JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Synaptosomal dopamin alımı ve yüksek performanslı sıvı Kromatografi analiz temsil deneysel araçları tarafından değerlendirilmesi dopamin taşıyıcı işlevi ve striatal dokusunda dopamin düzeyleri dopamin homeostazı farelerde araştırmak için anılan sıraya göre. Burada protokolleri dopamin doku içeriği ölçmek ve dopamin taşıyıcı işlevselliğini değerlendirmek için mevcut.

Özet

Dopamin (DA) bir düzenleyici nörotransmitter kontrol motor aktivite, ödül süreçleri ve bilişsel işlev var. Dopaminerjik (DAergic) neurotransmission bozulma şiddetle Parkinson hastalığı, dikkat eksikliği hiperaktivite bozukluğu ve uyuşturucu bağımlılığı1,2 gibi merkezi sinir sistemi ile ilişkili çeşitli hastalıklarla ilişkilidir ,3,4. Hastalık mekanizmaları DA dengesizlik içeren operasyona eleştirel yönleri hastalıkları taklit etmek için hayvan modellerinde bağımlı, ve böylece DA homeostazı belirli bölümlerini değerlendirmek protokolleri roman yorumlara ve tedavi mümkün sağlamak önemlidir Bu hastalıklar için hedefler.

Burada, o zaman birlikte iki yararlı deneysel protokol mevcut farelerde DAergic sisteminin fonksiyonel bir okuma sağlar. Biyokimyasal ve fonksiyonel parametrelere DA homeostazı DA düzeyleri ve dopamin taşıyıcı (DAT) işlevselliği5değerlendirilmesi ile elde edilir. Ne zaman DA sistemi araştıran, güvenilir bir şekilde endojen DA--dan yetişkin beyin düzeylerini ölçmek için temel yeteneğidir. Bu nedenle, biz mevcut yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) gerçekleştirmek nasıl beyin dokusunda da düzeylerini belirlemek için fare Dorsal striatum (dStr) ve nucleus accumbens (NAc) doku üzerinde deney gerçekleştirmek, ama yöntemi Ayrıca diğer DA innervated beyin bölgesi için uygun mu.

DAT DA geri presynaptic terminal içine Alım için gerekli böylece serbest bırakmak da zamansal ve mekansal etkinliği denetleme Düzeyleri ve DAT işlevselliğini striatum içinde bilerek büyük DA homeostazı değerlendirirken önemlidir. Burada, aynı anda yüzey düzeyleri ve işlev bir synaptosomal6 DA alımı tahlil kullanarak bilgi anlamak için izin veren bir protokol sağlar.

Geçerli yöntemleri standart immunoblotting iletişim kuralları ile kombine DAergic sistemi karakterize etmek için araştırmacı ile ilgili araçlar sağlar.

Giriş

Dopamin (DA) düzenleyici nörotransmitter motor davranış, ödül ve bilişsel işlev1,7,8,9için kritik olduğunu. Dengesizlikler DA Homeostazı, dikkat eksikliği hiperaktivite bozukluğu, uyuşturucu bağımlılığı, depresyon ve Parkinson hastalığı1gibi birkaç nöropsikiyatrik hastalıkların karıştığı. DA presynaptic nöron böylece daha fazla sinyal taşıma nerede bağlar ve tarih öncesi ve postsinaptik membran reseptörleri aktive, sinaptik yarık serbest bırakılır. Synapse yayımlanmasından sonra DA kademede dağınık şekilde ve geçici DAT3,10tarafından kontrol edilir. Taşıyıcı DA ekstrasellüler uzaydan tüketiyor ve böylece fizyolojik DA düzeyleri3,11ayakta tutan. DAT genetik kaldırılması farelerde yükseltilmiş sinaptik DA düzeyleri tarafından karakterize bir hyperdopaminergic fenotip hücre içi DA havuzları ve postsinaptik DAergic10,12sinyal derin değişiklikler tükenmesi neden olur.

