach durch Messung der Menge an Radioaktivität vor und nach jedem Schritt. Im Falle der Reaktion können die Ausbeuten durch Quantifizierung der HPLC-Peaks berechnet werden. Tabelle 1 im Ergebnisbereich zeigt die typischen Ausbeuten für jeden Schritt. Tabelle 2 unten listet viele der häufig angetroffenen Fehler mit möglichen Gründen für das Versagen auf und wie man sie korrigiert.

Schließlich ist, obwohl das hier vorgestellte Verfahren für die Synthese von [ ¹⁸ F] 3F4AP spezifisch ist, der allgemeine Arbeitsablauf und viele der einzelnen Schritte der Synthese anderer Verbindungen gemeinsam. In diesem Artikel haben wir auch die typischen QC-Tests auf jedem PET-Tracer durchgeführt.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyclotron produced [18F]fluoride	House supplied/Zevacor	IBA Cyclone 18	100-200 mCi
Integrated fluid processor for production FLT/FDG	ABX	K-2715SYN	Cassette used for nucleophilic substitution
Anhydrous acetonitrile	Janssen	36431-0010	Transfer under nitrogen
Methanol	Janssen	67-56-1
ultrapure water	house supplied		Millipore MilliQ system
TBA-HCO3	ABX	808.0000.6	abx.de
QMA	Waters	WAT023525	Quaternary methyl ammonium: Anion exchange solid phase extraction cartridge for trap and release of 18F- from the target water
Sodium bicarbonate	ABX	K-28XX.03	Prefilled 5 mL syringes
Alumina-N	Waters	WAT020510	Alumina-N solid phase extraction cartridge (for trapping unreacted 18F-)
3-fluoro-4-nitropyridine N-oxide	Synthonix	76954-0	Store in desicator. Precursor
3-fluoro-4-aminopyridine	Sigma Aldrich	704490-1G	Reference standard
Oxalic acid	Sigma Aldrich	75688-50G
Sodium phosphate monobasic	Fisher Scientific	S80191-1
Triethyl amine	Fisher Scientific	04885-1
Ethanol	Decon Labs	DSP-MD.43	USP
Final product vial	ABX	K28XX.04
Millex Filter Syringe	Millex	SLGVR04NL
10% Pd/C cartridge	Sigma Aldrich	THS-01111-12EA
11 mm vials + crimp seals	Fisher Scientific	03-250-618, 06-451-117, or equivalent
13 mm vials + crimp seals	Fisher Scientific	06-718-992, 06-718-643, or equivalent
HPLC vials	Fisher Scientific	03-391-16, 03-391-17, or equivalent
SEMIPREP C18 column	Agilent	990967-202
V-vials	Alltech
Syringes: 1, 3, 10 mL	Fisher Scientific	14-829-10D, 14-829-13Q, 14-829-18G, or equivalent
Compressed gases: N2, He, H2	Airgas	UHP N300, UHP HE300, UHP H300, or equivalent
TLC plates	Sigma Aldrich	Z193275, or equivalent
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Synthera automated synthesizer	IBA SA, Belgium, iba-worldwide.com	Synthera, 250.001	Automatic synthesis unit
In-house hydrogenator	See picture		See text description
Hot cells	Comecer		For manipulating radioactive materials
RadioTLC scanner	Eckert and Ziegler		For handling sterile materials
HPLC	Dionex	Ultimate 3000
Dose calibrator	Capintec	CRC15	Or equivalent
Gamma counter	Capintec, 7 Vreeland Road, Florham Park, NJ 07932	CRC 15, PET-CRC25, or equivalent	For measuring radioactivity
Personal dosimeters	Packard	Cobra II	For measuring gamma spectrum
Personal radiation badges and rings	Atlantic Nuclear	Rados Rad-60 Electronic Dosimeter, or equivalent
Rotavap + vacuum pump	Landauer
Lead pigs + syringe shields	Heidolph		Or equivalent
Geiger counter	Pinestar
Geiger counter	Ludlum	Model 3 + Pancake GM detector, 4801605, 47-1539, or equivalent