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Zusammenfassung

Konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie und Laser Mikro-Bestrahlung Angebot Werkzeuge für die Induktion von DNA-Schäden und die Reaktion der DNA-Reparatur-Proteine in ausgewählten Bereichen der Sub-atomaren Überwachung. Diese Technik hat deutlich erweiterte unsere Kenntnisse der Schaden-Erkennung, Signalisierung und Rekrutierung. Diese Handschrift zeigt diese Technologien, um Einzel- und Doppelzimmer Strang Pause Reparatur zu prüfen.

Zusammenfassung

Hochgradig koordinierten DNA Reparatur Wege vorhanden sein um zu erkennen, Verbrauchsteuern und ersetzen Sie beschädigte DNA-Basen und Reparatur von DNA-Strangbrüchen zu koordinieren. Während molekularbiologische Techniken Struktur, enzymatische Funktionen und Kinetik der Reparatur-Proteine geklärt haben, gibt es noch eine Notwendigkeit zu verstehen, wie die Reparatur innerhalb des Zellkerns abgestimmt ist. Mikro-Laserbestrahlung bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Induktion von DNA-Schäden und Überwachung der Rekrutierung von Reparatur-Proteine. Induktion von DNA-Schäden durch Mikro-Laserbestrahlung kann auftreten, mit einem Bereich von Wellenlängen, und Benutzer können zuverlässig induzieren Einzelstrang Pausen, Basis Läsionen und doppelte Strangbrüchen mit einer Reihe von Dosen. Hier, Mikro-Laserbestrahlung wird verwendet, um prüfen, Reparatur von Einzel- und Doppelzimmer Strangbrüche induziert durch zwei gemeinsame konfokale Laserwellenlängen, 355 nm und 405 nm. Weitere, richtige Charakterisierung der angewandten Dosis zur Induktion von konkreten Schaden Mischungen wird beschrieben, so dass Benutzer reproduzierbar Laser Mikro-Bestrahlung Datenerfassung und Analyse durchführen können.

Einleitung

Fluoreszenz-Mikroskopie ist entstanden, als eine leistungsfähige Technik zu visualisieren zellulären Architektur, Protein Lokalisierung zu prüfen und überwachen von Protein-Protein und Protein-DNA-Wechselwirkungen. Fluoreszenz-Mikroskopie, um DNA-Schäden Reaktionen nach der Anwendung des globalen DNA Beschädigung Mittel, wie ultraviolettes (UV) Licht zu studieren mit lieferte ionisierender Strahlung, chemische Oxidation oder alkylierende Vertreter und/oder Chemotherapeutika neue Einblicke in Initiierung, Signalisierung und Rekrutierung von DNA Reparatur Proteine zu Websites von DNA-Schäden1,2. Aber diese globale und asynchrone Ereignisse zu beschädigen sind begrenzt, wenn detaillierte Informationen über die Rekrutierung Ordnung, Kinetik der Assoziation und Dissoziation, und die Beziehungen zwischen den wichtigsten DNA-Reparatur-Proteine werden gesucht. Glücklicherweise, Fortschritte in der Laser-scanning-konfokale Mikroskope, breitere Verfügbarkeit von Schäden-induzierende Laserwellenlängen und Verbesserungen in fluoreszierende Proteine in den vergangenen 25 Jahren haben zur Verfügung gestellt Forscher mit verbesserten Tools für diese Prüfung Aspekte der DNA Reparatur, durch gezielte DNA-Schäden-Induktion.

Bestrahlung von Zellen mit Laser Microbeams um zellulärer und subzellulärer Funktionen zu studieren ist ein etabliertes Werkzeug in Zelle und Strahlung Biologie3. Anwendung dieser Technik auf die Untersuchung der DNA-Reparatur entstanden bei Cremer und Mitarbeiter ein hoch konzentriert UV (257 nm) Laser Microbeam System induzieren DNA-Schäden über eine 0,5 µm vor Ort in Chinese Hamster Eierstock (CHO) Zellen4 und etabliert die Induktion von DNA Photolesions durch dieses System5. Während bietet deutliche Verbesserungen gegenüber UV-Microbeam-Methoden zur Annahme dieser Zeit Schäden an System aufgrund seiner spezialisierten Einrichtung und seine Unfähigkeit, generieren beschränkte bricht Doppelstrang (DSB)6. Spätere Untersuchung einer Vielzahl von UV-B (290-320 nm) und UV-ein (320-400 nm) Wellenlängen durch eine Anzahl von Gruppen ergab, dass UV Photoproducts, oxidativen Läsionen, Basis Einzelstrang bricht (SSBs) und DSB können abhängig von der Wellenlänge des Lasers angeregt werden und 4,7,8,9,10 (rezensiert in 3) eingeschaltet. Darüber hinaus Kombinationen dieser UV-B und UV-A-Wellenlängen mit sensibilisierenden Agenten, wie Psoralen, Bromodeoxyuridine (BrdU) und Hoechst Farbstoffe, fand man auch induzieren DNA-Schädigung abhängig von der Wellenlänge, Kraft und Dauer der Exposition, wenn benötigt, die Macht zu induzieren Schaden ist oft in Anwesenheit dieser Agenten11,12,13,14,15verringert. Diese Neuerungen erweitert den Einsatz von Mikro-Bestrahlung, gäbe es noch technische Hürden für weitere Verbreitung dieser Methoden angegangen werden.

Cremer und Mitarbeiter deutlich erweiterten Bereich der Mikro-Bestrahlung durch die präzise Fokussierung der UV-Microbeam um signifikante schädliche Energie stark lokalisierte großflächig in der Zelle zu übernehmen. Wie konfokale Mikroskope und Lasersysteme ermöglichen erweiterte, war eng gebündelte Licht ganz allgemein zugänglich; Allerdings präsentierte Kupplung UV-Quellen zu Bereichen und den Umgang mit der chromatische Aberrationen, die sie noch induziert erhebliche Herausforderungen für die meisten Benutzer3,6,16. Wie UV Farbstoffe in der Popularität in den 1990er Jahren in der Lage, mit Schwerpunkt Optik stieg und gefangennehmende aufgeregt, UV Fluoreszenz zugänglicher16 wurdeVerbesserungen in der Laser-scanning-Benutzer angeboten konzentriert die Möglichkeit zur Erstellung sehr UV Erregung-Spots innerhalb Zellen6,17. Aber es war nicht bis in die frühen 2000er Jahre, dass die tatsächlichen Auswirkungen dieser Kombination von eng fokussierten Strahlen mit höherer Intensität Laser fühlte, wenn zahlreiche Berichte entstanden demonstrieren, dass DNA-Strangbrüchen mit und ohne Sensibilisatoren in ausgelöst werden könnte, die UV-A-Bereich6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26, und sogar bei mehr sichtbare Wellenlängen wie 488 nm27. Diese Weiterentwicklungen für eine breitere Anwendung von Mikro-Bestrahlungstechnik auf eine Reihe von kommerziellen Systemen erlaubt. Parallel zu diesen Entwicklungen entstanden zwei-Photonen-Techniken auch, erlaubt präzise Induktion von DNA-Schäden; Obwohl diese Fortschritte hier nicht diskutiert werden, gibt es eine Reihe von Review-Artikel diskutieren diese Methoden9,28,29,30.

Mit der aktuellen Zugänglichkeit der konfokalen Mikroskopen in der Lage, hochspezialisierte UV-Licht und die weit verbreitete Verfügbarkeit von fluoreszierenden Proteinen ermöglicht Echtzeit-Tracking der DNA-Reparatur-Proteine liefern haben zu Mikro-Bestrahlung Techniken entwickelt. leistungsstarke Tools für die Prüfung von DNA-Schäden als Reaktion und Reparatur Wege. Benutzer müssen sich jedoch bewusst sein, dass die Generation der DNA-Schädigung hängt stark von der Wellenlänge des Lasers und die Kraft auf die Sub-atomaren Bereich angewendet wird. Einsatz von UV-C (~ 260 nm) Wellenlängen ermöglichen direkte DNA-Anregung und hohe Selektivität für die Induktion von UV Photoproducts7,8. UV-B und UV-A-Wellenlängen produzieren Mischungen von DNA-Schäden (Basis Läsion, SSBs und DSB), abhängig von der angewandten Kraft und zellulären Hintergrund verwendet7. Endogener Photosensitizer und Anti-Oxidationsmittel Ebenen in den gezielten Zellen können die DNA-Schäden-Mischungen produziert durch diese Wellenlängen beeinflussen. Darüber hinaus kann die Verwendung von exogenen Photosensibilisatoren (BrdU, etc.) unterstützen, senken den Energiebedarf für die Induktion von DNA-Schäden. Aber diese Agenten können DNA-Schäden induzieren, indem sich, und sie können den Zellzyklus und Chromatinstruktur verändern, damit ihre Verwendung unerwünschte Effekten führen kann, die vom Benutzer berücksichtigt werden müssen. Daher muss vor der Verwendung von Mikro-Bestrahlung, um DNA-Schäden als Reaktion und Reparatur zu studieren, reiflicher Überlegung des DNA-Reparatur-Signalwegs von Interesse, die Wellenlängen zur Verfügung und die DNA-Schäden-Mischung erstellt.