Burada, iki ayrı protokol sundu, ölçü birimi DA doku içerik ve Gabriel vd.13 tarafından açıklanan yüzey biotinylation tahlil ile buluşman kombine işlevselliğini değerlendirmek için başka bir yöntem bu iki yöntem DA bilgileri DAT içerik ve işlevsel düzeyleri DA homeostazı ayrıntılı bir değerlendirme için. Bu yöntemler ile DA homeostazı çeşitli transgenik fareler veya hastalık modelleri ile karakterize ve açıklanan. Bu araçlar uygulanan ve en iyi duruma getirilmiş ve laboratuarlarımızda standart kullanılmaktadır. Geçerli deneyleri sonuçları C-terminal DAT14 değiştirme veya Cre recombinase tirozin hidroksilaz (TH) organizatörü 5altında ifade DA homeostazı üzerinde araştırmak için hizmet etmişlerdir.

Protokol

Danimarkalı hayvan deney Müfettişliği yönergeleri (izni numarası: 2017-15-0201-01160) takip etti ve bir tam akredite AAALAC tesis yerel hayvan refahı gözetiminde yapılan deneyler Komitesi.

1. synaptosomal dopamin alımı (yöntem 1)

Not: Bu protokol iki beyin paralel değerlendirilmesi için ama başarılı bir şekilde synaptosomal DA alımı deneyler ile dört beyinlerinde gerçekleştirmek için kullanılabilir paralel.

