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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Synaptosomal Dopamin Aufnahme und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie dar experimentelle Analysetools, Dopamin Homöostase bei Mäusen durch die Beurteilung der Funktion der Dopamin-Transporter und Dopamin-Spiegel in striatalen Gewebe zu untersuchen, bzw.. Hier präsentieren wir Protokolle zur Messung Dopamin Gewebe Inhalt und die Funktionalität der Dopamin-Transporter zu beurteilen.

Zusammenfassung

Dopamin (DA) ist eine modulierende Neurotransmitter, die Steuerung der Motorik, Belohnung Prozesse und kognitive Funktion. Wertminderung (DAergic) dopaminergen Neurotransmission ist stark verbunden mit mehreren zentralen Nervensystems-assoziierten Erkrankungen wie Morbus Parkinson, Aufmerksamkeit-Defizit-Hyperaktivitäts-Störung und Drogensucht1,2 ,3,4. Abgrenzung von Krankheitsmechanismen, bei denen DA Ungleichgewicht hängt entscheidend von Tiermodellen, Aspekte der Krankheiten imitieren und somit Protokolle, die bestimmte Teile der DA Homöostase zu beurteilen sind wichtig, damit die neue Einblicke und mögliche therapeutische Ziele für diese Krankheiten.

Hier präsentieren wir zwei nützliche experimentelle Protokolle, die in Kombination bieten eine funktionale Auslesung des DAergic Systems bei Mäusen. Biochemische und funktionelle Parameter auf DA Homöostase werden durch Bewertung der DA Ebenen und Dopamin-Transporter (DAT) Funktionalität5gewonnen. Bei der Untersuchung von DA-System ist die Fähigkeit, zuverlässig endogenen DA von Erwachsenen Gehirn messen unerlässlich. Deshalb präsentieren wir Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ausführen auf Gehirngewebe von Mäusen zu ermitteln der DA. Wir führen das Experiment auf Gewebe aus dorsalen Striatum (dStr) und Nucleus Accumbens (NAc), aber die Methode ist auch geeignet für andere DA innerviert Hirnareale.

DAT ist essentiell für Reuptake von DA in die präsynaptischen Terminal, dadurch Steuerung der zeitlichen und räumlichen Aktivität von freigegebenen DA. Zu wissen, die Ebenen und die Funktionalität der DAT im Striatum ist von großer Bedeutung bei der Beurteilung DA Homöostase. Hier bieten wir ein Protokoll, das ermöglicht, gleichzeitig Informationen über Ebenen Oberfläche und Funktion mit einem synaptosomal6 DA Aufnahme Assay abzuleiten.

Aktuelle Methoden in Verbindung mit standard Immunoblotting Protokolle geben die Forscher mit entsprechenden Tools zur Charakterisierung des DAergic-Systems.

Einleitung

Dopamin (DA) ist eine modulierende Neurotransmitter für motor Verhalten, Belohnung und kognitive Funktion1,7,8,9von entscheidender Bedeutung. Ungleichgewichte in DA Homöostase sind in mehreren neuropsychiatrischen Erkrankungen wie Aufmerksamkeits-Defizit-Hyperaktivitäts-Störung, Drogensucht, Depressionen und Parkinson-Erkrankung1verwickelt. DA erscheint aus der präsynaptischen Neuron in den synaptischen Spalt, wo er bindet an und aktiviert Rezeptoren auf der Prä- und postsynaptischen Membran, dadurch weiter vermitteln das Signal. Das Niveau der DA in der Synapse nach Veröffentlichung räumlich und zeitlich gesteuert DAT3,10. Der Transporter Sequester DA aus dem extrazellulären Raum und trägt somit physiologische DA Level3,11. Genetischer Entfernung von DAT bei Mäusen verursacht einen Hyperdopaminergic Phänotyp gekennzeichnet durch erhöhte synaptische DA, Abbau der intrazellulären DA Pools und tief greifende Veränderungen im postsynaptischen DAergic Signalisierung10,12.

Hier zwei getrennte Protokolle werden vorgestellt, eine Methode zu messen DA Gewebe Inhalten und anderen zu beurteilen, die Funktionalität der DAT.-kombinierte mit der Oberfläche Biotinylierungen Assay von Gabriel Et Al.13 beschrieben diese beiden Methoden geben Auskunft über DA Inhalte und funktionalen Ebenen der DAT für eine gründliche Bewertung der DA Homöostase. Mit diesen Methoden kann DA Homöostase der verschiedenen transgenen Mäusen oder Krankheitsmodelle charakterisiert und beschrieben werden. Diese Werkzeuge wurden implementiert und optimiert und sind standard in unseren Labors. Aktuelle Tests dienten dazu, die Konsequenzen auf die DA Homöostase der Änderung der C-terminalen DAT14 oder mit dem Ausdruck Cre-Rekombinase unter die Tyrosin-Hydroxylase (TH) Veranstalter 5zu untersuchen.

Protokoll

die Richtlinien des dänischen Tier Experimente Inspectorate (Erlaubnis Zahl: 2017-15-0201-01160) folgte und Experimente durchgeführt, in einer voll AAALAC akkreditierten Einrichtung unter der Aufsicht von einem lokalen Tierschutz Ausschusses.

1. Synaptosomal Dopamin-Aufnahme (Methode 1)

Hinweis: dieses Protokoll ist für parallele Bewertung der beiden Gehirne, aber synaptosomal DA Aufnahme Experimente mit vier Gehirne in erfolgreich einsetzbar parallele.

  1. Röhren Vorbereitungen
    1. Label 48 1,5 mL Mikro-Zentrifuge pro Tabelle 1 (24 für jedes Gehirn). Verwenden Sie unterschiedliche Farben für die Röhren gehören zu jedem Gehirn um Verwechslungen zwischen den Proben zu vermeiden
    2. Label 51 funkeln Röhren #1-51.
    3. Ort-Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf Eis. Dies wird verwendet, um die Gehirne gekühlt zu halten.
    4. Schalten Sie die Zentrifuge zu 4 vorher abkühlen lassen ° C.
    5. Pre wiegen zwei Mikro-Zentrifuge-Rohre, um die genaue Gewebe Gewicht während der synaptosomal Vorbereitung (Abschnitt 2.6) bekommen.
    6. Vorbereiten Homogenisierung Puffer durch das Mischen von 4 mM HEPES und 0,32 M Saccharose. Den pH-Wert 7,4 einstellen und halten auf Ice
      Hinweis: Homogenisierung Puffer kann in Aliquote bei-20 ° C aufbewahrt und am Tag des Experiments aufgetaut.
    7. Vorbereiten-Aufnahme-Puffer durch die Kombination der folgenden: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 5 mM 1 mM Ascorbinsäure (0,194 g/L), 5 mM D-Glukose (0,991 g/L). PH auf 7,4 mit NaOH (führt zu einer Natriumkonzentration von ca. 130 mM) einstellen und halten auf Ice
      Hinweis: Für 2 Gehirne, bereiten Sie 1500 mL-Aufnahme-Puffer. Bereiten Sie Aufnahme-Puffer als einem 10-fach Stammlösung ohne Ascorbinsäure und Glukose gehalten bei 4 ° C. Make 1 x Arbeitslösung frisch am Tag, Ergänzung mit Ascorbinsäure und Glukose. PH mit NaOH auf 7,4 einstellen.
    8. -Prepare-Aufnahme-Puffer + Liganden durch die Kombination der folgenden: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 5 mM 1,2 mM CaC l2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM Ascorbinsäure (0,194 g/L), 5 mM D-Glukose (0,991 g/L), 1 μM Pargyline, 100 nM Desipramin, 10 nM Brenzcatechins-O-Methyl-Transferase (COMT)-Hemmer. Auf pH 7.4 mit NaOH einstellen und halten Sie auf Ice
      Hinweis: Verwenden Sie 50 mL-Aufnahme-Puffer und fügen Sie Liganden hinzu. Pargyline wird hinzugefügt, um zu verhindern, Abbau von DA durch Oxidation durch Monoamin-Oxidase (MAO). COMT-Hemmer (RO-41-0960) wird hinzugefügt, um Abbau von DA (Katecholamine im Allgemeinen) durch COMT zu verhindern. Desipramin wird hinzugefügt, Aufnahme durch die Noradrenalin und Serotonin-Transporter zu hemmen, und damit die Aufnahme Ergebnisse spezifische für DAT
    9. -Prepare-Aufnahme-Puffer + Ligand + Kokain durch die Kombination der folgenden: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM Ascorbinsäure (0,194 g/L), 5 mM D-Glukose (0,991 g/L), 5 mM 1 μM Pargyline 100 nM Desipramin , 10 nM COMT-Hemmer, 500 μM Kokain. PH auf 7,4 mit NaOH einstellen und halten auf Ice
      Hinweis: Verwenden Sie 7 mL-Aufnahme-Puffer + Ligand und fügen Sie Kokain hinzu. Kokain wird hinzugefügt, erhalten eine Hintergrundmessung unspezifische DA Aufnahme subtrahieren aus den Daten verlassen nur die DAT-spezifische Aufnahme (da SERT und NET durch Desipramin gehemmt werden, wie oben beschrieben). Alternativ kann ein sehr potenter und spezifische DAT Inhibitor GBR-12935, stattdessen verwendet werden.
      Wichtig: Halten Sie alles auf Eis von nun an .
  2. Synaptosomal Vorbereitung
    1. Opfern, eine Maus zu einem Zeitpunkt durch zervikale Dislokation und Enthauptung.
    2. Schneiden Sie die Haut mit einer Schere zu offenbaren den Schädel und überschüssige Gewebe Posterior der Schädel links von Enthauptung abgeschnitten. Schneiden Sie den Schädel mit kleinen geraden Schere entlang die Sutura Sagittalis anterior wie möglich landen.
    3. Legen Sie die beiden Scheren-Tipps in jedes Auge der Maus und schneiden durch Schädel, den Rest des Schädels und der intakten Gehirn zu entfernen. Schnell entfernen Sie das Gehirn zu und legen Sie sie in eiskaltem PBS. Dies wird es kalt zu halten, während die zweite Gehirn seziert.
    4. Mit einer Matrix Gehirn sezieren ein 3 mm koronalen Stück des Striatums (anterior-Posterior: +1,5 mm bis-1,50 mm) gefolgt von feiner Dissektion mit einem Puncher. Siehe Abbildung 1 für Punsch Bereich.
    5. Halten das Gewebe auf dem Eis zu allen Zeiten voran.
    6. Übertragen die Gewebe auf eine 1,5 mL Mikro-Zentrifugenröhrchen zum Wiegen von.
      Hinweis: Das Gewicht wird in Schritt 1.2.14 verwendet werden.
    7. Wiederholen Schritt 1.2.1-1.2.6 für das zweite Gehirn.
    8. Nach Gewicht für beide Gehirne erteilt worden ist, das Gewebe auf eine Homogenisierung Glas mit 1 mL eiskaltes Homogenisierung Puffer übertragen.
    9. Homogenisieren des Gewebes mit einem motor angetriebenen Stößel bei 800 u/min, 10 sogar Anschläge.
      Hinweis: Einen Streich gleich eins rauf und runter handeln, des ersten Strichs sollte ca. 5 s, die folgenden 3-4 S. Homogenisierung in isotonischen Medium wichtig ist, zu verhindern, Platzen der Synaptosomes 6. Mit entsprechenden Kraft und isotonischen Medium ermöglicht es den präsynaptischen Terminals zu versiegeln einschließenden Zytoplasma, synaptischen Vesikel, Mitochondrien und Cytoskelett 15.
    10. Übertragen die Homogenat auf 1,5 mL-Mikro-Zentrifugenröhrchen und sammeln die restlichen Homogenat aus dem Glas Homogenisierung durch Spülen mit 0,5 mL zusätzliche Homogenisierung Puffer.
    11. Halten die Probe auf Eis, während Gewebe aus dem anderen Gehirn homogenisiert wird. Laufen die beiden Gehirne parallel in Schritten 1.2.12-1.2.13.
    12. Pellet-die Kerne und Zellen Ablagerungen durch Zentrifugieren (1.000 x g, 10 min, 4° C).
    13. Transfer den überstand (S1) (mit Zellmembranen und Zytoplasma) zum neuen 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 16.000 x g für 20 min bei 4 ° c
    14. (Mit Zytoplasma) überstand verwerfen und Aufschwemmen Pellet (P2) (mit groben Synaptosomes) in 40 μl Homogenisierung Puffer / mg Gewebe (bezogen auf das Gewicht bezogen im Schritt 1.2.6). Sanft den rohen synaptosomal Bruch mit einer Pipette p1000 aufzuwirbeln, da zuviel Kraft der Synaptosomes brechen wird.
      Hinweis: Es ist wichtig, am Ende mit mindestens 280 μL. Wenn dies nicht der Fall ist, verdünnen mit mehr als 40 μl pro mg wird notwendig sein. Schritte 1.2.1-1.2.13 muss so schnell wie möglich durchgeführt werden, und alles, was auf Eis gehalten werden muss. Sobald die grobe Synaptosomes in Homogenisierung Puffer Nukleinsäuretablette wurden haben sie sind recht stabil, solange sie am Eis 6 , 15 , 16 gehalten werden.

2. Aufnahme-Experiment

Liganden
  1. Hinzufügen 440 μl Aufnahme-Puffer + Kokain in die dafür vorgesehenen 12 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und 440 μl-Aufnahme-Puffer + Liganden an die verbleibenden 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen (siehe Tabelle 1 für das Layout) 36.
    Hinweis: Entfernen sie aus Eis 15 min vor Beginn des Experiments zu auf Raumtemperatur bringen, aber halten Sie auf Eis, bis dann, Inhibitoren zu sparen.
  2. Prepare Sättigungskurve (Dopamin (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H Dopamin) (91.1 Ci/Mmol) bei verschiedenen Endkonzentrationen (0.031, 0,0625 0,125, 0,25, 0,5 und 1,0 μM)).
    1. Label sechs 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen als 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 und 0,31.
    2. Fügen Sie 750 μl Aufnahme Puffer + Liganden an 5 Mikrozentrifugenröhrchen mit der niedrigsten Nummer.
    3. Fügen 1,455.4 μL Aufnahme Puffer + Liganden, 14,6 μL Dopamin (1 mM), 30 µl 3-H Dopamin (11 μM) am Rohr gekennzeichnet 10.
    4. Transfer 750 μl aus der Tube gekennzeichnet 10 in das Röhrchen 5 gekennzeichnet. Gut mischen und 750 μl von dieser Röhre auf 2,5 Rohr übertragen. Wiederholen Sie diese Verdünnung mit den restlichen Rohren.
  3. Vorspülen Mikrofaser Glasfilter mit 4 mL-Aufnahme-Puffer nach, indem sie auf eine 12 gut Filterkorb.
  4. Fügen Sie 10 μL der synaptosomal Membran Aussetzung zu den ersten 24 1,5 mL Mikro-Zentrifuge Röhren (siehe Tabelle 1 für das Layout) mit 440 μl Puffer. Vortex sorgfältig und spin-down kurz um sicherzustellen, dass die Synaptosomes im Puffer untergetaucht sind. Lassen Sie 37 o C für 10 min.
    Hinweis: Es ist wichtig, genau auf die Zeiten während der Aufnahme-Experiment für fairen Vergleich zwischen Gehirn zu sein. Verwenden Sie eine Stoppuhr für Präzision.
  5. Fügen Sie 50 μL Dopamin der Konzentration 10 und 5 μM (Abschnitt 2.2), die ersten zwei Spalten und lassen bei 37 o C für 5 min mit schütteln. Halten Sie nach genau 5 min die Reaktion durch Zugabe von 1 mL eiskaltes Aufnahme-Puffer. Machen Sie dasselbe mit Konzentration 2,5 und 1,25 μM (Abschnitt 2.2) und dann mit Konzentration 0,62 und 0,31 μM.
  6. Proben, die vorher gespült Mikrofaser-Filter hinzufügen und mit 5 x 4 mL eiskaltes Aufnahme-Puffer waschen. Wenn die ersten 12 Proben wurden hinzugefügt, um die Filter, die Filter zu funkeln Rohre bewegen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem nächsten 12 Proben.
  7. Wiederholen Sie Schritt 2.4-2.6 für das nächste Gehirn.
  8. Vorbereiten 3 Max-zählen Rohre indem ein Mikrofaser-Filter in der Unterseite des funkeln Röhren 49-51 und Hinzufügen von 25 µL der maximale Dopamin-Konzentration an der Spitze (10 μM).
  9. Lassen Sie alle 51 funkeln Röhren in einer Dampfhaube für 1 h.
  10. Add 3 mL funkeln Flüssigkeit jedes funkeln Tube und schütteln kräftig auf einen Shaker für 1 h.
  11. Graf [3 H]-DA in einem Beta-Zähler für 1 min.
    1. , Öffnen Sie das Programm und wählen Sie: Label: h-3, Platte/Filter: 4 mL Fläschchen, 4 x 6, Assay Typ: Normal und Zählzeit: 1 min.
      Hinweis: Dieser Schritt kann am Folgetag wenn bequemer durchgeführt werden. Proben mit Alufolie bedeckt, über Nacht zu verlassen.
  12. Proteinbestimmung
    1. verwenden ein Standardpaket BCA Protein Assay Proteinkonzentrationen von Synaptosomes für die Anpassung von Zählungen pro min (cpm) Fmol/min/μg und für den richtigen Vergleich der Aufnahme bestimmen zwischen beiden Stichproben.

3. Analyse der Daten

  1. Verwendung der Daten aus der Aufnahme Experiment zu einer Sättigung Kurve für jede Gruppe und berechnen Sie die Rate der Reaktion (V max) und die Michaelis Menten-Konstante (K M).
    Hinweis: Die K-M-Wert spiegelt die Substratkonzentration erforderlich, um die Hälfte der V-max zu erreichen. Entsprechend gibt V max direkt die Funktion des DAT-Version (maximale Aufnahme Kapazität), richtet sich nach der Anzahl der DAT auf der Oberfläche und wie seine Aktivität moduliert werden kann durch posttranslationale Modifikationen und/oder interagierenden Proteine sowie auf Änderungen in Ionen-Gradienten. Der K-M-Wert ist ein indirektes Maß der Substrat-Affinität für die Transporter, die vor allem auch kann durch posttranslationale Modifikationen und/oder interagierenden Proteine moduliert werden. Um voll funktionale Änderungen zu beurteilen ist es daher wichtig, direkt durch zum Beispiel eine Oberfläche Biotinylierungen Assay Oberflächenexpression ermitteln. Eine Beschreibung des Dopamin Reuptake und eine Ausarbeitung über Bedeutung der K-M und V max Werte wurden überprüft, Schmitz Et Al. 17.

4. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (Methode 2)

  1. Gehirn Dissektion
    1. Label und wiegen Mikrozentrifugenröhrchen; eine pro Region per Mausklick.
    2. Opfer eine Maus zu einem Zeitpunkt durch zervikale Dislokation und Enthauptung. Schnell das Gehirn zu entfernen, wie in Kapitel 1.2 beschrieben. Führen Sie weitere Dissektion sofort.
    3. Mit einer Gehirn-Matrix, eine 3 mm koronalen Scheibe des Striatums gefolgt von feiner bilateralen Dissektion der NAK und dStr mit einem Puncher sezieren. Siehe Abbildung 3 für Punsch Bereich.
    4. Das Gewebe auf 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und schnell auf Trockeneis. Wiegen Sie das Gewebe und setzen Sie es sofort wieder auf das Trockeneis.
      Hinweis: Das Gewebe Gewicht ist wichtig für die Konzentration Berechnung später.
      5. Wiederholen Sie die Schritte
    5. 4.1.1-4.1.4 mit der nächsten Maus.
      Hinweis: Legen Sie das Gewebe auf 80 o C bis Weiterverarbeitung oder gehen Sie sofort zum Gewebe Verarbeitung.

5. Gewebe-Vorbereitung

  1. einschalten Zentrifuge bis 4 ° C Vorkühlen lassen
  2. bereiten Sie die Homogenisierung-Lösung (0,1 N Perchlorsäure (HClO 4)) und halten Sie auf Eis.
  3. Using Homogenisierung Lösung, bereiten Sie einen frisch 0.1 Pmol/μL Dopamin-Standard aus einem 1 mM-Stammlösung (10.000 X Verdünnung).
    Hinweis: Der Stammlösung wird vorbereitet durch Auflösen von Dopamin im Homogenisierung Puffer Lager Konzentration von 1 mM, was etwa einen Monat lang bei 20 ° C gehalten werden kann. Wenn andere Bereiche des Gehirns von Interesse sind, Konzentration des Standards müssen geändert werden, da andere Hirnareale einschließlich prefrontral Kortex, Hippocampus, Substantia Nigra und ventralen Haubengebiet besitzen bis zu 100 mal weniger DA im Vergleich zum Striatum.
  4. Jede Probe (d.h. NAc und dStr Gewebe, Abschnitt 4.1) 500 μL Homogenisierung Lösung hinzu und Proben mit einer Ultra-Homogenisator auf Hochtouren für ca. 30 S. halten während der Homogenisierung die Probe im Eiswasser zu homogenisieren. Zwischen jeder Probe ultra Homogenisator mit Wasser zu reinigen (mit voller Geschwindigkeit für 30 s).
  5. Zentrifugieren Sie Proben für 30 min bei 4 ° C, 14.000 x g.
  6. Transfer ca. 200 μl Probe zu einem Glas 0,22 μm-Filter (1 cm Durchmesser) mit einer 1 mL Kunststoffspritze.
    Hinweis: Die Verwendung von Glasfilter ist nicht wichtig, solange die gewählte Filter 0,22 μm, hochmolekularen Substanzen zu entfernen sind.
  7. Proben von elektrochemischen Detektion (EG) analysieren-HPLC Methode 18 wie in Abschnitt 6 beschrieben.

6. High Performance Liquid Chromatography Analyse

  1. bereiten die folgende Lösung für die mobile Phase: Natriumacetat 55 mM, Octanesulfonic Säure 1 mM, Na 2 EDTA 0,1 mM, Acetonitril 8 % Essigsäure 0,1 M, pH = 3.2.
    Hinweis: Stellen Sie den pH-Wert mit 0,1 M Essigsäure. Es ist wichtig, genauer gesagt mit dem pH. Die Lösung sollte Degasse sein.d durch die Online-Degasser (integrierter Bestandteil der HPLC-Anlage). 2 L der mobilen Phase zu machen und etwa einmal im Monat zu ändern (ändern Sie es, wenn der Lärm bemerkbar wird). Aufgrund der schwankenden dauert es ca. 24 h nach dem Ändern der mobilen Phase anpassen.
  2. Aufbau des Detektors:
    1. Satz Volt Ausgang für 700 mV und Temperatur 32 ° c auf den Detektor Ofen; Dies ist sehr wichtig. Machen Sie eine Angebot-Programm über das Online-Handbuch. Siehe das Handbuch für weitere Details). Hinzufügen des Zeitprogramms gem. Tabelle 2.
      Hinweis: In dieser Studie soll das Programm sich automatisch die aktuelle am Set Retentionszeiten der HPLC auf den optimalen Strom zu halten und die Gipfeln der das Chromatogramm zu halten, da wie möglich, aber immer noch in Sichtweite erweitert ändern. Dies wurde optimiert für striatale Gehirn Lysates von Mäusen.
  3. Wenn der Detektor das Programm hinzugefügt wurde, machen eine 3-Punkt-Eichkurve, dreimal durch die Injektion des Standards (5, 10 und 15 μl).
    Hinweis: Standard (10 μl (10 μL x 0.1 Pmol/μl = 1 Pmol DA)) sollte jeden zehnten Muster und Proben auf die nächste Standard kalibriert injiziert werden. Feinabstimmung des Systems dem vor durch Anpassung des 3-Punkt-Standards, und überprüft, ob das Chromatogramm innerhalb des erwarteten Bereichs herauskommt. Bei erheblichen Lärm beobachtet wird, ändern Sie die mobile Phase. Wenn ein Peak ist höher als 990 mV dann wieder injizieren der Probe in einer geringeren Lautstärke oder machen ein neues Sortiment-Programm und eine neue standard-Kurve. Die Nachweisgrenze wird als 3-Mal den Rauschwert in mV zu den niedrigsten Spitzenwert injiziert für jeden Standard gemessen (NA, DOPAC, DA 5-HIES, HVA, 3-MT und 5-HT).
    1. Set-up System durch Öffnen der LC-Lösung und Analyse 1; Diese beginnt in den Online-Modus zu aktivieren. Geben Sie Benutzer-ID und Kennwort, und klicken Sie auf ok. LC-Lösung zum Herstellen einer Instrumente warten. Gehen Sie auf die Batchtabelle und Dateninformationen eingeben (z.B., Probentyp: für Proben und std für standard, Analysetyp unbekannt: es QT, Inj Volumen: 10, ISTD Amt: Level 1 Con). Datei speichern (gehen Sie zu Datei - > speichern Batch-Datei als - > speichern).
    2. Machen das System durch drücken die ersten Probe injizieren ' Batch starten '. Dadurch wird die Injektion von 10 μl Probe durch den Autosampler mit einem Lösungsmittel Entbindungs-Modul.
      Hinweis: Verwenden Sie eine Pumpenförderstrom 0,15 mL/min und einer C18-Spalte mit Umkehr-Phase. Hier wurde ein amperometrischen Detektor für elektrochemische Detektion verwendet. Die gläsernen Kohlenstoffelektrode sollte auf 0,8 V mit einer Ag/AgCl-Referenzelektrode festgelegt werden. Um Dopamin zu bestimmen, verwenden Sie Chromatographie 3 µ ODS (3) C18 (DA 2 mm x 100 mm, Partikel Größe 3 µm), chromatographische Trennung zu erreichen.
    3. Auszug der aufgezeichneten und berechnete Peakflächen.
      1. Go, Datenerfassung, das Chromatogramm zu folgen, wenn die Proben beendet haben. Weiter zur post laufen Analyse - Lc > wählte den Namen der Datei (das Chromatogramm wird geöffnet) - > klicken Sie auf Ansicht. Auf der manuellen Integration-Leiste hinzufügen alle Gipfel integriert werden - > zum Datenreport und lesen ausdrucken.
        Hinweis: Hier die LC-Solution-Software wurde verwendet für Daten-Analyse und Systemsteuerung.
  4. Aus der Peakflächen, berechnen Sie die Konzentration von Dopamin in einer Stichprobe wie folgt mithilfe der bekannten Konzentration des Standards:
    1. die Peakfläche des Standards (entspricht 1 Pmol) verwenden, um Faktor A. erwerben
      figure-protocol-19114
    2. verwenden Faktor A, um die Konzentration der Proben erhalten.
      Konzentration der Probe (in Pmol pro 10 μL) = Faktor A × Peakfläche der Probe
    3. diese Formel verwenden, um die Probenkonzentration in ng erhalten.
      Probe Konzentration Pmol / 10 µL X 500 µL x MW von Dopamin = Probenkonzentration in ng
      Probe Konzentration (in ng) = Probenkonzentration (in Pmol pro 10 μL) x 500 μL x MW von Dopamin
    4. verwenden, die Probenkonzentration in ng um t er Probe Konzentration in Pg/g Gewebe (Probe Konzentration in Pg / g Gewebe = Pg/g Gewebe).

Ergebnisse

Aktuelle DA Aufnahme Protokoll (Abbildung 1) beinhaltet alle notwendigen Schritte, um die Funktionalität der DAT in Synaptosomes von Mäusen zu beurteilen. Unsere repräsentativen Daten DA Aufnahme Methode (Abbildung 2) zeigt eine Sättigungskurve mit unbereinigten Daten (Abb. 2 b) und Daten (Abbildung 2A). Der Sättigungskurve zeigt Aufnahme von Wildtyp-Mäusen. In der...

Diskussion

Dieses Manuskript beschreibt nützliche experimentelle Protokolle um DA Homöostase in jeder Maus-Modell der Wahl abzugrenzen. Wir bieten ausführliche Protokolle für Messhöhen DA im Gehirngewebe von Mäusen mit HPLC und synaptosomal DA Aufnahme um zu beurteilen, funktionale DA Transport durch DAT. Verfahren, Protokolle und Grenzwerte für die HPLC-Experiment und synaptosomal DA Aufnahme Assay werden unten ausgearbeitet.

Die synaptosomal Aufnahme Protokoll bieten nützliche Einblicke in die ...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die UCPH 2016 Program Of Excellence (UG, A.R, k.j.), die Lundbeck Foundation (m.r.) die Lundbeck-Stiftung Zentrum für Biomembranen in Nanomedizin (UG), die nationale Institute der Gesundheit Stipendien P01 DA 12408 (UG), die dänische Rat für unabhängige Forschung - medizinische Wissenschaften (UG).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
COMT inhibitorSigma Aldrich, GermanyRO-41-0960For synaptosomal DA uptake protocol
[3H]-DopaminePerkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USANET67-3001MCFor synaptosomal DA uptake protocol
Glass microfiber filtersGF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire1822-024For synaptosomal DA uptake protocol
HiSafe Scintillation fluidPerkin Elmer1200-437For synaptosomal DA uptake protocol
MicroBeta2Perkin ElmerFor synaptosomal DA uptake protocol
BCA Protein Assay kitThermo Scientific Pierce23225For synaptosomal DA uptake protocol
HEPESSigma Life ScienceH3375For synaptosomal DA uptake protocol
SucroseSigma Life ScienceS7903For synaptosomal DA uptake protocol
NaClSigma Life ScienceS3014For synaptosomal DA uptake protocol
KClSigma Life ScienceP9541For synaptosomal DA uptake protocol
CaCl2Merck KGaA10043-52-4For synaptosomal DA uptake protocol
MgSO4Sigma Life Science63065For synaptosomal DA uptake protocol
Ascorbic AcidSigma Life ScienceA0278For synaptosomal DA uptake protocol
D-GlucoseSigma Life ScienceG7021For synaptosomal DA uptake protocol
PargylineSigma AldrichP-8013For synaptosomal DA uptake protocol
DesipramineSigma AldrichD3900For synaptosomal DA uptake protocol
DopamineSigma Life ScienceH8502For synaptosomal DA uptake protocol
CocaineSigma Life ScienceC5776For synaptosomal DA uptake protocol
Brain matrixASI instrumentsRBM2000CFor synaptosomal DA uptake protocol
Cafano mechanical teflon disrupterBuch & HolmDiscontinuedFor synaptosomal DA uptake protocol (homogenization)
Antec Decade (Amperometric detector)Antec, Leiden, The NetherlandsDiscontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176For HPLC protocol
Avantec 0.22 μm glass filterFrisenette ApS, Denmark13CP020ASFor HPLC protocol
Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, GermanyPart Number:00A-3300-E0For HPLC protocol
LC solution softwareShimadzuLabSolutions Series WorkstationFor HPLC protocol
Perchlor acid 0.1MFluka Analytical35418-500mlFor HPLC protocol (Tissue preparation)
EDTASigmaE5134-50gFor HPLC protocol
NatriumdihydrogenphospharBie&Berntsen1.06346 1000gFor HPLC protocol
Sodium 1-octanesulfonate monohydrateAldrich74885 -10gFor HPLC protocol
Acetonitrile, isocratic HPLC gradeScharlauAC03402500For HPLC protocol
Filtre 0.22umFrisenette ApS, DenmarkAvantec 13CP020ASFor HPLC protocol (Tissue preparation)
ortho-Phosphoric acid 85%Merck1.00563. 1000mlFor HPLC protocol
ElectrodeAntec, Leiden, The NetherlandsAN1161300For HPLC protocol (see manual online)
Detector program on DECADE II electrochemical detectorAntec, Leiden, The NetherlandsLite™ Electrochemical Detector type 175 and 176For HPLC protocol

Referenzen

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  3. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
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