Hier, Mikro-Laserbestrahlung erfolgt bei beiden häufigsten verwendeten Wellenlängen, 355 nm und 405 nm, ohne Sensibilisatoren, demonstrieren die Mischungen von DNA-Schäden durch diese Wellenlängen und die Einflüsse, die diese Schäden Mischungen haben bei der Prüfung der Reparatur der induzierteSSBs und DSB Nutzer sollten sich bewusst sein, dass diese Wellenlängen nicht zu einer einzigen Art von Strangbrüchen oder base Läsionen. Um DNA Reparatur Wege zu unterscheiden, müssen Nutzer sorgfältig die angewandte Kraft die Kontrolle über eine bestimmte Region des Kerns und charakterisieren den verursachten Schaden mit mehreren Strang Pause Markierungen und DNA-Läsion Antikörper. Wenn Sie richtig angewendet und dadurch gekennzeichnet, kann Mikro-Laserbestrahlung bereichern einige Arten von DNA-Schäden, so dass Anwender beurteilen, Reparatur von base Läsionen und SSBs oder DSB, mit einigen Besonderheiten. Daher haben wir eine Methode erlaubt Benutzern, reproduzierbar durchzuführen Mikro-Laserbestrahlung, charakterisieren die DNA-Schäden-Mischungen induziert durch die angewandte Laser-Dosis und Datenanalyse zur Verfügung gestellt.

Protokoll

1. Zellkultur und Erzeugung von stabilen Zellen

  1. CHO-K1 wachsen Zellen in minimaler wesentliches Medium mit 10 % fötalen Rinderserum ergänzt. Pflegen Sie Zellen in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO 2 bei 37 ° c
  2. Zellen transfizieren CHO-K1 mit 1 µg Plasmid-DNA mit menschlichen XRCC1 mit einer C-terminalen grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Tags über eine kommerzielle Transfection Reagens nach Hersteller ' Anweisungen s.
  3. Wählen Sie CHO-K1 Zellen stabil mit dem Ausdruck der menschlichen XRCC1-GFP Fusion mit 800 µg/mL Geneticin und bereichern die XRCC1-GLP mit dem Ausdruck ihrer Bevölkerung mit Fluoreszenz unterstützt Zellsortierung (FACS).
  4. Platte Zellen in Kulturgefäßen mit Deckglas Böden, Mikro-bestrahlten sein, so dass sie etwa 75 % oder mehr Konfluenz am folgenden Tag erreichen. Einige Räume zwischen den Zellen sind wünschenswert, vor allem, wenn die Registrierung verwenden, um wieder das gleiche Bildfeld (beschrieben in Abschnitt 3.2).

2. Mikroskop-Set-up

  1. Wählen Sie eine Laserscanning confocal Mikroskop mit geeigneten Laser und Optik und Steuerungssoftware für Mikro-Bestrahlung/Photostimulation ausgestattet. Präsentiert Experimente Gebrauch einen Laser-scanning-confocal Mikroskop, das geändert wurde, um eine 355 nm Laser, Faser-gekoppelt an ein Galvanometer Photoaktivierungen Miniscanner umfassen und über den Hersteller gesteuert ' s-Kontrolle und Analyse-Software. Dieses System können Mikro-Bestrahlung in einer Benutzer-gekennzeichneten Region of Interest (ROI) mit Photoaktivierungen Miniscanner (355 nm Laser) oder die standard konfokale Galvanometer (405 nm-Laser).
  2. Wählen Sie die Wellenlänge für Mikro-Bestrahlung, um sicherzustellen, dass alle optische Komponenten in der Mikro-Bestrahlung Lichtweg für die gewählte Wellenlänge eignen.
    Hinweis: Das vorgestellte System verwendet ein 40 × C-Apochromat (numerische Apertur (NA) 1.2) Öl eintauchen zusammen mit einem UV Filter Cube für 355 nm Mikro-Bestrahlung, und ein 20 × C-Apochromat (NA 0,75) trocken Ziel unter Verwendung der standard konfokale Lichtweg für 405 nm Mikro-Bestrahlung. 20 × Ziel verwendet im Setup ist nicht kompatibel mit 355 nm Wellenlänge; Daher verwendeten wir die 40 × für 355 nm nur. Mit dem trockenen Ziel für Beschädigung Immunfluoreszenz Protokolle flussabwärts angewendet werden, ohne Reinigung aus Immersionsöl ermöglicht, weshalb wir dieses Ziel wenn möglich nutzen.
  3. Konfigurieren Sie das Mikroskop für die Mikro-Bestrahlung-Experiment. Um die Konsistenz zwischen Experimenten bezeichnen Sie eine standardisierte Konfiguration der Mikroskopkomponenten für jede Art von Mikro-Bestrahlung verwendet werden. Speichern Sie diese Einstellungen als Preset innerhalb der Mikroskop ' Betriebssoftware, wenn möglich s.
    Hinweis: In dem vorgestellten System Zellen sind Mikro-bestrahlt und abgebildet mit unidirektionalen scannen, Scan-Auflösung von 1024 x 1024 Pixel mit 1 x Scan Zoom mit einer Frame-Rate von 8 Bildern pro Sekunde (fps) und mit der Lochkamera setzen auf ca. 4 luftig Einheiten (AU), als für den 488 nm Laser (69 µm) bestimmt. Diese offenen Lochkamera-Einstellung wurde gewählt, um die Menge an Licht in jedes Bild eingefangen zu maximieren erlaubt die Verwendung von niedrigeren imaging Laserleistungen und Verringerung der Immunofluoreszenz.