  1. Başına Tablo 1 (24 her beyin için) hazırlıklar
    1. Etiket 48 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri. Örnekler arasındaki karışıklığı önlemek için her beyne ait tüpler için farklı renkler kullanın
    2. Etiket 51 mercek tüpler #1-51.
    3. Yer fosfat arabelleğe alınmış serum (PBS) buz üzerinde. Bu beyin soğuk tutmak için kullanılacaktır.
    4. 4'e önceden soğutmak için izin vermek için santrifüj açmak ° C.
    5. Synaptosomal hazırlık (Bölüm 2.6) sırasında tam doku kilo almak için iki mikro-santrifüj tüpleri önceden tartmak.
      6. 4 mM HEPES ve 0.32 M Sükroz karıştırma tarafından
    6. hazırla homojenizasyon arabellek. PH 7.4 için ayarlamak ve buz üzerinde tutmak
      Not: Homojenizasyon arabellek olabilir aliquots-20 ° C'de muhafaza ve denemenin gün çözdürülen.
    7. Hazırlama Alım arabelleği aşağıdakileri birleştirerek: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM askorbik asit (0.194 g/M), 5 mM D-glikoz (0.991 g/L). PH 7.4 NaOH (sodyum konsantrasyonu yaklaşık 130 mm yol açar) ile için ayarlamak ve buz üzerinde tutmak
      Not: 1500 mL alımını arabellek 2 beyin için hazır olun. 10 x askorbik asit ve 4'te sürekli glukoz olmadan hisse senedi çözüm olarak Alım arabelleği hazırlamak askorbik asit ve glukoz ilave ° C. olun 1 x çalışan çözüm gününde taze. NaOH ile pH 7.4 için ayarlamak.
    8. Hazırlama alımını tampon + ligand aşağıdaki birleştirerek: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaC l2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM askorbik asit (0.194 g/M), 5 mM D-glikoz (0.991 g/L), 1 mikron pargyline, 100 nM desipramin, 10 nM Katekol-O-metil-transferaz (COMT) inhibitörü. PH 7.4 NaOH ile uyum ve buz üzerinde tutmak
      Not: 50 mL alımını arabellek kullanın ve ligand ekleyin. Pargyline, oksidasyon monoamin oksidaz (MAO) aracılığıyla DA bozulması önlemeye yardımcı olmak için eklenir. COMT inhibitörü (RO-41-0960) DA (genel olarak katekolaminler) aracılığıyla COMT bozulma önlemek için eklenir. Desipramin norepinefrin ve serotonin taşıyıcıları aracılığıyla alımını inhibe ve böylece alımı sonuçları buluşman için belirli yapmak eklenir
    9. Hazırlama alımını tampon + ligand + aşağıdakileri birleştirerek kokain: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM askorbik asit (0.194 g/L) 5 mM D-glikoz (0.991 g/L), 1 mikron pargyline, 100 nM desipramin , 10 nM COMT inhibitörü, 500 mikron kokain. PH 7.4 NaOH ile için ayarlamak ve buz üzerinde tutmak
      Not: 7 mL alımını tampon + ligand kullanıp kokain ekleyebilirsiniz. Kokain (SERT ve NET desipramin tarafından yukarıda açıklandığı gibi inhibe beri) sadece DAT özgü alımını bırakarak bir arka plan ölçüm verileri, çıkarmak için non-spesifik DA Alım elde etmek için eklenir. Alternatif olarak, son derece güçlü ve belirli DAT inhibitörü GBR-12935, kullanılabilir yerine.
      Önemli: buzda şu andan . her şeyi tutmak
  2. Synaptosomal hazırlık
    1. servikal çıkması ve işten çıkarma tarafından bir defada tek bir fare kurban.
    2. Kafatası açığa vurmak ve işten çıkarma kafatası soldan herhangi bir aşırı doku arka kesmek için makas kullanarak deriyi kesme. Kafatası anteriorly mümkün olduğu kadar biten sutura sagittalis boyunca küçük düz makasla kes.
    3. İki makas ipuçları fare her gözlerinin içine yerleştirin ve kafatası ve bozulmamış beyin kısmı kaldırmak için kafatasını kesti. Hızla beyin çıkarın ve buz gibi PBS yerleştirin. Bu soğuk tutacak, ikinci beyin disseke.
    4. Bir beyin matrisi kullanarak teşrih striatum 3 mm koronal dilim (ön-arka: +1.5 mm den-1.5 mm) bir zımba ile ince diseksiyon izledi. Yumruk alan için bkz: şekil 1.
    5. Doku buz üzerinde her zaman ilerlemeye de devam.
    6. Tartmak için 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü doku transferi.
      Not: Bu ağırlık 1.2.14 adımda kullanılan.
    7. Tekrarlama adım 1.2.1-1.2.6 ikinci beyin için.
    8. Ağırlık her iki beyin yerine elde sonra buz gibi homojenizasyon arabelleği 1 mL içeren bir homojenizasyon cam doku transfer.
    9. Homojenize bir motor tahrikli havaneli 800 rpm'de, 10 hatta konturları kullanarak doku.
      Not: Tek bir darbe bir eylem yukarı ve aşağı eşittir, ilk vuruşun yaklaşık 5 olmalıdır s, aşağıdaki 3-4 s. homojenizasyon izotonik ortamda synaptosomes 6 / patlama önlemek önemlidir. Uygun kuvvet ve izotonik orta kullanarak presynaptic terminalleri reseal çevreleyen sitoplazma, sinaptik veziküller, mitokondri ve sitoiskeleti sağlayacaktır 15.
    10. Homogenate 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü transfer ve kalan homogenate ile 0.5 mL ek homojenizasyon tampon durulama tarafından homojenizasyon bardaktan toplamak.
      11. Diğer beyin dokusundan homojenize verirken
    11. örnek buz üzerinde tutun. Adımları 1.2.12-1.2.13 paralel iki beyin çalıştırın.
    12. Çekirdekleri cips ve hücre enkaz tarafından Santrifüjü (1000 x g, 10 min, 4° C).
    13. (Hücre zarlarında ve sitoplazma içeren) süpernatant (S1) yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler için transfer ve 4'te 16.000 x g 20 dk için de santrifüj kapasitesi ° C.
    14. (Sitoplazma içeren) süpernatant atmak ve 40 μL homojenizasyon arabellekte (ham synaptosomes içeren) Pelet (P2) resuspend / (1.2.6. adımda elde ağırlık temel) mg doku. Çok fazla güç synaptosomes kıracak gibi ham synaptosomal kesir p1000 pipet ile hafifçe resuspend.
      Not: En az 280 μL ile sonuna kadar önemlidir. Eğer değilse, mg başına 40'tan fazla μL ile sulandrarak gerekli olacaktır. Adımları 1.2.1-1.2.13 kısa sürede gerçekleştirilmesi gereken ve buz üzerinde tutulması gerekir sahiptir. Ham synaptosomes homojenizasyon arabellekte resuspended en kısa zamanda buz 6 , 15 , 16 tutulur sürece oldukça kararlı olduklarını.