3. Laser-Mikro-Bestrahlung

  1. Ort die vorbereiteten Kulturschale, Zellen von Interesse, auf den Mikroskoptisch und sicher einrastet.
    1. , Falls vorhanden, legen Sie gekammerten Folie in eine Bühne-Top-Inkubator und pflegen bei 37 ° C mit 5 % CO 2 bei Beschädigung Induktion. Dieser Schritt ist am wichtigsten für Leben-Zelle Timelapse imaging oder lange Sitzungen imaging. Ansonsten Ortszellen am Mikroskop zu inszenieren und Bestrahlung bei Raumtemperatur durchführen (~ 25 ° c), und dann schnell wieder Zellen auf einem Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO 2.
  2. Bildfelder ermöglichen die Forscher an die gleiche Stelle zurück nach Durchführung Fixierung, Färbung oder anderen Verfahren zu registrieren. Registrierung der beschädigte Felder mithilfe eines codierten, automatisierte Mikroskoptisch durchführen oder Zell-Deckglas Kulturgefäße mit einem geätzten oder beschrifteten Raster XY Standorte.
    1. Wenn Softwareregistrierung Bild, wählen Sie eine erkennbare Funktion Kulturgefäß (d. h. die Ecke des Deckglas oder Barriere zwischen Brunnen), ein Bild zu sammeln und erfassen die XY-Position. Dadurch wird für die Ausrichtung und Registrierung der XY Standorte ausgewählter Felder nach Probenvorbereitung.
    2. Wenn manuelle Registrierung verwenden, Gitter oder geätzten Standorte für jedes Feld manuelles aufzeichnen, achten Sie darauf, die Ausrichtung und Platzierung der Schale auf der Bühne aufnehmen.
    3. Liegen keine Erkennungsmerkmale für die Zelle Kulturgefäße, beschädigte Felder identifizieren durch visuelle Inspektion der Zellmorphologie und Dichte. Achten Sie darauf, wählen Felder mit ausreichend besondere Merkmale erkennbar sein, während später imaging.
      Hinweis: Dies kann zeitaufwändig, durchzuführen, es sei denn, die Orientierung und das Kulturgefäß ist stark eingeschränkt sein.
  3. Wählen Sie ein Feld für Mikro-Bestrahlung und die Probe zu konzentrieren. Wählen Sie für Zellen mit dem Ausdruck Eindringmittel markierte Proteine der Brennebene mit der maximalen nuklearen Querschnitt in die fluoreszierenden Kanal von Interesse. Für die Zellen nicht mit dem Ausdruck beschriftet Proteine, oder für diejenigen ohne klare nuklearen Lokalisierung, Phasenkontrast oder differential Interferenz Kontrast (DIC) Bildgebung eingesetzt werden, finden die richtigen Brennebene.
    ​ Hinweis: ein nützliches Feature von Phasenkontrast und DIC Bildgebung ist die Tatsache, dass während der Probe die Brennebene durchläuft, die gleiche Funktion hell oder dunkel je nach der relativen Brennebene angezeigt werden kann.
    1. Eine klare Funktion innerhalb des Zellkerns, z. B. ein Nukleolus, auswählen und verschieben die Brennebene rauf und runter unter Beachtung dieser Veränderung im Aussehen. Die wahre Brennebene liegen innerhalb der Übergang von hell zu dunkel. Um das Beispiel zu konzentrieren, wählen Sie die Brennebene, in denen das ausgewählte Objekt den schärfsten Kontrast hat.
  4. Registrieren die Position des Feldes von Interesse. Ein 3 x 3 Pixel-Quadrat ROI innerhalb der Mikroskop-Software zu erstellen, platzieren diese ROI über den Kern einer Zelle beschädigt werden und setzen dieses ROI zu den Schaden ROI.
  5. Sammeln ein Pre-Schaden Bild, einschließlich die Position des Schadens ROI.
    1. Für Experimente, die nicht mit fluoreszierende Proteinen, erwerben ein Phasenkontrast- oder Differential Kontrast (DIC) Hellfeld Interferenzbild zu identifizieren und Kerne für Schäden aufnehmen.
    2. Für Leben-Zelle Experimente mit fluoreszierenden Proteinen, erwerben ein Bild mit Hellfeld und die Fluoreszenz-Kanal für das Protein des Interesses (z.B. Laser Linie 488 nm zur Anregung der GLP, Laser Linie 561 nm für Anregung von RFP). In Experimenten mit der CHO-K1 XRCC1-GFP, Fluoreszenz von 488 nm Laserlinie begeistert wurde gleichzeitig mit dem übertragenen DIC Hellfeld Kanal gesammelt.
  6. Eingeweihten Laser Schaden.
    1. In das vorgestellte System, Kontrolle der Laser-Dosis durch die Gesamtzeit ausgegeben scannen den Schaden ROI. Da das Galvanometer für den 355 nm-Laser mit einer festen Scan-Geschwindigkeit arbeitet, Laser-Dosis erfolgt nach dem Zeitaufwand wiederholt Scannen des ausgewählten Schadens ROI: in den hier vorgestellten Mikro-Bestrahlung bei 355 nm ist für 2 bis 10 Sekunden durchgeführt.
    2. Dagegen steuern die 405 nm Laser-Dosis durch den Scan-Rate Modulation und führen Sie einen Scan des ausgewählten Schadens ROI. In der Daten-pVerwenden Sie hier ärgerte sich, 8 und 0,5 fps für Mikro-Bestrahlung bei 405 nm. Eine Scan-Rate von 8 Bilder pro Sekunde liefert eine niedrigere Dosis der Laser als 0,5 fps, weil der Laser weniger Zeit auf jedes Pixel während des Scans verbringt. Beide Laser sind mit 100 % Leistung betrieben. Siehe Abschnitt 3.7 Anweisungen zur Messung der Laserleistung direkt.
      Hinweis: Jedes einzelnen Mikroskopsystem kann unterscheiden sich in von Laserleistung auf einen dafür vorgesehenen ROI, ähnlich wie die 355 Bereitstellung nm und 405 nm unterscheiden sich in dem vorgestellten System. Benutzer müssen dieses Verfahren für ihr Mikroskopsystem ermitteln und melden diese Parameter innerhalb ihrer Methoden Abschnitte.
    3. Für das live Cell Imaging durchführen Timelapse Bildaufnahme von Hellfeld und Fluoreszenz-Kanäle. Stellen Sie die Dauer und Häufigkeit der Zeitraffer, Datenerfassung, im Idealfall erfassen die Ansammlung von fluoreszierenden Proteins bei der Beschädigung ROI und seine Dissoziation über den zeitlichen Verlauf des Experiments zu optimieren. Experimente mit XRCC1-GFP sammelte Bilder alle 30 Sekunden für 20 Minuten.
      ​ Hinweis: die Frequenz der Timelapse Bildgebung kann durch Immunofluoreszenz Fluorophor, erschwert die Analyse der Akkumulation und Dissoziation begrenzt werden. Immunofluoreszenz kann ausgewertet werden, indem unbeschädigten Zellen während der Zeitraffer beobachten und anpassen Erwerb Bedingungen fluoreszierende Signalverlust in diesen unbeschädigten Zellen zu minimieren. Einige Immunofluoreszenz möglicherweise unvermeidbar, so dass Benutzer der Signalverlust kompensieren können durch die Normalisierung der fluoreszierenden Intensitäten geschädigter Zellen mit denen der unbeschädigten Zellen in jedem Frame den Zeitraffer.
      1. Nach der zeitlichen Verlauf abgeschlossen ist, wählen Sie ein neues Feld der Zellen für Schäden oder beschädigte Zellen zur weiteren Analyse zu beheben, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
      2. Weiter Mikro-Bestrahlung und Zeitraffer imaging, bis die gewünschte Anzahl von geschädigten Zellen erreicht wird.
        ​ Hinweis: Wir empfehlen eine Gesamtmenge von 10-25 Zellen pro ausgewählte Bedingung bei der Beurteilung die Zell-Zell-Heterogenität als Reaktion auf den verursachten Schaden zu beschädigen. Obwohl die meisten konfokale Systeme mehr als eine Zelle während der einzelnen Mikro-Bestrahlung beschädigt Benutzern werden, führt dies versetzte Schaden Einleitung Zeiten, die Analyse der Hauptzeit Rekrutierung über eine große Anzahl von Zellen erschweren können oder Dissoziation Zeit für schnelle Veranstaltungen. In einigen Systemen kann gleichzeitige Schaden Induktion über mehrere ROIs erhalten durch jede unabhängige ROI Laser-Dosis verringern. Es sei denn, diese Probleme mit Timing/Stromversorgung direkt vom Benutzer angesprochen werden, es wird daher empfohlen, Zellen einzeln beschädigt werden.
    4. Für Analysen durch Immunfluoreszenz (IF), Schäden und entweder sofort Zellen, beheben wie beschrieben in Abschnitt 4, oder erlauben Zellen für ausgewählte Schritten von Zeit (z.B. 1, 5, 10 oder 20 min) zu reparieren. Nach die gewünschte Zeit verstreicht, reparieren Sie und färben Sie die Zellen, wie in Abschnitt 4 beschrieben.
      1. Zur Erhöhung der Gesamtzahl der Zelle für wenn-Analyse, beschädigen zusätzliche Felder in das Kulturgefäß, einen interdisziplinäres zeitlicher Verlauf der Reaktion nach dem Schaden zu generieren. Notieren Sie die XY-Position der Datenfelder und die Zeit, die der Schaden eingetreten ist. Nach der gewünschten Summe Zeit verstreicht zu reparieren, reparieren und färben die Zellen als detaillierte unten.
  7. Nach der Feststellung der Protein-Einstellung bei ausgewählten Dosen, Maßnahme und Bericht macht Ebenen nach dem Laserfaser und nach dem Ziel genau zu charakterisieren und Berichten laser-Dosen. Wir verwenden eine kompakte digitale Leistungsmesser und zwei verschiedenen Photodiode Sensorköpfe; eine gekoppelt direkt an die Laserfaser, Post-Faser-Ausgabe zu messen, und andererseits auf den Mikroskoptisch, post-objective Ausgang messen gelegt.
    1. Zur Messung der Laserleistung, stellen Sie den Sensor in der gewünschten Konfiguration (Post-Faser oder post-objective) und Mikro-Bestrahlung durchführen, wie oben beschrieben, während der Aufnahme die Messungen der Leistungsmesser. Beachten Sie, dass die Sampling-Rate des Leistungsmessers möglicherweise nicht schnell genug, um sehr schnelle Mikro-Bestrahlung Ereignisse zu erfassen, so dass es möglicherweise notwendig, mehrere Wiederholungen des Experiments um sicherzustellen, dass das Powermeter genau die angewandte Dosis erkennt.
      Hinweis: Für den 355 nm Laser gemessen wir eine durchschnittliche Spitzenleistung von etwa 5 mW Post-Faser und ca. 19 µW nach dem Ziel. Für den 405 nm-Laser Mikro-Bestrahlung erfolgte in Schleifen von 30 Iterationen zur Überwindung der 0,01 s maximale Abtastrate des Leistungsmessers und durchschnittliche Leistungsspitzen von 1,5 mW und 2,4 mW wurden mit Scangeschwindigkeiten von 8 und 0,5 Bilder pro Sekunde gemessen. , beziehungsweise. Jeder Leistungsmesser ist anders. Benutzer müssen die operativen Wellenlängen und Sampling-Raten für ihre individuelle Leistungsmesser bestimmen.

4. Immunfluoreszenz-Färbung Verfahren

  1. Analyze Strang Pause Induktion durch IF Färbung.
    1. Fix Zellen mit 3,7 % Formaldehyd (Vorsicht) in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 10 min. Aspirat Formaldehyd-Lösung und 3 Mal mit PBS waschen. Das Protokoll kann hier gestoppt werden, indem PBS zurück auf die Zellen und die Zellen können für bis zu 1 Woche bei 4 ° c gelagert werden.
      Achtung: Formaldehyd ist giftig und karzinogen. Geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen und entsorgen Sie die giftige Substanz wie angewiesen durch institutionelle Arbeitsschutz Umweltverfahren.
    2. Permeabilize Zellen unter Verwendung von 0,25 % Triton x-100 mit PBS-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur (RT) und dann waschen mit PBS 3 x.
    3. Block-unspezifische Antikörper-Bindung durch Inkubation für 30 min in PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) bei RT
    4. Inkubation mit primären Monoclonal antibody gegen γH2AX und primären polyklonalen Antikörper gegen 53BP: 1 beide 1:750 in PBS mit 1 % BSA für 1 h bei RT verdünnt und dann 3 Mal mit PBS waschen.
    5. Inkubieren Zellen mit Alexa 488 Ziege Anti-Maus und Alexa 546 Ziege Anti-Kaninchen sowohl verdünnt 1: 2000 in PBS mit 1 % BSA für 1 h bei RT und dann 3 Mal mit PBS waschen.
    6. Kern-DNA mit einer 10 mg/mL Lösung von DAPI färben (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Vorsicht) verdünnt auf 1: 5.000 mit PBS-Puffer für 5 min oder Nutzung vergleichbare nukleare Farbstoff und dann 3 Mal mit PBS waschen.
      Achtung: DAPI ist toxisch und mutagen. Geeigneten persönlichen Schutzausrüstung zu tragen und die giftige Substanz zu entsorgen, wie institutionelle Umwelt Gesundheit und Sicherheit Verfahren angewiesen.
    7. Ort-PBS oder PBS + 0,1 % Natriumazid (Vorsicht) zurück auf die gefärbten Zellen. Protokoll kann hier gestoppt werden und Zellen für mehrere Tage bei 4 ° c gelagert, oder fahren Sie zur Bildaufnahme in Abschnitt 5.
      ​ Vorsicht: Natriumazid ist giftig. Geeigneten persönlichen Schutzausrüstung zu tragen und die giftigen Substanzen zu entsorgen, wie institutionelle Umwelt Gesundheit und Sicherheit Verfahren angewiesen.
  2. Analyze Induktion von base Läsionen oder DNA-Addukten von IF Färbung.
    1. Fix und permeabilize Zellen im eiskalten Methanol (Vorsicht) für 20 min bei-20 ° c
      Achtung: Methanol ist giftig und brennbar. Geeigneten persönlichen Schutzausrüstung zu tragen und die giftige Substanz zu entsorgen, wie institutionelle Umwelt Gesundheit und Sicherheit Verfahren angewiesen.
    2. Aspirieren der meThanol und lassen Sie die Probe 15 min. Protokoll vollständig trocknen kann hier gestoppt werden und Zellen, die bei-20 ° c gelagert trocknen für bis zu 3 Tage.
    3. Rehydrieren die Zellen mit PBS-Puffer für 15 min.
    4. Denature DNA mit 2 N HCl (Vorsicht) für 45 min bei RT und 3 Mal mit PBS waschen.
      Achtung: HCl ist ätzend. Geeigneten persönlichen Schutzausrüstung zu tragen und die ätzende Substanz zu entsorgen, wie institutionelle Umwelt Gesundheit und Sicherheit Verfahren angewiesen.
    5. Neutralisieren in 50 mM Tris-HCl pH 8,8 für 5 min gefolgt von 3 Wäschen mit PBS.
    6. Incubate Zellen in blocking-Puffer gemacht mit 5 % normalem Ziegenserum und 0,1 % Triton x-100 mit PBS-Puffer für 1 h bei RT.
    7. Inkubation mit Primärantikörpern für 8-Oxo-Winkel2-Deoxyguanosine (8-OxodG, 1: 400) oder Cyclobutan Pyrimidine Dimer (CPD, 1:1 000) in der Ziege Serum blockierende Puffer für 1 h bei RT und dann waschen mit PBS 3 x.
    8. Zellen mit Alexa 488 Ziege Anti-Maus in einem Verhältnis von 1: 2000 in der Ziege Serum blockierende Puffer für 1 h bei RT inkubieren und 3 Mal mit PBS waschen.
    9. Kern-DNA mit 1: 5.000 DAPI (10 mg/mL) mit PBS-Puffer für 5 min zu beflecken, und 3 Mal mit PBS waschen.
    10. Platzieren, wenn gekammerten Deckglas mit PBS oder PBS + 0,1 % Natriumazid zurück auf die gefärbten Zellen. Protokoll kann hier gestoppt werden und Zellen für mehrere Tage bei 4 ° c gelagert, oder fahren Sie zur Bildaufnahme in Abschnitt 5.
    11. Montieren Alternativ Zellen in bevorzugte Montage Medium, wenn eine zusätzliche Deckglas auf das Kulturgefäß platziert werden kann. Einmal ausgehärtet, können montierende Zellen bei 4 ° c für längere Zeit gelagert werden.

5. Bild-Übernahme für Immunfluoreszenz Experimente

  1. reinigen Sie die Unterseite Deckglas Kulturgefäß mit Ethanol und legen Sie sie wieder auf der Bühne confocal Mikroskop. Sicherstellen Sie, dass die Ausrichtung und Position des Schiffes auf der Bühne entspricht der Ausrichtung und Position aufgezeichnet, wenn Schäden induziert wurde. Das Kulturgefäß damit optimale Registrierung und Bildgebung zu sichern.
  2. Locate zuvor abgebildet Felder mithilfe der Registrierung Technik ausgewählt (beschrieben in 3.2).
    1. Für manuelle Registrierung mit einem Deckglas mit einem geätzten Raster, Raster in Fokus und Identifizierung von Markierungen finden zu bringen. Dann Verwendung aufgezeichnet XY-Koordinaten, beschädigte Zellen zu finden.
    2. Für die bildbasierte automatisierte Registrierung, suchen Sie das Strukturmerkmal als Referenz im Schritt 3.2.1 verwendet, und richten Sie dann die aktuelle live Mikroskop-Ansicht so eng, das aufgenommene Bild wie möglich. Sobald ausgerichtet, Messen Sie die aktuelle XY Mikroskop Bühne Position und vergleichen Sie es mit der XY-Position des Referenzbildes. Die Luftlinie zwischen den beiden Standorten definiert die X- und Y-Offset. Jede aufgezeichnete XY-Position zu identifizieren, die Bild-Felder, die bestrahlte Zelle enthält zuweisen Sie dieser Versatz. Dieser Offset Funktion in die Mikroskop-Steuerungs-Software automatisiert oder manuell durchgeführt werden.
    3. Wenn keine entsprechenden Registrierungspunkte identifiziert werden konnte, manuell suchen Zellen durch das Dia scannen und suchen die zuvor identifizierten Zelle Funktionen.
  3. Bilder mit entsprechenden Mikroskop Einstellungen um zu sammeln alle gefärbten Ziele, darunter ein Hellfeld-Bild (in Abschnitt 2.3 Einstellung und Fokussierung in Abschnitt 3.3) zu erwerben. In den vorgestellten Experimenten, Multichannel-Bilder wurden gesammelt, unter Verwendung der folgenden Erregung Laserlinien und Fluorophore: 405 nm (DAPI), 488 nm (Alexa 488 und übermittelten DIC Hellfeld) und 561 nm (Alexa 546). Alle Laser durchlaufen einen einzelnen akusto-optischen durchstimmbare Filter steuern die Übertragung von Laser-Wellenlänge und Leistung.