2. Alımı deney

  1. ekleyin 440 μL alımını tampon + ligand + kokain için belirlenen 12 1.5 mL microcentrifuge tüpler ve 440 μL alımını tampon + ligand 1.5 mL microcentrifuge tüpler (bkz. Tablo 1 için Düzen) kalan 36.
    Not: buz 15dk deneye başlamadan önce onları kaldırmak Onları oda sıcaklığına getirmek, ama sonra inhibitörleri korumaya kadar buzda tut.
  2. Hazırla doyma eğrisi (dopamin (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H dopamin) (91.1 CI/mmol) son çeşitli konsantrasyonlarda (0,031, 0.0625, 0,125, 0,25, 0.5 ve 1,0 mikron)).
    1. 10, 5, 2.5, 1,25, 0.62 ve 0.31 altı 2 mL microcentrifuge tüpler etiket.
    2. Ekleyin 750 μL alımını tampon + ligand için en düşük sayı 5 microcentrifuge tüplerini.
    3. Ekleyin 1,455.4 μL alımını tampon + ligand, 14.6 μL dopamin (1 mM), tüp 30 μl 3-H dopamin (11 mikron) etiketli 10.
    4. Transfer 750 μL tüp 10 5 etiketli Tube etiketli. İyice karıştırın ve 750 μL bu tüpünden 2.5 tüp aktarın. Kalan tüpler bu seyreltme tekrarlamak.
  3. 4 mL alımını arabellek cam mikrofiber filtreleriyle 12 iyi filtre kovanın koyduktan sonra ön durulama.
  4. Ekleyin 10 μL ilk 24 synaptosomal membran süspansiyon 1,5 mL mikro-santrifüj (bakınız Tablo 1 düzeni için) içeren 440 μL Tampon tüpleri. Girdap dikkatle ve spin aşağı kısa bir süre synaptosomes içinde belgili tanımlık tampon batık emin olmak için. 37 o C 10 dakika süreyle, terk
    Not: Alımı deney sırasında kez beyin arasında adil karşılaştırma için üzerinde tam olarak önemlidir. Bir kronometre için duyarlığı kullanın.
    5. Konsantrasyonu 10 ve 5 mikron (Bölüm 2.2) ilk iki sütun ve bırak, 37 o C sallayarak ile 5 min için
  5. Ekle 50 μL dopamin. Tam olarak 5 dakika sonra 1 mL buz gibi Alım arabelleği ekleyerek tepki bırak. Konsantrasyon 2.5 ve 1,25 mikron (Bölüm 2.2) ve sonra konsantrasyon 0.62 ve 0.31 mikron ile aynı işlemi uygulayın.
  6. Örnekleri için önceden durulanır mikrofiber filtreler ekleyin ve 5 x 4 mL buz gibi Alım arabelleği ile yıkayın. İlk 12 örnekleri süzgeçlerle eklendiğinde, filtreleri mercek tüpler için hareket. Bu sonraki 12 örnekleri ile yineleyin.
  7. Tekrarlama adım 2,4-2,6 sonraki beyin için.
  8. Hazırlamak 3 max-sayma tüpler bir mikrofiber filtre mercek tüpler 49-51 dibine yerleştirip 25 µL üstünde tepe (10 mikron) en fazla dopamin konsantrasyon ekleme.
  9. Tüm 51 mercek tüplerde bir duman Başlık 1 h. için bırakın
  10. Ekle 3 mL mercek sıvı her mercek tüp ve shake üzerinde bir shaker için 1 h. dinç
  11. Sayısı [3 H]-beta-Counter 1 dk. DA
    1. Programı açın ve seçin: Label: H-3, plaka/filtre: 4 mL flakon, 4 ile 6, tahlil türü: Normal ve zaman sayma: 1 dk.
      Not: Bu adımı ertesi gün daha rahat yapılabilir. Gece boyunca kalay folyo ile kaplı örnekleri bırakın.
  12. Protein tayini
    1. synaptosomes fmol/dk/μg sayar min (BGBM) başına gelen ayarlamalar ve Alım uygun karşılaştırma için protein konsantrasyonları belirlemek için bir standart BCA Protein tahlil kit kullanın Örnekler arasındaki.