6. Live Bild Zellanalyse der Rekrutierung von fluoreszierenden Proteinen zu Mikro-bestrahlt Websites

  1. Open erwarb Bilder in einer Bild-Analyse-Anwendung (wie z. B. NIS Elemente oder ImageJ). Bei Bedarf kombinieren Sie das Bild vor Bestrahlung mit Zeitraffer Bilder um ein Einzelbild-Sequenz der Pre- und Post-Schaden-Induktion zu erzeugen. Benutzer können Rekrutierung durch die Messung von Veränderungen in Fluoreszenz Intensität über der bestrahlten Fläche im Verhältnis zu der Fluoreszenzintensität gemessen über den gesamten Kern zeigen (siehe Vertreter Resultate Abbildung 1 B. ).
  2. Für jede Zelle gemessen werden, zuerst erzeugen einen Verweis ROI, die den Kern darstellt. Verwenden Sie einen Schnittstellenüberwachung Algorithmus auf das Fluoreszenzsignal, das die Pixel, aus denen des Kerns enthält, und konvertieren Sie diesen Bereich in einen ROI. Bei Bedarf kann der ROI manuell gezeichnet werden, in das Hellfeld als Referenz verwenden. Anpassen den ROI über den zeitlichen Verlauf zu gewährleisten, die nukleare Bereich fällt genau unter den ROI, und der mittlere Fluoreszenzintensität das Fluoreszenzsignal innerhalb dieser ROI für jeden Frame zu melden.
  3. Für jede Zelle zu messenden erstellen einen 6 x 6 Pixel ROI und legen Sie es über den Schaden ROI für jeden Frame den zeitlichen Verlauf. Diese größeren ROI ist nun der Schaden ROI für die Analyse. Die mittlere ROI Fluoreszenzintensität für jeden Frame zu melden.
    Hinweis: Die meisten kommerziellen Bildanalyse-Software enthält Module für 2D Objektverfolgung, und es gibt eine Reihe von Benutzer entwickelten Makros für ImageJ oder Fidschi, die ermöglichen, schneller Workflow und höheren Durchsatz (siehe https://imagej.nih.gov/ij/plugins/).
  4. Normalisieren der mittleren Schaden ROI Fluoreszenzintensität der einen entsprechenden Verweis ROI in jedem Frame den Zeitraffer. Hier wird der mittlere nuklearen Fluoreszenzintensität als Referenz ROI verwendet (siehe Vertreter Resultate Abbildung 1). Normalisierung kann erfolgen durch Subtraktion des mittlere Verweis ROI Fluoreszenzintensität vom Mittelwert ROI Fluoreszenzintensität beschädigen oder durch die Aufteilung der Mittel beschädigen ROI Fluoreszenzintensität durch den mittleren Verweis ROI Fluoreszenzintensität.
    Hinweis: Normalisierung durch Teilung kann unvorhersehbare Ergebnisse erbringen, wenn in Situationen mit sehr geringer Intensität Referenzwerte verwendet.
  5. Wiederholen Sie für alle geschädigten Zellen sowie für mindestens zwei Kontrolle, unbeschädigten Zellen. Ergebnisse der Zelle können bei Bedarf für weitere Normalisierung verwendet.
  6. Graph normalisiert Intensitätswerte im Laufe der Zeit Veränderungen in der Rekrutierung Dynamik als Funktion der experimentellen Behandlung zeigen.

7. Bildanalyse der Protein-Rekrutierung durch Immunfluoreszenz nachgewiesen

  1. Open Pre- und Post-Schaden Bilder in einer Bild-Analyse-Anwendung. Die Pre-Schaden-Bilder enthalten den Schaden, den ROI(s) für Mikro-Bestrahlung eingesetzt. Die ROI(s) kopieren und Einfügen in die Post-Schaden-Bilder, gezielte Zellen zu identifizieren.
  2. Erzeugen einen 6 x 6 Pixel ROI für die Analyse von Protein-Rekrutierung und platzieren diese ROI an der Stelle des Schadens ROI. Diese größeren ROI ist nun der Schaden ROI für die Analyse. Melden Sie den mittleren Schaden ROI Fluoreszenzintensität.
  3. Normalisieren der mittleren Schaden ROI Fluoreszenzintensität der einen entsprechenden Verweis ROI. Hier wird der mittlere nuklearen Fluoreszenzintensität der geschädigten Zelle als Referenz ROI verwendet (siehe Vertreter Resultate Abbildung 1). Generieren Sie die Referenz ROI durch einen Schnittstellenüberwachung Algorithmus auf das DAPI-Signal um den Kern zu definieren und dann konvertieren Sie diesen Bereich um einen ROI. Die mittlere Referenz ROI Fluoreszenzintensität zu melden. Normalisierung kann erfolgen durch Subtraktion des mittlere Verweis ROI Fluoreszenzintensität aus der mittleren Schaden ROI Fluoreszenzintensität oder durch die Aufteilung des mittleren Schadens Fluoreszenzintensität ROI durch den mittleren Verweis ROI Fluoreszenzintensität.
    Hinweis: Normalisierung durch Teilung kann unvorhersehbare Ergebnisse erbringen, wenn in Situationen mit sehr geringer Intensität Referenzwerte verwendet.
  4. Wiederholen Sie für alle geschädigten Zellen, und führen Sie die gleiche Analyse auf mindestens zwei Kontrollzellen, wie oben beschrieben.
  5. Graph normalisiert Intensitätswerte für jede Mikro-Bestrahlung Veranstaltung gegen die Zeit, um Änderungen im Protein-Einstellung oder eine Art von DNA-Schäden als Funktion der experimentellen Behandlung gemessen.

Ergebnisse

Charakterisierung der induzierten DNA-Schäden
Induktion von base Läsionen und Strangbrüche ist abhängig von der Laser-Dosis angewendet auf den ausgewählten nuklearen Bereich und der zellulären Mikroumgebung des Modells Zelle verwendet7. Fluoreszierende Proteine verschmolzen zu reparieren Proteine, wie XRCC1, 53BP1, Ku70 oder Rad51, bieten nützliche Single und double strand Pause Marker für die Festlegung des minimalen Energiebedarfs Ansammlung eines fluoreszierenden Proteins innerhalb eines Schadens ROI oben sehen die Hintergrund Fluoreszenz9,19,31. Wenn Bedingungen, die eine Reaktion auslösen gefunden werden, ist es entscheidend, die Schaden-Mischung induziert durch die spezifischen Wellenlänge und Dosis zu charakterisieren. Dämpfung der Dosis und Dauer auf die verwendete Wellenlänge können die Benutzer, die Bildung von komplexen Schäden Mischungen zu minimieren. Niedrige Laser Dosen im Bereich von UV-A wurden nachgewiesen, um überwiegend SSBs und eine kleine Menge an base Läsionen, geeignet für das Studium SSBR und BER Wege10,28zu produzieren. Erhöhung der Dosis schafft komplexere Basis Läsionen, oxidative und UV-induzierte und induziert mehr bedeutende Zahlen von DSB7,10. Während die Induktion von einer einzigen Art von DNA-Schäden für die Prüfung von bestimmten DNA-Reparatur wegen wünschenswert ist, ist es wahrscheinlicher, dass Benutzer eine Mischung aus DNA-Läsionen mit einer bestimmten Läsion wie SSBs wird viel häufiger als Basis Läsionen oder DSB induziert werden. Dies ist vergleichbar mit DNA-Schäden Mischungen induziert durch chemische Stoffe wie Wasserstoffperoxid (H2O2) oder Methyl Methanesulfonate (MMS)32. Benutzer müssen sich bewusst sein, wenn sie berichten, Ergebnisse, die Mischungen beschädigen können auftreten, und vorsichtig Charakterisierung der Dosis und die Läsionen am Standort induzierte Schäden notwendig sind, um die Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu gewährleisten.