3. Veri analizi

eğrisi her grup için ve Michaelis Menten sürekli (K M) ve (V max) reaksiyon hızını hesaplamak bir doygunluk yapmak
  1. Kullanım anlamazdın verilerden deney.
    Not: Yarısı V maksimum ulaşmak için gerekli substrat konsantrasyonu K M değeri yansıtır. Buna göre V max yansıtır doğrudan yüzeyi ve nasıl kendi faaliyet ardından değişiklikler ve/veya etkileşen proteinler tarafından yanı sıra modülasyonlu üzerinde DAT sayısına bağlıdır (en fazla Alım kapasitesi), DAT fonksiyonu değişiklikler iyon gradyanlar içinde. K M değer substrat benzeşme ışınlama için dolaylı bir ölçüsüdür bu önemlisi de can modülasyonlu ardından değişiklikler ve/veya etkileşen proteinler tarafından. Tam fonksiyonel değişiklikler değerlendirmek için bu nedenle doğrudan örneğin bir yüzey biotinylation tahlil tarafından yüzey ifade düzeylerini belirlemek önemlidir. Dopamin geri alım ve anlamı üzerinde bir gelişme K M ve V max değerlerden açıklaması Schmitz vd. 17 tarafından gözden.

4. Yüksek performanslı sıvı Kromatografi (yöntem 2)

  1. beyin diseksiyon
    1. etiket ve tartmak microcentrifuge tüpler; bir fare bölgedeki başına.
    2. Servikal çıkması ve işten çıkarma tarafından bir defada tek bir fare kurban. Hızla beyin 1.2 bölümünde açıklandığı gibi kaldırın. Daha fazla diseksiyon hemen yapmak.
    3. Bir beyin matrisi kullanarak teşrih NAc ve dStr bir zımba ile ince ikili diseksiyon ardından striatum 3 mm koronal dilim. Yumruk alan için bkz. şekil 3.
    4. 1.5 mL microcentrifuge tüpler doku transferi ve hızlı bir şekilde kuru Buza koyun. Doku tartmak ve hemen geri kuru buza yerleştirin.
      Not: Doku ağırlık konsantrasyon hesaplaması için daha sonra önemlidir.
      5. Sonraki fare ile
    5. Yinele adımları 4.1.1-4.1.4.
      Not: doku 80 o C daha fazla işleme kadar yerleştirin veya hemen doku işlemeye devam.

5. Doku hazırlık

  1. 4 ° C-önceden soğutmak izin vermek üzere santrifüj açmak
  2. homojenizasyon çözüm (0.1 N Perklorik asit (HClO 4)) hazırlamak ve buz üzerinde tutmak
  3. Kullanma homojenizasyon çözüm, hazırlamak bir taze 0.1 pmol/μL dopamin standart bir 1 mM hisse senedi çözümden (10.000 x seyreltme).
    Not: Stok çözüm dopamin homojenizasyon arabelleğe 1 mM, 20 ° C'de bir ay için tutulabilir hisse senedi bir konsantrasyon içinde eriterek tarafından hazırlanmıştır. Beynin diğer alanlarda ilgi varsa, konsantrasyon standart prefrontral korteks dahil olmak üzere diğer beyin bölgeleri beri değiştirilmesi gerekecektir, Hipokampus, gözlemliyorum nigra ve ventral tegmental alan sahip ilâ 100 kere daha az DA striatum için karşılaştırıldığında.
  4. 500 μL homojenizasyon çözüm her örnek için (Yani NAc ve dStr doku; Bölüm 4.1) ekleyin ve bir ultra-homogenizer üzerinde son sürat yaklaşık 30 s. tutmak için kullanarak örnekleri örnek buzlu suda homojenizasyon sırasında lunaparkçı. Her örnek arasında temiz su ile ultra homogenizer (tam hız 30 s).
  5. Örnekleri için 4 ° c, 14.000 x g. 30 dk santrifüj kapasitesi
  6. Transfer yaklaşık 200 μL Örnek 1 mL plastik Ģırınga kullanarak bir cam 0,22 mikron filtre (1 cm çapında).
    Not: Seçilen filtreler yüksek molekül ağırlıklı maddeler kaldırmak için 0,22 mikron olarak cam filtre kullanımı, önemlidir değil.
  7. Elektro-kimyasal algılama (EC) tarafından analiz örnekleri-6 bölümde açıklandığı gibi HPLC metodolojisi 18.

6. Yüksek performanslı sıvı Kromatografi analizi

  1. hazırla aşağıdaki çözüm için mobil faz: sodyum asetat 55 mM, octanesulfonic asit 1 mM, Na 2 EDTA 0.1 mM, Asetonitril % 8, Asetik asit 0.1 M, pH = 3.2.
    Not: pH 0,1 M Asetik asit ile ayarlayın. PH ile kesin olarak önemlidir. Çözüm degasse olmalıdırd on-line degasser (HPLC sistemi entegre parçası) tarafından. Mobil faz 2 L yapmak ve hakkında ayda bir değiştirin (gürültü fark geldiğinde değiştirmek). Dalgalanmalar nedeniyle mobil faz değiştirdikten sonra ayarlamak için yaklaşık 24 saat sürerse.
  2. Dedektörü up:
    1. Set volt çıkış 700 Og ve sıcaklık dedektörü Fırın 32 ° C için; bu çok önemlidir. Online kılavuzu kullanarak bir Aralık programı olun. Daha fazla ayrıntı için verilen kılavuzuna başvurun). Tablo 2 başına zaman program eklemek.
      Not: Bu çalışmada, program otomatik olarak, küme saklama zamanlarda, HPLC en iyi mevcut korumak için ve mümkün olduğunca ama hala görünümündeki genişlemiş Kromatografik doruklarına tutmak için geçerli değiştirmek için ayarlanır. Bu fareler gelen striatal beyin lysates için optimize edilmiştir.
  3. Bulmak-e doğru program eklendiğinde 3 nokta kalibrasyon eğrisi olun, standart enjekte edilerek üç kez (5, 10 ve 15 μL).