In Mikro-Bestrahlung Studien dient XRCC1-GFP oft als Marker für die Induktion von base Läsionen und SSBs9,28. XRCC1 ist ein Gerüst-Protein, das eine wichtige in SSB Reparatur (SSBR Rolle) und base Excision Reparatur (BER) und beteiligt sich auch an andere Reparatur-Wege, wie Nucleotide Excision Repair (NER)33,34,35 . Es spielt eine wichtige koordinierende Rolle DNA-Reparatur, Interaktion mit einer Reihe von wichtigen Proteinen, einschließlich poly(ADP-ribose) Polymerase 1 (PARP-1), DNA-Polymerase β (Pol β), und DNA-Ligase III. Wir nutzten XRCC1-GFP stabil in CHO-K1-Zellen exprimiert um festzustellen, die Laser-Dosen benötigt, um SSBs und DSB zu generieren. Wir haben zunächst die minimale Dosis erforderlich, um eine beobachtbare Rekrutierung von XRCC1-GLP für jede Wellenlänge (Abbildung 1) induzieren identifiziert. Für die 355 nm Wellenlänge erzeugt eine 2 s Verweilzeit über die definierten Schäden ROI eine erhöhte Fluoreszenzsignal innerhalb dieser ROI, unter Angabe der Induktions von DNA-Schäden, die über dem Hintergrund (Abb. 1A) nachweisbar war. Für 405 nm, ein 8 Bilder pro Sekunde-Scan-Rate war nötig, um eine beobachtbare Rekrutierung auf den Schaden ROI (Abb. 1A) zu generieren. Die Dosis wurde erhöht (10 s 355 nm und 0,5 fps für 405 nm) erstelle ich eine intensivere beschädigen ROI (Abb. 1A).

Rekrutierung und Bindung von XRCC1-GLP auf dem Gelände der verursachte Schaden wurde dann von Timelapse Bildgebung überwacht. Bindung des Proteins an der Stelle des DNA-Schäden kann laufend DNA-Reparatur, hinweisen, während Dissoziation des Proteins von der Website der induzierten Schäden oft einen Marker für die Fertigstellung des BER oder SSBR gilt. Allerdings gab es keine eindeutigen Beweise, die Verknüpfung der Dissoziation von XRCC1 von Laser-induzierten DNA-Schäden Websites mit dem Abschluss der Reparatur. Einstellung des Proteins an den Ort der Schädigung wird gemessen durch die Berichterstattung der mittlere Intensität der das Fluoreszenzsignal innerhalb der beschädigten ROI über das mittlere Fluoreszenzsignal für den gesamten Kern (Abbildung 1B) gemessen. Diese Art von Normalisierung hilft Adresse Intensitätsschwankungen im nuklearen Signal, obwohl andere Normalisierungstechniken können, abhängig von der zelluläre Verteilung des Proteins des Interesses eingesetzt werden. Hier ist XRCC1 im nuklearen Fach lokalisiert, so Normierung auf die nuklearen Bereich die Verteilung des Signals auf den Schaden ROI misst. Die ROI bedeuten fluoreszente Intensität wird dann für jedes Bild im Zeitraffer, einschließlich das Bild vor Schäden und grafisch dargestellt als Funktion der Zeit (Abbildung 1C) aufgezeichnet.

Wir zeichnen dann weiter den Schaden induziert durch die zwei ausgewählten Laser-Dosen, die Bildung von DNA-base-Läsionen zu untersuchen. Erstens war Bildung von CPD, eine sperrige UV-induzierten Läsion durch Immunfluoreszenz als Marker für NER Typ Läsionen (Abbildung 2A) sondiert. Dann wurde die oxidativ induzierte Basis lesion8-OxodG als Marker für BER Typ Läsionen (Abbildung 2B) sondiert. Keine signifikante Zunahme der CPD Läsionen wurden bei der niedrigen Dosis Exposition für beide Wellenlängen beobachtet (2 s 355 nm und 8 Bilder pro Sekunde für 405 nm), während die hohe Dosis Behandlung bei beiden Wellenlängen (10 s 355 nm und 0,5 fps für 405 nm) zeigten eine deutliche Steigerung in fluoreszierenden Signal innerhalb des Schadens ROI (Abb. 2A) beobachtet. Ein Streudiagramm der CPD ROI bedeuten Intensität für jede geschädigte Zelle zeigt Heterogenität bei Schäden Entstehung und Erkennung bei Wellenlängen und Dosen, darauf hinweist, dass ein niedriges Niveau der CPD Läsionen kann bei niedrigeren Dosen vorhanden sein, aber die Last möglicherweise nicht deutlich erkannt, bis eine höhere Dosis angewendet wird. Das Streudiagramm zeigt auch diese Ineffizienz in Antikörpernachweis, die genaue Quantifizierung der Schäden Mischungen beschränken können.

Dies wird durch die Markierung 8-OxodG bei der Erkennung von oxidativ induzierten DNA-Läsionen unterstrichen. Keine deutliche Steigerung Fluoreszenzsignal innerhalb der Schaden wurde ROI für 8-OxodG Laser-Wellenlänge oder verwendete Dosis (Abbildung 2B) beobachtet. Der Antikörper verwendet für diese Arbeit steht im Einklang mit früheren Veröffentlichungen9,10,36; Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass es Einschränkungen bei der Beobachtung der Bildung von 8-OxodG mit Antikörpern37,38geben kann. Bestätigung des Mangels an oxidativ induzierte Läsionen empfiehlt sich auch durch eine zweite Markierung, wie Rekrutierung von 8-Oxoguanine DNA-Glycosylase (OGG1), das Enzym zur Entfernung von 8-OxodG von der DNA-10. Wir beobachteten OGG1 Rekrutierung unserer DNA-Schäden Seiten; jedoch kann nicht die Bildung von geringen Mengen von oxidativ induzierten DNA-Schäden vollständig ausgeschlossen werden.

Zu guter Letzt haben wir untersucht die Bildung des DSB mit zwei Markierungen, γH2AX und 53BP-1, bei der passendesd Laser Dosen durch Immunfluoreszenz (Abbildung 3 & 4). ΓH2AX wird häufig als Strang Pause Marker verwendet, aber seine Spezifität für DSB wurden in einer Reihe von Berichten39,40in Frage gestellt. Darüber hinaus ist es eine Phosphorylierung-Ereignis, das von der Strang Pause Website propagiert, so Lokalisierung des Signals zu einem Strang Bruch aufgrund dieser Signallaufzeiten begrenzt sein kann. Daher ermöglicht die Kombination von γH2AX mit 53BP-1 für eine genauere Beurteilung der DSB Bildung innerhalb des Schadens ROI.

Die Beantwortung von γH2AX und 53BP-1 Mikro-Bestrahlung ist Wellenlänge und dosisabhängig. Die niedrige Dosis (2 s) Stimulation bei 355 nm entlockt keine Antwort bei 5-20 min und eine schwache und Variable Antwort 10 min Post Bestrahlung(Abbildung 3)für beide Marken. Die hohe Dosis (10 s) von 355 nm Mikro-Bestrahlung induziert eine erhöhte Fluoreszenzsignal innerhalb der Schaden ROI auf 5, 10 und 20 min Post Bestrahlung, die bei 40 min (Abbildung 3B) reduziert wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sorgfältige Titration von 355 nm-Dosis ist erforderlich, um Kreuz-Stimulation der Reparatur Wege zu minimieren, wie gezeigt durch den reduzierten Nachweis der Doppelstrang Pause Marker γH2AX zu den frühen Zeitpunkten (< 20 min) in der niedrigen Dosis angewendet.