    Not: Standart (10 μL (0.1 pmol/μL x 10 μL 1 pmol DA =)) her onuncu örnek ve örnek için en yakın standart kalibre enjekte. Güzel 3 noktalı standart ayarlama ve Kromatografik beklenen aralıkta gelmek dışarı eğer kontrol belgili tanımlık sistem belgili tanımlık gün önce ayarlayın. Önemli gürültü gözlem yapılırsa, mobil faz değiştirin. Bir tepe 990 mV sonra yeniden enjekte düşük bir ses örnek daha yüksektir, veya yeni bir dizi program ve yeni bir standart eğri olun. Algılama sınırı 3 kez mV en düşük en yüksek değeri için her standart enjekte gürültü değer olarak ölçülür (NA, DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT ve 5-HT).
    1. Kurulum sistem LC çözüm açarak ve analiz 1; Bu başlar çevrimiçi modda etkinleştirme. Kullanıcı kimliğini ve parolasını yazın ve Tamam'ı tıklatın. LC çözüm aletleri için bağlanmak bekleyin. Toplu tabloya git ve veri bilgileri doldurun (örneğin, örnek türü: Standart, analiz türünün örnekleri ve std bilinmeyen: QT, INJ Cilt: 10, ISTD amt: düzey 1 con). Dosyayı Kaydet (gitgidmek eğe - > toplu iş dosyası olarak - kaydet > kaydetmek).
    2. Yapmak ilk örnek basarak enjekte sistem ' toplu başlatmak '. Bu çözelti teslim modülü ile otomatik örnekleyici tarafından 10 μL örnek enjeksiyon içinde sonuçlanacaktır.
      Not: 0.15 mL/dk ve C18 sütunun bir pompa akış hızı ile ters faz kullanın. Burada bir amperometric dedektörü elektrokimyasal algılama için kullanıldı. Cam gibi karbon elektrot 0.8 V bir Ag/AgCl referans elektrot ile ayarlanmalıdır. Dopamin tahlil, µ Kromatografi 3 kullanmak için (3) C18 ODS (Kromatografik ayırma ulaşmak DA 2 mm x 100 mm, parçacık boyutu 3 µm).
    3. Kaydedilen ve hesaplanan en yüksek alanlarda ayıklayın.
      1. Veri toplama örnekleri bittiğinde Kromatografik izlemeye git. Sonrası analizler - Lc gidin > dosya adını (Kromatografik açılacaktır) - açmadı > görünümü'nü tıklatın. El ile tümleştirme çubuğunda entegre olmak için - tüm tepeler eklemek > veri raporuna gitmek ve okuyun çıktısını.
        Not: Burada veri analizi ve sistem denetimi için LC çözüm yazılım kullanıldı.
  4. Tepe alanlarından bir örneğinde, dopamin konsantrasyonu aşağıdaki gibi standart bilinen konsantrasyon kullanarak hesaplar:
    1. (1 pmol eşittir) standardının en yüksek alan faktör A. elde etmek için kullanmak
      figure-protocol-17143
    2. faktör A toplama örnekleri almak için cihaz.
      Örnek (içinde pmol başına 10 μL) konsantrasyon = faktör A × pik alanı örnek
    3. örnek toplama ng almak için bu formülü kullanın.
      Örnek konsantrasyon pmol / 10 µL x 500 µL dopamin MW x ng örnek konsantrasyon =
      örnek (ng) konsantrasyon örnek konsantrasyon (pmol başına 10 μL) 500 μL x = dopamin MW x
    4. örnek toplama t almak için ng kullanın pg/g doku konsantrasyon örnek (örnek konsantrasyon pg / doku g pg/g doku =).