Ähnliche Experimente wurden mit niedrig (8 Bilder pro Sekunde) und hohe Dosis (0,5 fps) 405 nm Laser Stimulation (Abbildung 4) durchgeführt. Bei dieser Wellenlänge beobachtet signifikante Häufung von Fluoreszenz Intensität innerhalb des Schadens ROI für 53BP-1 und γH2AX unabhängig von der angewendeten Dosis, darauf hinweist, dass diese Dosen ein komplexes Gemisch von Einzel- und Doppelzimmer Strangbrüche fast generieren unmittelbar nach der Induktion von DNA-Schäden (Abbildung 4). Darüber hinaus erschwert die hohen Dosen von 405 nm zeigen eine Zunahme der Pan-nuklearen γH2AX Färbung innerhalb von 10 min der Schaden Induktion (Abbildung 4B, unten), die Schadenserkennung ROI zu berichten, während die 53BP-1-Ansammlung ist mehr in den Schaden ROI enthalten.

Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass 405 nm Mikro-Bestrahlung nicht geeignet zur Überwachung von SSBR oder BER ist, und dass mehrere Marker für die DNA-Addukten und strand Pausen eingesetzt werden, sollte um die induzierte Läsionen und DNA-Reparatur Antworten vollständig zu charakterisieren.

Dosis-abhängige Änderung der Rekrutierung und Bindung von XRCC1-GFP
Sobald die induzierte DNA-Schäden charakterisiert worden ist, kann Mikro-Laserbestrahlung eine ideale Plattform für die Untersuchung der Dynamik des DNA-Reparatur-Proteine werden. Die Aufbewahrung und Dissoziation Kinetik der XRCC1-GFP zeigt eine Dosisabhängigkeit (Abbildung 1), die nicht unerwartet die Induktion von verschiedene Schäden Mischungen von jeder Wellenlänge gegeben ist. Die höchste Einstrahlung Dosen (10 s und 0,5 fps) zeigen eine höhere Intensität Rekrutierung von XRCC1-GFP im Verhältnis zu den niedrigeren Dosen und längerer Verweildauer der XRCC1-GLP am Ort der Schädigung im Laufe 20 min Zeit (Abbildung 1C). Dies bedeutet, dass die DNA-Schäden, die bei höheren Dosen für 355 und 405 nm erstellt dürfte nicht gelöst, im Verlauf des Experiments, die im Einklang mit der Erscheinung und Aufrechterhaltung der DSB Marker, γH2AX und 53BP-1 (Abbildungen 3 & 4 ).

Interessanterweise zeigen die niedrigeren Schaden-Dosen (2 s und 8 Bilder pro Sekunde) schnelle Rekrutierung von XRCC1-GFP zu Schaden-Websites und Dissoziation der XRCC1-GLP experimentelle Zeit Laufe vor Bestrahlung Ebenen (Abbildung 1C). Ohne die vollständige Charakterisierung der Schaden Mischung kann dies zu dem Schluss führen, dass SSBs und base Läsionen mit diesen schädlichen Bedingungen vollständig gelöst sind. Jedoch das Vorhandensein von γH2AX und 53BP-1 bei 40 min für 355 nm und 5 Minuten für die 405 nm kann zu unterschiedlichen Interpretationen führen. Für die 355 nm 2 s Dosis möglicherweise Schaden Mischung überwiegend SSBs, so dass das Aussehen der DSB-Marker bei 40 min angeben kann, dass einige unrepariert Läsionen zum DSB führen können oder dass DSB durch diese Energie erzeugt auf einer längeren Zeitskala repariert werden. Skala Zeitunterschiede zwischen SSBR und DSB-Reparatur wurden bisher gemeldeten28,41,42. In gleicher Weise 405 nm niedrigdosierte (8 Bilder pro Sekunde) Dissoziation deutet auf ein niedriges Niveau der SSBs oder Mikro-Bestrahlung und andere DNA Beschädigung Agenten schädigen ein clustering von SSBs, die schnell, DSB, umgewandelt werden, die für hohe gemerkt worden ist bisher43, 44 , 45.

Zusammen diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Charakterisierung der induzierten Schäden Mischungen und Nutzung mehrerer DNA Reparatur Proteine und Markierungen für die Interpretation der Rekrutierung und Bindung von DNA Reparatur Proteine an den Standorten des verursachten Schadens.

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Abbildung 1 . Mikro-Laserbestrahlung induziert Rekrutierung von XRCC1-GFP. 
(A) CHO-K1 Zellen stabil auszudrücken XRCC1-GFP wurden bestrahlt und abgebildet vor und unmittelbar nach Schaden Induktion. Pfeile zeigen die Position des Mikro-Bestrahlungsdosis und Maßstabsleiste ist 10 µm. (B) Rekrutierung wird gemessen, indem die mittlere Fluoreszenz Intensität innerhalb des Schadens ROI Ermittlung und Normalisierung der mittlere fluoreszierende Intensität des gesamten Kernes. (C) Dynamik der Rekrutierung kann für jedes Timelapse-Bild gemessen werden. Graphen sind Vertreter von zwei unabhängigen Experimenten mit Fehlerbalken repräsentieren die SEM (n = 24). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 2 . Mikro-Laserbestrahlung induziert Nukleotid Schaden. 
CHO-K1 Zellen wurden um zu laser-Mikro-Bestrahlung ausgesetzt und sofort nach Induktion der Schaden behoben. Immunfluoreszenz wurde durchgeführt, um die CPD erkennen und 8-OxodG Addukte. (A) oben, Streudiagramm der ROI bedeuten Fluoreszenz Intensität beobachten geschädigte Zellen nach der CPD Färbung. Unten, repräsentative Bilder der CPD Färbung. Pfeile zeigen die Lage der Mikro-Bestrahlung und der Maßstab ist 10 µm (n = 12). (B) repräsentative Bilder für 8-OxodG Färbung. PfeileGeben Sie die Position der Mikro-Bestrahlung und der Maßstab ist 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 3 . DNA-Doppelstrang Pause Markern reagieren auf 355 nm Mikro-Bestrahlung in einer Dosis-abhängigen Weise. 
CHO-K1-Zellen wurden Mikro-Bestrahlung ausgesetzt und auf die Zeit Punkte angegebene Post-Stimulation. Immunfluoreszenz für die DSB-Marker-γH2AX und 53BP-1 wurde durchgeführt. (A) scatter Plot normalisierte Beschädigung ROI Fluoreszenz-Intensität gemessen für unbeschädigt und beschädigte Zellen bedeuten. Fehlerbalken sind repräsentativ für die SEM (n = 12). (B) repräsentative Bilder für γH2AX und 53BP-1 zu beflecken. Pfeile zeigen die Lage der Mikro-Bestrahlung und der Maßstab ist 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 4. DNA-Doppelstrang Pause Markern robust auf 405 nm Mikro-Bestrahlung reagieren.
CHO-K1 Zellen wurden Mikro-Bestrahlung ausgesetzt und die Zeit Punkte angegebenen Post Stimulation festgesetzt. Immunfluoreszenz für die DSB-Marker-γH2AX und 53BP-1. (A) scatter Plot normalisierte Beschädigung ROI Fluoreszenz-Intensität gemessen für unbeschädigt und beschädigte Zellen bedeuten. Fehlerbalken sind repräsentativ für die SEM (n = 12). (B) repräsentative Bilder für γH2AX und 53BP-1 zu beflecken. Pfeile zeigen die Lage der Mikro-Bestrahlung und der Maßstab ist 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Mit den beschriebenen Bedingungen hier, kann jede confocal Mikroskop mit einer UV-A oder 405 nm Laser, entweder vom Hersteller integriert oder durch den Endbenutzer hinzugefügt DNA-Schäden im Zellkern einer Zelle zu induzieren und erlauben die Einstellung von DNA-Reparatur-Proteine auf der Website von induzierten DNA-Schäden kontrolliert werden. Jedoch wie erwähnt im Protokoll und repräsentative Ergebnisse, Wellenlänge Auswahl angewendet macht, und Schaden Charakterisierung sind wichtige Themen, die vom Benutzer zuerst angegangen werden müssen, um eine spezifische DNA Studie Weg zu reparieren. Darüber hinaus gibt es weitere Überlegungen in experimentellen Design, das auch von Benutzern geprüft werden muss.

Um ein Protein Verhalten in lebenden Zellen Post überwachen muss Mikro-Bestrahlung, ein Eindringmittel beschrifteten Protein erstellt werden. Die Verfügbarkeit einer breiten Palette von fluoreszierenden Proteinen, die spektral getrennt werden können bietet Werkzeuge für die Erstellung von Protein-Fusionen, die verwendet werden können, für die Charakterisierung von zellulärer Reaktionen auf die Induktion von DNA-Schäden. Transiente Transfektion von fluoreszierenden Proteinen von Interesse ermöglicht schnelle Screening von schädlichen Bedingungen, Mutationen oder sogar Inhibitoren, während stabil transfizierte Zellen bieten mehr Kontrolle über Ausdruck Niveaus und ermöglichen anderen biochemischen Charakterisierungen ausgeführt werden soll, Mikro-Bestrahlung Ergebnisse validieren. Spektral unterschiedliche fluoreszierende Proteine können auch in der gleichen Zelle Interaktionen zwischen Proteinen innerhalb der gleichen Weg oder in verschiedene Wege überwachen genutzt werden. Fluoreszierende Proteine auch die Notwendigkeit spezifischer Antikörper für jedes Protein des Interesses und live Zelle überwachen Protein Verhalten für längere Zeit nach der Induktion der Schäden.

Die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen hat jedoch auch Nachteile. Ohne genetische Hintergründe einen Mangel an die Aktivit‰tderzur von Interesse werden das Eindringmittel tagged Proteine körpereigene Proteine mithalten. Konjugation des fluoreszierenden Tags an den N oder C-Terminus des Proteins kann ändern, Proteinfaltung, wichtige Protein-Protein-Wechselwirkungen zu behindern oder zu blockieren Translokation Signale; Funktion zu verändern und möglicherweise Auswirkungen auf die Rekrutierung Dynamik. Diese Effekte wurden in einer Reihe von Berichten nachgewiesen, wo immunofluorescent Färbung dramatisch anders Rekrutierung und Retentionszeiten für körpereigene Proteine Schaden Seite28unter Beweis gestellt. Verwendung von transiente Transfektion oder stabile Klone kann auch die Reaktion beobachtet, in der Regel durch Variationen in Proteingehalte Ausdruck ändern. Darüber hinaus kann die Verwendung von mehreren fluoreszierende Proteine in einem einzigen Experiment auch die Dynamik der Rekrutierung, ändern wenn Proteingehalte nicht gut equilibriert sind oder Einstellung des größeren Fluoreszent-tagged Proteins die Rekrutierung anderer Proteine blockiert . Zu guter Letzt können fluoreszierende Proteine als schwache Sensibilisierung Agenten, erhöht die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies und möglicherweise verändern die DNA-Schäden Mischungen induzierte46,47fungieren. Trotz dieser Nachteile bieten fluoreszierende Proteine eine Reihe von Vorteilen im Studium DNA zu reparieren, mit Mikro-Bestrahlung, und wenn Benutzer entsprechende Steuerelemente, z. B. die Schäden Charakterisierung, die hier beschrieben wird, integrieren sie bieten neue Einblicke in Schaden Reaktion und Proteinprotein Interaktionen3.

Wenn live Cell Imaging nicht erforderlich ist, kann Immunfluoreszenz verwendet werden, um die Reaktion auf induzierte Schäden zu überwachen. Durch die Festsetzung von Zellen zu bestimmten Zeiten post Schaden Induktion und Färbung mit Antikörper spezifisch für Proteine und Läsionen, statische Momentaufnahmen der Schaden Induktion und die Rekrutierung und Bindung von Reparatur, die Proteine aufgebaut werden können. Antikörper können verwendet werden, um die Rekrutierung von mehreren Proteinen Interesse und/oder post-translationalen Modifikationen durch die DNA-Schäden-Reaktion induziert zu überwachen. Verwendung von Immunfluoreszenz eliminiert die Notwendigkeit für fluoreszierende Proteine und ermöglicht eine endogene Protein Verhalten untersucht werden. Diese Methode hat jedoch auch seine Nachteile. Hochspezifische Antikörper sind notwendig und Permeabilisierung und blockierende Verfahren müssen optimiert werden, um eine Erkennung der Rekrutierung mit ausreichender Signalstärke ermöglichen. Befestigung Verfahren werden nicht sofort ausgeführt, und diese körperliche Einschränkung schränkt die zeitliche Auflösung dieses Ansatzes. Ortsbild des Schadens Induktion zuordnen, so dass Zellen nach dem färben wieder entfernt werden können, kann auch erhebliche Herausforderungen darstellen. Confocal Mikroskop, die in dieser Arbeit verwendeten ermöglicht Image-basierte Anmeldung wie oben beschrieben, also geschädigte Zellen mit hoher Präzision verlegt werden können. Wenn Bühne Registrierung oder geätzten Deckglas nicht zur Verfügung, die Zeit ist, die Investitionen beteiligt können versetzten Zellen ohne Bühne Registrierung, gepaart mit der inhärenten Verzögerung zwischen Schaden Induktion und die abgebildeten Rekrutierung Immunfluoreszenz machen. für einige Nutzer unattraktiv. Jedoch werden die genaue und vollständige Mikro-Bestrahlung experimentellen Designs derartiger Ansätze parallel mit der Verwendung von fluoreszierenden Proteinen enthalten, wie in dem vorgestellten Protokoll beschrieben.

Hier wird live Cell Imaging und Immunfluoreszenz verwendet, um das Dienstprogramm von Mikro-Laserbestrahlung zu demonstrieren. Immunofluorescent Färbung ermöglicht es uns, die Mischung von DNA-Schäden erstellt genau zu untersuchen und die Rekrutierung von Proteine induziert durch jede Laserleistung, die es uns, besser ermöglichen interpretieren die beobachteten Veränderungen in der Rekrutierung und Bindung von XRCC1-GFP. Basierend auf diesen Ergebnissen, sollte die Verwendung von 405 nm Laser zur Untersuchung von Proteinen, BER und SSBR beschränken. Darüber hinaus die optimale Versuchsplanung wären Leistungsmessungen nach dem Ziel, einen vollen Schaden Mischung Charakterisierung für jede Zelllinie verwendet und Validierung der Rekrutierung und Aufbewahrung in Gewebekulturen beobachtet getaggt Proteine mit Immunfluoreszenz. Offensichtlich, Ausrüstung, Zeit und Kostengründen diese optimalen experimentellen Designs nicht mehr können für einige Benutzer. Jedoch gezeigt, wie wichtig jedes dieser Elemente ist hier, und Benutzer sollten diese Überlegungen im Hinterkopf behalten, wenn Mikro-Bestrahlung Experimente ab.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren möchte Dr. Samuel H. Wilson an der National Institute of Environmental Health Sciences für die Zell-Linien, die in dieser Arbeit verwendet.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Nikon A1rsi laser scanning confocal microscopeNikon
NIS Elements softwareNikon
355 nm laserPicoQuant VisUVRadiation source
Galvanometer photoactivation miniscannerBruker
Microscope slide photodiode power sensorTHORLabsS170C
Fiber photodiode power sensorTHORLabsS150C
Digital handheld optical power and energy meterTHORLabsPM100D
CHO-K1From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS
Minimal essential mediaHycloneSH3026501
Fetal bovine serumAtlanta biologicalsS11550
XRCC1-GFPOrigeneRG204952
JetprimePolyplus transfection11407
GeneticinThermoFisher10131035
4 chambered coverglassThermoFisher155382
8 chambered coverglassThermoFisher155409
Anti 53BP-1NovusNB100304
Anti-phospho-histone H2AX Millipore05-636-I
Anti cyclobutane pyrimidine dimerCosmo Bio cloneCAC-NM-DND-001
Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine Trevigen4354-MC-050
Alexa 488 goat anti-mouseThermoFisherA11029
Alexa 546 goat anti-rabbitThermoFisherA11010
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)ThermoFisherR37606Caution toxic!
Phosphate buffered salineThermoFisher0780
Normal goat serumThermoFisher31873
Bovine serum albumin (BSA)Jackson Immuno Research001-000-162
37% FormaldehydeThermoFisher9311Caution toxic!
EthanolDecon Labs2716
MethanolVWRBDH1135Caution toxic!
HClFisherSA49
Sodium azideSigma-AldrichS2002Caution toxic!
Tris HydrochlorideAmrescoO234
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

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