Sonuçlar

Geçerli DA Alım Protokolü (şekil 1) DAT işlevindeki fare üzerinden synaptosomes değerlendirmek için gereken tüm adımları içerir. Temsilcisi verilerimiz DA Alım yöntemi (Şekil 2) bir doygunluk eğrisi ayarsız veri (şekil 2B) ile gösteriyor ve veri (şekil 2A) ayarlanabilir. Doygunluk eğrisi alımını vahşi türü Fareler gösteriyor. Genellikle bir DA...

Tartışmalar

Bu el yazması DA seçim herhangi bir fare modeli homeostazı betimlemek için yararlı deneysel iletişim kurallarını açıklar. Biz ayrıntılı iletişim kuralları DA ölçüm düzeyde beyin dokusu içinde HPLC ve synaptosomal DA alımı yoluyla DAT. fonksiyonel DA ulaşım değerlendirmek için kullanarak fare üzerinden sağlar Yordamlar, iletişim kuralları ve HPLC deney ve synaptosomal DA alımı tahlil aşağıda gelişmiş.

Synaptosomal alımını Protokolü DAT. kombine işlevsel...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser UCPH 2016 Program of Excellence (U.G., A.R., KJ) tarafından desteklenen, Lundbeck Vakfı (MR) Lundbeck Vakfı Merkezi Biomembranes içinde Nanomedicine (U.G.), Ulusal Enstitüsü, sağlık hibe P01 DA 12408 (U.G.), Danimarka için Bağımsız araştırma - tıbbi Bilimler (U.G.) Konseyi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
COMT inhibitorSigma Aldrich, GermanyRO-41-0960For synaptosomal DA uptake protocol
[3H]-DopaminePerkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USANET67-3001MCFor synaptosomal DA uptake protocol
Glass microfiber filtersGF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire1822-024For synaptosomal DA uptake protocol
HiSafe Scintillation fluidPerkin Elmer1200-437For synaptosomal DA uptake protocol
MicroBeta2Perkin ElmerFor synaptosomal DA uptake protocol
BCA Protein Assay kitThermo Scientific Pierce23225For synaptosomal DA uptake protocol
HEPESSigma Life ScienceH3375For synaptosomal DA uptake protocol
SucroseSigma Life ScienceS7903For synaptosomal DA uptake protocol
NaClSigma Life ScienceS3014For synaptosomal DA uptake protocol
KClSigma Life ScienceP9541For synaptosomal DA uptake protocol
CaCl2Merck KGaA10043-52-4For synaptosomal DA uptake protocol
MgSO4Sigma Life Science63065For synaptosomal DA uptake protocol
Ascorbic AcidSigma Life ScienceA0278For synaptosomal DA uptake protocol
D-GlucoseSigma Life ScienceG7021For synaptosomal DA uptake protocol
PargylineSigma AldrichP-8013For synaptosomal DA uptake protocol
DesipramineSigma AldrichD3900For synaptosomal DA uptake protocol
DopamineSigma Life ScienceH8502For synaptosomal DA uptake protocol
CocaineSigma Life ScienceC5776For synaptosomal DA uptake protocol
Brain matrixASI instrumentsRBM2000CFor synaptosomal DA uptake protocol
Cafano mechanical teflon disrupterBuch & HolmDiscontinuedFor synaptosomal DA uptake protocol (homogenization)
Antec Decade (Amperometric detector)Antec, Leiden, The NetherlandsDiscontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176For HPLC protocol
Avantec 0.22 μm glass filterFrisenette ApS, Denmark13CP020ASFor HPLC protocol
Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, GermanyPart Number:00A-3300-E0For HPLC protocol
LC solution softwareShimadzuLabSolutions Series WorkstationFor HPLC protocol
Perchlor acid 0.1MFluka Analytical35418-500mlFor HPLC protocol (Tissue preparation)
EDTASigmaE5134-50gFor HPLC protocol
NatriumdihydrogenphospharBie&Berntsen1.06346 1000gFor HPLC protocol
Sodium 1-octanesulfonate monohydrateAldrich74885 -10gFor HPLC protocol
Acetonitrile, isocratic HPLC gradeScharlauAC03402500For HPLC protocol
Filtre 0.22umFrisenette ApS, DenmarkAvantec 13CP020ASFor HPLC protocol (Tissue preparation)
ortho-Phosphoric acid 85%Merck1.00563. 1000mlFor HPLC protocol
ElectrodeAntec, Leiden, The NetherlandsAN1161300For HPLC protocol (see manual online)
Detector program on DECADE II electrochemical detectorAntec, Leiden, The NetherlandsLite™ Electrochemical Detector type 175 and 176For HPLC protocol

Referanslar

  1. Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
  2. Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
  3. Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
  4. Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
  5. Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
  6. Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
  7. Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
  8. Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
  9. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  10. Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
  11. Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
  12. Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
  13. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
  14. Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
  15. Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
  16. Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
  17. Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
  18. Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
  19. Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
  20. Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
  21. Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
  22. Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
  23. Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
  24. Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
  25. Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
  26. Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
  27. Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
  28. Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
  29. Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
  30. Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
  31. Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
  32. Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
  33. Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
  34. Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
  35. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
  36. Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
  37. Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
  38. Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesay 127Striatumdopaminy ksek performansl s v Kromatografi HPLCsynaptosomal dopamin al msynaptosomesdopamin Homeostazdopamin ta y c

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır