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Résumé

Confocal fluorescence microscopie et laser micro-irradiation offre des outils pour induisant des dommages à l’ADN et le suivi de la réponse des protéines de réparation d’ADN dans certaines zones Sub nucléaires. Cette technique a grandement avancer nos connaissances sur la détection des dommages causés, de signalisation et de recrutement. Ce manuscrit montre ces technologies afin d’examiner la réparation de rupture de brins simples et doubles.

Résumé

Voies de réparation de l’ADN hautement coordonnées existent pour détecter, excise et remplacer les bases de l’ADN endommagés et coordonnée de la réparation des ruptures de brins d’ADN. Alors que les techniques de biologie moléculaire ont clarifié la structure, les fonctions enzymatiques et cinétique des protéines de réparation, il y a toujours un besoin de comprendre comment la réparation est coordonnée au sein du noyau. Micro-irradiation laser offre un outil puissant pour induire des dommages à l’ADN et surveiller le recrutement des protéines de réparation. Induction de dommages à l’ADN par laser micro-irradiation peut se produire avec une gamme de longueurs d’onde, et utilisateurs fiable peuvent induire des cassures monocaténaires, lésions base et double brins avec un éventail de doses. Ici, les micro-irradiation laser est utilisé pour examiner réparation des simples et doubles brins induites par deux communes confocal laser longueur d’onde, 355 nm et 405 nm. En outre, bonne caractérisation de la dose appliquée laser pour induire des mélanges dommage spécifique est décrite, donc de façon reproductible les utilisateurs peuvent effectuer analyse et acquisition de données micro-irradiation laser.

Introduction

Microscopie de fluorescence est devenue une technique puissante pour visualiser l’architecture cellulaire, examiner la localisation des protéines et surveiller les interactions protéine-protéine et protéine-ADN. Par microscopie fluorescente pour étudier les réponses de dommages de l’ADN après l’application de l’ADN global endommageant des agents, tels que les ultraviolets (UV), des rayonnements ionisants, oxydants chimiques ou agents alkylants et/ou agents chimiothérapeutiques a donné un aperçu nouveau l’initiation, de signalisation et le recrutement de l’ADN réparation des protéines vers des sites de l’ADN des dommages1,2. Toutefois, ces mondiaux et endommageant les événements asynchrones sont limitatifs, si des informations détaillées sur l’ordre de recrutement, de la cinétique de l’association ou la dissociation, et les relations entre les principales protéines de réparation d’ADN sont recherchées. Heureusement, les progrès dans les microscopes confocaux à balayage laser, plus large disponibilité d’induisant des dommages longueurs d’onde du laser et des améliorations en protéines fluorescentes au cours des 25 dernières années ont fourni chercheurs avec des outils améliorés pour l’examen de ces aspects de l’ADN réparation, grâce à l’induction de dommages à l’ADN ciblée.

L’irradiation des cellules avec laser micromadriers afin d’étudier les fonctions cellulaires et subcellulaires est un outil bien établi dans la cellule et rayonnement biologie3. Application de cette technique à l’étude de la réparation de l’ADN a émergé lorsque Cremer et collègues de travail utilisé un UV très axée (257 nm) système microfaisceaux laser pour induire des lésions de l’ADN sur un spot dans l’ovaire de hamster chinois (CHO) de 0,5 µm cellules4 et établi l’induction de ADN photolesions par ce système5. Tout en offrant des améliorations significatives par rapport aux méthodes microfaisceaux UV dans le temps, l’adoption de la présente endommageant le système a été limitée en raison de son spécialisés mis en place et son incapacité à générer des doubles brins (CDB)6. L’enquête subséquente d’une variété d’UVB (290-320 nm) et UV-une longueur d’onde (320-400 nm) par un certain nombre de groupes ont révélé que les photoproduits UV, oxydation fondent des lésions, simples brins (BSN) et CDB peut être induite dépend de la longueur d’onde du laser et sous tension4,7,8,9,10 (évaluée à 3). En outre, des combinaisons de ces UV-B et UV-A longueurs d’onde avec sensibilisation des agents, comme le psoralène, bromodéoxyuridine (BrdU) et des colorants de Hoechst, ont également été trouvés à induire des lésions de l’ADN dépend de la longueur d’onde et de puissance, durée de l’exposition, si la puissance nécessaire pour induire des dégâts est souvent abaissé en présence de ces agents11,12,13,14,15. Ces progrès étendu l’utilisation du micro-irradiation, s’il y avait des obstacles encore techniques à résoudre pour la généralisation de ces méthodes.

Cremer et ses collaborateurs ont grandement avancer le domaine de la micro-irradiation en ciblant précisément le microfaisceaux UV pour appliquer l’énergie néfaste importantes sur une zone très localisée dans la cellule. Microscopes confocaux et systèmes de microdissection laser avancée, lumière ciblé a été plus largement accessible ; Toutefois, les sources UV de couplage aux étendues et traitant les aberrations chromatiques, qu'ils induisent toujours présenté des défis importants pour la plupart utilisateurs3,6,16. Comme les colorants traceurs gagné en popularité dans les années 1990, optique capable de se concentrer et capture fluorescence UV et excités devenue plus largement disponible16et améliorations à balayage laser offert aux utilisateurs la possibilité de créer très concentré UV taches d’excitation au sein de cellules6,17. Cependant, ce n’est que le début des années 2000 que l’impact réel de cette combinaison de poutres ciblés avec des lasers d’intensité plus élevées a été estimé, lorsque de nombreux rapports ont émergé démontrant que les ruptures de brins d’ADN peuvent être induites avec et sans sensibilisants dans le UV-A rang6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26et même à plus la longueurs d’onde visibles comme 488 nm27. Ces progrès autorisés pour l’adoption plus généralisée de la technique de micro-irradiation sur un certain nombre de systèmes commerciaux. Parallèlement à ces développements, techniques de deux photons également émergé qui a permis à induction précise des lésions de l’ADN ; même si ces progrès ne seront pas abordés ici, il y a un certain nombre d’articles de revue traitant ces méthodologies9,28,29,30.

Avec l’accessibilité actuelle des microscopes confocaux capables d’apporter fortement focalisé de lumière UV et de la disponibilité répandue de protéines fluorescentes pour permettre un suivi en temps réel des protéines de réparation de l’ADN, sont devenus des techniques micro-irradiation outils puissants pour l’examen ADN dommages réponse et la réparation des voies. Toutefois, les utilisateurs doivent être conscients que la génération de dommages à l’ADN est fortement tributaire de la longueur d’onde du laser et la force appliquée à la région sub nucléaire. Utilisation d’UV-C (~ 260 nm) longueurs d’onde permettent l’excitation directe de l’ADN et une sélectivité élevée pour l’induction de l’UV photoproduits7,8. UV-B et les longueurs d’onde UV-A produisent des mélanges de dommages à l’ADN (lésion base, SSBs et CDB), dépendant de la puissance appliquée et l’arrière-plan cellulaire utilisé7. Photosensibilisateurs endogènes et anti-oxydant chez les cellules ciblées peuvent influer sur les mélanges de dommages d’ADN produites par ces longueurs d’onde. En outre, l’utilisation de photosensibilisateurs exogènes (BrdU, etc.) peut-être aider à réduire l’énergie nécessaire pour l’induction de dommages à l’ADN. Toutefois, ces agents peuvent induire des lésions de l’ADN par eux-mêmes, et ils peuvent modifier le cycle cellulaire et structure de la chromatine, donc leur utilisation peut entraîner des effets indésirables qui doivent être prises en considération par l’utilisateur. Avant d’utiliser le micro-irradiation pour étudier la réparation et réponse aux dommages de l’ADN, un examen attentif de la voie de réparation d’ADN d’intérêt, les longueurs d’ondes disponibles pour l’utilisation et le mélange de dommages d’ADN créé est donc requis.

Ici, les micro-irradiation laser est effectué à deux longueurs d’onde couramment utilisés, 355 nm et 405 nm, sans sensibilisants pour démontrer les mélanges des lésions de l’ADN induite par ces longueurs d’onde et les influences de ces mélanges de dommages ont sur l’examen de la réparation deSSBs et CDB. les utilisateurs doivent être conscients que ces longueurs d’onde ne créent pas une seule espèce de brins ou de lésions de base. Afin de distinguer les voies de réparation de l’ADN, les utilisateurs doivent soigneusement contrôle la puissance appliquée sur une région spécifique du noyau et caractériser les dommages provoqués à l’aide de plusieurs marqueurs de rupture de brin et les anticorps de lésion de l’ADN. Si correctement appliqué et caractérisés, micro-irradiation laser peut enrichir certaines espèces de dommages à l’ADN, permettant aux utilisateurs d’évaluer la réparation des lésions de base et BSN ou BDB, avec une certaine spécificité. Par conséquent, nous avons fourni une méthode permettant aux utilisateurs d’effectuer des micro-irradiation laser reproductible, caractériser les mélanges de dommages d’ADN induites par la dose appliquée laser et effectuer des analyses de données.

Protocole

1. Culture cellulaire et la génération de cellules stables

  1. cellules CHO-K1 grandir dans un milieu minimum essentiel additionné de sérum de veau fœtal 10 %. Maintenir les cellules dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO 2 à 37 ° C.
  2. Cellules CHO-K1 transfecter avec 1 µg d’ADN de plasmide contenant XRCC1 humaine avec un C-terminal vert tag protéine fluorescente (GFP), utilisant un réactif de transfection commercial suivant le fabricant ' instructions de s.
  3. CHO-K1 sélectionnez cellules exprimant de manière stable la fusion XRCC1-GFP humaine à l’aide de 800 µg/mL G418 et enrichir la population se déclarant XRCC1-GFP utilisant la fluorescence assistée par cellule triant (FACS).
  4. Plaque cellules micro-irradiées dans les récipients de culture à fond couvre-objet, afin qu’ils atteignent environ 75 % ou plus grande confluence le lendemain. Quelques espaces entre les cellules sont souhaitables, en particulier si vous l’utilisez enregistrement pour revenir sur le terrain même de l’image (décrit dans la section 3.2).

2. Configuration de microscope

  1. Select un laser scanning microscope confocal équipé de lasers adaptés et optique et logiciel de contrôle pour micro-irradiation/photostimulation. Utilisation d’expériences a présenté un laser scanning microscope confocal qui a été modifié pour inclure un laser à 355 nm, fibre-couplée à une miniscanner de photoactivation galvanomètre et contrôlé en utilisant le fabricant ' logiciel de contrôle et d’analyse de s. Ce système peut exécuter micro-irradiation dans une région désignée à l’utilisateur d’intérêt (ROI) à l’aide de la miniscanner de photoactivation (laser à 355 nm) ou le galvanomètre confocal standard (laser à 405 nm).
  2. Sélectionner la longueur d’onde à utiliser pour les micro-irradiation, veiller à ce que tous les composants optiques dans le chemin optique micro-irradiation conviennent à la longueur d’onde choisie.
    Remarque : Le système présenté utilise un objectif à immersion d’huile 40 × C-Apochromat (ouverture numérique (NA) 1.2) avec un cube de filtre UV pour 355 nm micro-irradiation et un objectif sec de 20 × C-Apochromat (NA 0,75), en utilisant le standard lightpath confocal pour 405 nm micro-irradiation. L’objectif de 20 × utilisé dans l’installation n’est pas compatible avec la longueur d’onde 355 nm ; C’est pourquoi nous avons utilisé le × 40 pour 355 nm seulement. En utilisant l’objectif sec pour endommager permet à des protocoles d’immunofluorescence à appliquer en aval sans le nettoyage huile d’immersion, c’est pourquoi nous utilisons cet objectif lorsque cela est possible.
  3. Configurer le microscope pour l’expérience de micro-irradiation. Pour maintenir la cohérence entre les expériences, désigner une configuration normalisée des composants à utiliser pour chaque type de micro-irradiation microscope. Enregistrer ces paramètres comme un preset dans le microscope ' s d’utilisation de logiciel, si possible.
    Remarque : Dans le système présenté, les cellules sont micro-irradié et imagés à l’aide de balayage unidirectionnel, une résolution de numérisation de 1024 x 1024 pixels avec 1 x zoom scan, à une cadence de 8 images par seconde (fps) et avec le trou d’épingle la valeur environ 4 unités aérées (UA), comme déterminé pour le laser à 488 nm (69 µm). Ce paramètre de sténopé ouvert a été choisi pour maximiser la quantité de lumière capturée dans chaque image, permettant l’utilisation de l’imagerie laser pouvoirs inférieure et en réduisant le photoblanchiment.

3. Micro-irradiation au laser

  1. Place le prêt de Petri, contenant des cellules d’intérêt, sur la platine du microscope et la fixer solidement.
    1. Si possible, placez chambré dans un incubateur à stade-dessus et maintenir à 37 ° C, avec 5 % de CO 2 pendant l’induction de dommages. Cette étape est plus importante pour les cellules vivantes timelapse imaging ou imagerie longues séances. Sinon sur le microscope, les cellules de lieu étape et effectuer l’irradiation à température ambiante (~ 25 ° c) et ensuite revenir rapidement les cellules dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO 2.
  2. Registre de champs d’image pour permettre au chercheur de retourner au même endroit après avoir effectué la fixation, la coloration ou autres procédures. Effectuer l’enregistrement des champs endommagés à l’aide d’une platine du microscope codé, automatisé ou récipients de culture couvre-objet avec une grille gravée ou marquée de lieux XY de cellules.
    1. Si en utilisant le logiciel d’enregistrement image, sélectionnez une caractéristique reconnaissable du récipient de culture (c'est-à-dire, l’angle de la lamelle ou la barrière entre les loges), recueillir une image et enregistrer l’emplacement de XY. Cela permettra d’alignement et d’enregistrement des emplacements des champs sélectionnés suivant la préparation des échantillons XY.
    2. Si vous utilisez enregistrement manuel, enregistrer grille ou gravés emplacements pour chaque champ manuellement, en prenant soin d’inscrire l’orientation et le placement du plat sur la scène.
    3. Si aucune caractéristiques d’identification pour les récipients de culture de cellule ne sont disponibles, identifiez les champs endommagés par une inspection visuelle de la morphologie cellulaire et de la densité. Prenez soin de sélectionner les champs avec des caractéristiques suffisamment distincts pour être reconnaissable pendant plus tard imaging.
      Remarque : Cela peut être beaucoup de temps à effectuer à moins que l’orientation et la zone du navire culture est étroitement limitée.
  3. Sélectionnez un champ pour micro-irradiation et concentrer l’échantillon. Pour les cellules exprimant des protéines fluorescent étiquetés, sélectionnez le plan focal avec la section maximale du nucléaire dans le chenal fluorescent d’intérêt. Pour les cellules n’exprimant ne pas étiqueté protéines, ou pour ceux sans localisation nucléaire clair, contraste de phase ou d’imagerie (DIC) de contraste interférentiel différentiel peut être utilisé pour trouver le plan focal correct.
    ​ Remarque : une fonction utile de contraste de phase et l’imagerie de la DIC est le fait que, comme le plan focal se déplace à travers l’échantillon, la même fonctionnalité peut apparaître clairs ou foncés selon le plan focal relatif.
    1. Sélectionnez une fonction claire dans le noyau, comme un nucléole et le plan focal monter et descendre tout en observant ce changement en apparence. Le vrai plan focal resteront dans la transition de la lumière à l’obscurité. Pour affiner l’exemple, sélectionnez le plan focal, dans lequel la fonction sélectionnée a la plus forte contraste.
  4. Enregistrer la position du champ d’intérêt. Créer un carré de 3 x 3 pixels ROI dans le logiciel de microscope, placez ce ROI sur le noyau d’une cellule d’être endommagés et définir ce ROI à être les dommages ROI.
  5. Recueillir une image des dommage, y compris l’emplacement des dommages ROI.
    1. Pour les expériences qui n’utilisent pas de protéines fluorescentes, acquérir un contraste de phase ou différentiel interférences contraste (DIC) fond clair image pour identifier et relever les noyaux pour dommages.
    2. Pour les cellules vivantes des expériences utilisant des protéines fluorescentes, acquérir une image contenant le fond clair et le canal de fluorescence pour la protéine d’intérêt (c.-à-d., laser ligne 488 nm pour l’excitation des GFP, laser ligne 561 nm pour l’excitation des DP). Expériences utilisant le CHO-K1 XRCC1-GFP, fluorescence excité par la ligne de laser 488 nm ont été recueillie en même temps avec le canal de fond clair DIC transmissible.
  6. Dommages laser initié.
    1. Dans le système présenté, contrôle la dose de laser par le temps total passé les dommages ROI de numérisation. Parce que le galvanomètre pour le laser à 355 nm fonctionne à une vitesse de balayage fixe, dose de laser est contrôlée par le temps consacré à la numérisation à plusieurs reprises les dommages sélectionné ROI : dans les données présentées ici, micro-irradiation à 355 nm est réalisée pour 2 à 10 secondes.
    2. En revanche, contrôler la dose de laser 405 nm en modulant la vitesse de balayage et effectuer une analyse des dommages certains ROI. Dans la données pressentiment ici, utiliser 8 et 0,5 ips pour micro-irradiation à 405 nm. Une vitesse de balayage de 8fps délivre une dose plus faible de laser que 0,5 MF, parce que le laser passe moins de temps sur chaque pixel lors de l’analyse. Les deux lasers fonctionnent à 100 % de puissance. Voir la section 3.7 pour obtenir des instructions sur la mesure de puissance laser directement.
      Remarque : Chaque système individuel de microscope peut-être différer dans Comment puissance du laser est livré à un ROI désigné, semblable à la façon dont le 355 nm et 405 nm se distinguent par le système présenté. Utilisateurs devront déterminer cette procédure pour leur système de microscopie et de faire rapport de ces paramètres au sein de leur section Méthodes.
    3. Pour l’imagerie de cellules vivantes, effectuer l’acquisition d’images timelapse de canaux fond clair et fluorescence. Ajuster la durée et la fréquence de timelapse pour optimiser la collecte de données, idéalement capturant l’accumulation de la protéine fluorescente aux dégâts ROI et de sa dissociation au cours de la durée de l’expérience. Expériences utilisant XRCC1-GFP collectionnait les images toutes les 30 secondes pendant 20 minutes.
      ​ Remarque : la fréquence de l’imagerie timelapse peut être limitée par photoblanchiment du fluorophore, ce qui complique l’analyse de l’accumulation et la dissociation. Photoblanchiment peut être évalué par l’observation des cellules intactes pendant le timelapse et ajustant d’acquisition pour minimiser la perte de signal fluorescent dans ces cellules intactes. Certains photoblanchiment peut-être être inévitable, ainsi les utilisateurs peuvent compenser la perte de signal en normalisant les intensités fluorescentes des cellules endommagées à celles des cellules intactes dans chaque image de la timelapse.
      1. Après le cours du temps est terminé, sélectionnez un nouveau champ de cellules pour les dommages ou fixer les cellules endommagées pour une analyse ultérieure, tel que décrit à l’article 4.
      2. Continuer micro-irradiation et timelapse d’imagerie jusqu'à ce que le nombre de cellules endommagées souhaité est atteint.
        ​ Remarque : nous recommandons d’endommager un total de 10-25 cellules / condition sélectionnée afin d’évaluer l’hétérogénéité de la cellule-cellule en réponse aux dommages induits. Bien que la plupart des systèmes confocal permettra aux utilisateurs d’endommager plusieurs cellules au cours de chaque micro-irradiation, cela introduit dommage décalés initiation fois, qui peuvent compliquer l’analyse des heures de grande écoute de recrutement sur un grand nombre de cellules ou temps de dissociation pour les événements rapides. Dans certains systèmes, induction de dommages simultanée sur plusieurs ROIs peut réduire la dose de laser reçue par chaque ROI indépendant. Par conséquent, à moins que ces questions de timing/puissance sont directement traitées par l’utilisateur, il est recommandé que les cellules endommagés individuellement.
    4. à l’analyse par immunofluorescence (IF), effectuer des dégâts et soit fixer immédiatement des cellules, comme décrit dans l’article 4 ou permettre aux cellules de réparer pour sélectionné par incréments de temps (c.-à-d., 1, 5, 10 ou 20 min). Une fois l’heure écoulée, difficulté et tacher les cellules, comme détaillé dans la section 4.
      1. Pour augmenter le nombre total de cellules pour analyse, endommager des champs supplémentaires dans le récipient de culture pour générer une évolution pluridisciplinaire de la réponse de dommage après. Noter l’emplacement de XY de chaque champ et le moment où le dommage est survenu. Après le total souhaité réparer de temps s’écoule, difficulté et tacher les cellules comme détaillé ci-dessous.
  7. Après avoir observé de recrutement de la protéine à certaines doses, mesure et fibre après rapport laser puissance niveaux et post objectif pour caractériser avec précision et faire rapport au laser des doses. Nous utilisons un wattmètre numérique compact et deux têtes de capteurs photodiode différents ; un couplé directement à la fibre laser pour mesurer la puissance de la fibre, et l’autre placée sur la platine du microscope pour mesurer la puissance post-objective.
    1. Pour mesurer la puissance du laser, de placer le capteur dans la configuration souhaitée (post-fibre ou post-objective) et d’effectuer des micro-irradiation comme décrit ci-dessus, lors de l’enregistrement des mesures effectuées par le wattmètre. Sachez que le taux d’échantillonnage du power meter n’est peut-être pas assez rapide pour capturer les événements de micro-irradiation très rapides, il peut être nécessaire d’exécuter plusieurs itérations de l’expérience pour s’assurer que le wattmètre détecte avec précision la dose appliquée.
      Remarque : Pour le laser à 355 nm, nous avons mesuré une puissance de crête moyenne d’environ 5 post-fibres mW et environ 19 objectif après µW. Pour le laser à 405 nm, micro-irradiation a été effectuée dans les boucles de 30 itérations pour surmonter le taux d’échantillonnage maximale de 0,01 s du power meter et puissance de pointe moyenne de 1,5 mW et 2,4 mW ont été mesurés en utilisant des vitesses de balayage de 0,5 et de 8 images par seconde , respectivement. Chaque wattmètre est différent. Utilisateurs devront déterminer les longueurs d’onde opérationnels et fréquences d’échantillonnage élevées pour leur compteur de puissance individuels.

4. Immunofluorescence souillant les procédures

  1. Analyze strand break induction par coloration de IF.
    1. Fix cellules avec 3,7 % de formaldéhyde (CAUTION) en phosphate buffered saline (PBS) pour 10 min. solution de formaldéhyde aspirer et laver 3 fois avec du PBS. Le protocole peut être arrêté ici en plaçant des PBS sur les cellules et les cellules peuvent être stockés à 4 ° c pendant 1 semaine.
      ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique et cancérogène. Porter un équipement de protection personnels et débarrassez-vous de la substance toxique selon les instructions de procédures institutionnelles de la santé et la sécurité environnementales.
    2. Permeabilize des cellules à l’aide de 0,25 % Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min à température ambiante (RT) et puis laver 3 fois avec du PBS.
    3. Liaison non spécifique anticorps bloc en incubant pendant 30 min dans du PBS contenant 1 % sérum d’albumine bovine (BSA) à température ambiante.
    4. Incuber avec primaire monoclonal antibody contre γH2AX et les anticorps polyclonaux primaire contre 53BP-1 fois dilué 1:750 dans du PBS contenant 1 % de BSA pendant 1 h à RT et ensuite lavent 3 fois avec du PBS.
    5. Incuber les cellules avec Alexa 488 chèvre anti-souris et anti-lapin de chèvre Alexa 546 fois dilué 1 : 2000 dans du PBS contenant 1 % de BSA pendant 1 h à RT et ensuite laver 3 fois avec du PBS.
    6. Tache ADN nucléaire avec une solution de 10 mg/mL de DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, attention) dilué au 1 : 5000 dans du PBS pour 5 min, ou utilisation de colorant nucléaire comparable et puis laver 3 fois avec du PBS.
      ATTENTION : Le DAPI est, mutagènes et toxiques. Porter un équipement de protection personnels et d’éliminer la substance toxique conformément aux instructions de procédures institutionnelles de la santé et la sécurité environnementales.
    7. Lieu PBS ou PBS + 0,1 % d’azide de sodium (CAUTION) sur les cellules colorées. Protocole peut être arrêté ici et cellules conservés à 4 ° c pendant plusieurs jours, ou procéder à l’acquisition d’images à l’article 5.
      ​ Attention : azoture de Sodium est toxique. Porter un équipement de protection personnels et d’éliminer les substances toxiques en suivant les instructions de procédures institutionnelles de la santé et la sécurité environnementales.
  2. Induction Analyze de lésions de base ou de l’ADN des adduits par coloration de IF.
    1. Fix et permeabilize des cellules dans le méthanol glacee (CAUTION) pendant 20 min à -20 ° C.
      ATTENTION : Le méthanol est toxique et inflammable. Porter un équipement de protection personnels et d’éliminer la substance toxique conformément aux instructions de procédures institutionnelles de la santé et la sécurité environnementales.
    2. Aspirer le moithanol et laisser l’échantillon sécher complètement pendant 15 min. de protocole peut être arrêté ici et cellules stockées à-20 ° c à sec pendant 3 jours.
    3. Réhydrater les cellules dans du PBS pendant 15 min.
    4. Prévoit ADN à l’aide de 2 N HCl (CAUTION) pendant 45 min à RT et laver 3 fois avec du PBS.
      ATTENTION : HCl est corrosif. Porter un équipement de protection personnels et d’éliminer la substance corrosive en suivant les instructions de procédures institutionnelles de la santé et la sécurité environnementales.
    5. Neutraliser en 50 mM Tris-HCl de pH 8,8 pendant 5 min, suivie de 3 lavages avec PBS.
    6. Incuber les cellules dans un tampon bloquant faite avec du sérum de chèvre normal de 5 % et 0,1 % Triton X-100 dans du PBS pendant 1 h à température ambiante.
    7. Incuber avec des anticorps primaires pour la 8-oxo-2´-désoxyguanosine (8-oxodG, 1 : 400) ou dimère pyrimidine de cyclobutane (CPD, 1:1, 000) dans le tampon de blocage de sérum de chèvre pendant 1 h à RT et puis laver 3 fois avec du PBS.
    8. Incuber les cellules avec Alexa 488 chèvre anti-souris à un ratio de 1 : 2000 dans le tampon de blocage de sérum de chèvre pendant 1 h à RT et laver 3 fois avec du PBS.
    9. Tache ADN nucléaire utilisant 1 : 5000 DAPI (10 mg/mL) dans du PBS pendant 5 min et laver 3 fois avec du PBS.
    10. Si vous utilisez lamelle compartimentée, placez le PBS ou PBS + 0,1 % d’azide de sodium sur les cellules colorées. Protocole peut être arrêté ici et cellules conservés à 4 ° c pendant plusieurs jours, ou procéder à l’acquisition d’images à l’article 5.
    11. Monter alternativement, cellules en milieu de montage préféré, si un couvre-objet supplémentaire peut être placé sur le dessus du récipient de culture. Une fois guéri, cellules montées peuvent être stockés à 4 ° c pendant de longues périodes de temps.

5. Acquisition d’expériences d’immunofluorescence d’image

  1. nettoyer le fond de la lamelle du récipient de culture avec de l’éthanol et placez-le sur la platine du microscope confocal. S’assurer que l’orientation et la position du navire sur la scène correspond à l’orientation et position enregistrée lorsque les dommages a été induit. Sécuriser le récipient de culture afin d’assurer un repérage optimal et imagerie.
  2. Localiser précédemment imagé champs en utilisant la technique de l’enregistrement sélectionné (décrit en 3.2).
    1. Pour inscription manuelle à l’aide d’une lamelle avec une grille gravée, mettre la grille en focus et de rechercher, identifier les marques. Puis utilisation enregistrée coordonnées XY pour localiser les cellules endommagées.
    2. D’enregistrement automatisé basé sur l’image, localisez la caractéristique structurale utilisée comme référence à l’étape 3.2.1 et orienter la vue au microscope direct actuel plus près de l’image enregistrée que possible. Une fois aligné, mesurer l’emplacement actuel de la scène du microscope XY et comparez-le à l’emplacement de XY de l’image de référence. La distance linéaire entre les deux emplacements définit l’offset X et Y. S’appliquent à ce décalage à chaque emplacement de XY enregistré pour identifier l’ou les champs image contenant la cellule irradiée. Cette fonction de décalage peut être automatisée dans le logiciel de contrôle de microscope ou exécutée manuellement.
    3. Si aucun point d’enregistrement approprié ne pourrait être identifié, manuellement identifier les cellules en analysant la diapositive et de repérer les caractéristiques de cellules préalablement identifiés.
  3. Acquérir des images en utilisant les paramètres appropriés de microscope pour recueillir tout tachés de cibles, y compris une image de fond clair (réglage dans la section 2.3 et en se concentrant à la section 3.3). Dans les expériences présentées, multicanaux images ont été recueillies avec les lignes de laser d’excitation et de fluorophores suivants : 405 nm (DAPI), 488 nm (Alexa 488 et transmissibles DIC fond clair) et 561 nm (Alexa 546). Tous les lasers traversent un seul filtre accordable acousto-optique, lutter contre la transmission de puissance et longueur d’onde laser.

6. Analyse d’image de cellule du recrutement de protéines fluorescentes aux sites de micro-irradiés en direct

  1. ouvert a acquis des images dans une application d’analyse image (éléments de NIS ou ImageJ). Si nécessaire, combiner l’image avant irradiation avec images timelapse pour générer une séquence d’image unique d’induction de dommages avant et après. Les utilisateurs peuvent montrer recrutement en mesurant les changements dans l’intensité de fluorescence sur la zone irradiée par rapport à l’intensité de fluorescence mesurée à travers le noyau entier (voir résultats représentant Figure 1 B. ).
  2. Pour chaque cellule à mesurer, tout d’abord générer une retour sur investissement qui représente le noyau de référence. Utiliser un algorithme de seuillage sur le signal fluorescent qui contient les pixels qui composent le noyau et ensuite transformer cette région en un retour sur investissement. Si nécessaire, le retour sur investissement peut tirer manuellement en utilisant le fond clair comme référence. Ajuster le ROI au cours du temps pour s’assurer que le domaine nucléaire est couvert avec précision par le ROI et de faire rapport à l’intensité de fluorescence moyenne du signal fluorescent dans ce retour sur investissement pour chaque trame.
  3. Pour chaque cellule à mesurer, créer un pixel de 6 x 6 ROI et placez-le sur les dégâts de retour sur investissement pour chaque image de l’évolution temporelle. Ce plus grand ROI est maintenant des dommages ROI pour analyse. Rapport de l’intensité de fluorescence ROI moyenne pour chaque trame.
    Remarque : Logiciel d’analyse image plus commerciale contient des modules pour le suivi de l’objet 2D, et il y a un certain nombre de macros utilisateur avancés pour ImageJ ou Fidji qui facilitent le flux de travail plus rapide et un débit plus élevé (Voir https://imagej.nih.gov/ij/plugins/).
  4. Normaliser l’intensité de fluorescence du ROI moyen dommage à celui de ROI de la mention dans chaque image de la timelapse. Ici, l’intensité de fluorescence nucléaire moyenne est utilisée comme référence du ROI (voir résultats représentant la Figure 1). normalisation peut être effectuée en soustrayant l’intensité de fluorescence de retour sur investissement moyen de référence de la moyenne intensité de fluorescence ROI les dommages, ou en divisant la moyenne endommager ROI intensité de fluorescence par l’intensité de fluorescence de retour sur investissement moyen de référence.
    NOTE : Normalisation par division peut générer des résultats imprévisibles, si utilisés dans des situations avec des valeurs de référence de très faible intensité.
  5. Répéter pour toutes les cellules endommagées, ainsi que pour au moins deux commandes, cellules intactes. Résultats de cellule de contrôle peuvent être utilisés pour plus de normalisation, si nécessaire.
  6. Graphique normalisé des valeurs d’intensité au fil du temps pour montrer les changements dans la dynamique du recrutement en fonction du traitement expérimental.

7. Analyse du recrutement de protéines détecté par immunofluorescence d’image

  1. Open préalables- et post-dommages images dans une application de l’analyse d’image. Les images de dommages avant contiennent les dommages ROI(s) utilisé pour micro-irradiation. Copiez le ROI(s) et collez les images après dommages pour identifier les cellules ciblées.
  2. Générer un pixel de 6 x 6 ROI pour l’analyse du recrutement de protéine et posez ce ROI à l’emplacement des dommages ROI. Ce plus grand ROI est maintenant des dommages ROI pour analyse. Signaler les dommages de moyenne intensité de fluorescence ROI.
  3. Normaliser l’intensité de fluorescence du ROI moyen dommage à celui de ROI de la mention. Ici, l’intensité de fluorescence nucléaire moyenne de la cellule endommagée est utilisée comme référence de retour sur investissement (voir résultats représentant la Figure 1). Générer la référence ROI en utilisant un algorithme de seuillage sur le signal DAPI pour définir le noyau et puis convertir cette zone pour un retour sur investissement. Rapport de l’intensité de fluorescence de retour sur investissement moyen de référence. Normalisation peut être effectuée en soustrayant l’intensité de fluorescence de retour sur investissement moyen de référence contre les dommages de moyenne intensité de fluorescence de ROI, ou en divisant les dégâts de moyenne intensité de fluorescence de retour sur investissement par l’intensité de fluorescence de retour sur investissement moyen de référence.
    NOTE : Normalisation par division peut générer des résultats imprévisibles, si utilisés dans des situations avec des valeurs de référence de très faible intensité.
  4. Répéter pour toutes les cellules endommagées et d’effectuer la même analyse sur cellules au moins deux témoins, tel que décrit ci-dessus.
  5. Graphique normalisé des valeurs d’intensité pour chacun mesuré irradiation micro événement contre le temps pour montrer les changements dans le recrutement de protéines ou de type de dommages à l’ADN en fonction du traitement expérimental.

Résultats

Caractérisation des lésions de l’ADN induite par
Induction des lésions base et brins dépend de la dose de laser appliquée à la zone sélectionnée du nucléaire et le microenvironnement cellulaire du modèle cellulaire utilisé7. Des protéines fluorescentes fusionnés pour réparer des protéines, comme XRCC1, 53BP1, Ku70 ou Rad51, fournir utile simple et doubles chapelet pause marqueurs permettant d’établir l’énergie minimale nécessaire pour voir l’accumulation d’une protéine fluorescente dans un dommage ROI qui précède la arrière-plan fluorescence9,19,31. Une fois que les conditions qui provoquent une réponse sont trouvent, il est essentiel pour caractériser le mélange de dommages induit par cette longueur d’onde spécifique et de la dose. Atténuation de la dose et la durée à la longueur d’onde utilisée peut permettre à l’utilisateur afin de minimiser la formation de mélanges complexes de dommages. Laser de faible des doses UV-A ont été démontrés pour produire principalement SSBs et une petite quantité de base lésions, appropriées pour l’étude de SSBR et BER voies10,28. Augmenter la dose crée des lésions plus complexes base, oxydants et UV induite et induit un nombre plus important de CDB7,10. Alors que l’induction d’une seule espèce de dommages à l’ADN est utiles pour l’examen des voies de réparation de l’ADN spécifiques, il est plus probable que les utilisateurs sont induisant un mélange de lésions de l’ADN, avec une lésion spécifique comme BSN étant beaucoup plus fréquentes que les lésions de base ou de la CDB. Ceci est similaire aux mélanges de dommages d’ADN induites par des agents chimiques comme le peroxyde d’hydrogène (H2O2) ou méthyl méthanesulfonate (MMS)32. Les utilisateurs doivent être conscients lorsqu’ils signalent des résultats qui endommagent les mélanges peuvent survenir, et caractérisation minutieuse de la dose et les lésions sur le site de dommages induits sont nécessaires pour garantir la reproductibilité et la comparabilité des résultats.

Dans les études micro-irradiation, XRCC1-GFP est souvent utilisé comme marqueur pour l’induction des lésions base et BSN9,28. XRCC1 est une protéine d’échafaudage qui joue un rôle important dans la réparation de la SSB (SSBR) et excision de base (BER) de réparation et participe également aux autres voies de réparation, comme nucleotide excision repair (TNS)33,34,35 . Il joue un rôle de coordination important dans la réparation de l’ADN, en interaction avec un certain nombre de protéines clés, y compris le ribose polymérase 1 (PARP-1), l’ADN polymérase β (Pol β) et DNA ligase III. Nous avons utilisé XRCC1-GFP stablement exprimé dans les cellules CHO-K1 pour déterminer les doses de laser requises pour générer des BSN et BDB. Tout d’abord, nous avons identifié la dose minimale nécessaire pour induire un recrutement observable de XRCC1-GFP pour chaque longueur d’onde (Figure 1). Pour la longueur d’onde 355 nm, un temps de pause 2 s sur les dommages définis ROI a généré un signal fluorescent accru au sein de ce ROI, indiquant l’induction de dommages à l’ADN qui a été détecté sur le fond (Figure 1A). Pour 405 nm, une vitesse de balayage de 8fps était nécessaire pour générer un recrutement observable aux dommages ROI (Figure 1A). La dose a été augmentée ensuite (10 s de 355 nm et 0,5 ips pour 405 nm) pour créer une plus intense endommager ROI (Figure 1A).

Recrutement et rétention de XRCC1-GFP sur le site de dommages induits a été ensuite suivi par imagerie timelapse. Rétention de la protéine sur le site de dommages à l’ADN peut indiquer la réparation de l’ADN en cours, tandis que la dissociation de la protéine provenant du site de dommages induits est souvent considérée comme un marqueur pour BER ou SSBR. Cependant, il n’y a eu aucune preuve claire liant la dissociation de XRCC1 de sites induite par laser de l’ADN des dommages avec l’achèvement de la réparation. Recrutement de la protéine sur le site de dommages est mesurée en signalant l’intensité moyenne du signal fluorescent dans le ROI endommagé sur le signal fluorescent moyens mesuré pour le noyau entier (Figure 1B). Ce type de normalisation aide les fluctuations d’intensité adresse du signal nucléaire, bien que les autres techniques de normalisation peuvent être employés selon la distribution cellulaire de la protéine d’intérêt. Ici, XRCC1 est localisée dans le compartiment nucléaire, donc les mesures de normalisation pour le domaine nucléaire la redistribution du signal aux dommages ROI. L’intensité moyenne fluorescente de retour sur investissement est alors enregistrée pour chaque image dans le timelapse, y compris l’image de dommage avant et représentées graphiquement en fonction du temps (Figure 1C).

Ensuite, nous avons caractérisé outre les lésions induites par les deux doses de laser sélectionnés pour étudier la formation de base de l’ADN. Tout d’abord, CPD, une volumineuse lésion provoquée par les UV, la formation a été sondée par immunofluorescence comme marqueur des lésions de type TNS (Figure 2A). Ensuite, la base induite par oxydation lesion8-oxodG a été sondé comme marqueur des lésions de type BER (Figure 2B). Aucune augmentation significative des lésions CPD ont été observés à l’exposition de faible dose pour les deux longueurs d’onde (2 s de 355 nm et 8fps 405 nm), tandis que la haute dose de traitement à deux longueurs d’onde (10 s de 355 nm et 0,5 ips pour 405 nm) n’a montré une augmentation significative dans fluorescentes signal observé dans les dommages ROI (Figure 2A). Un diagramme de dispersion des CPD ROI intensité moyenne pour chaque cellule endommagée montre l’hétérogénéité dans la formation de lésions et détection à longueurs d’onde et de doses, ce qui indique qu’un faible niveau de lésions CPD peut-être être présent à des doses plus faibles, mais la charge n’est peut-être pas significativement détecté jusqu'à ce qu’une dose plus élevée est appliquée. Le diagramme de dispersion suggère également cette inefficacité dans la détection des anticorps qui peut-être limiter la quantification précise de ces mélanges de dommages.

C’est davantage mis en évidence dans la détection des lésions de l’ADN induites par oxydation par le marqueur 8-oxodG. ROI a observé aucune augmentation nette en signal fluorescent dans le dommage pour 8-oxodG à la longueur d’onde laser ou dose utilisée (Figure 2B). L’anticorps utilisé pour ce travail est compatible avec les précédentes publications9,10,36; Toutefois, il est à noter qu’il peut y avoir des limites à observer la formation de 8-oxodG avec anticorps37,38. Confirmation de l’absence de lésions induites par oxydation est également recommandée par un deuxième jalon, comme le recrutement de 8-Oxoguanine DNA Glycosylase (OGG1), l’enzyme responsable de l’enlèvement de 8-oxodG de l' ADN10. Nous n’avons pas observé OGG1 recrutement sur nos sites de dommages d’ADN ; Toutefois, la formation de faibles niveaux d’altération de l’ADN induite par oxydation ne peut être écartée complètement.

Enfin, nous avons examiné la formation des CDB à l’aide de deux marqueurs, γH2AX et 53BP-1, à la sélectionnerdoses d laser par immunofluorescence (Figure 3 & 4). ΓH2AX est couramment utilisé comme marqueur de pause strand, mais sa spécificité pour la CDB a été remise en question dans un certain nombre de rapports39,40. En outre, c’est un événement de phosphorylation qui se propage sur le site de pause strand, localisation du signal à une rupture de brins peut donc être limitée en raison de cette propagation du signal. Par conséquent, alliant γH2AX 53BP-1 permet une évaluation plus précise de formation de l’ORD dans le ROI des dommages.

La réponse de γH2AX et 53BP-1 micro-irradiation est longueur d’onde et dose-dépendante. La faible dose (2 s) stimulation à 355 nm ne suscite aucune réaction à 5 et 20 min et une irradiation faible et variable de réponse de post 10 min (Figure 3A) pour chaque marqueur. La dose élevée (10 s) 355 nm micro-irradiation induit un signal fluorescent accru dans le ROI des dommages à 5, 10 et 20 min après irradiation qui est réduite à 40 min (Figure 3B). Ces résultats indiquent que prudent titrage de la dose de 355 nm est nécessaire pour minimiser la Croix-stimulation des voies de réparation, comme en témoigne la détection réduite de la double brin pause marqueur γH2AX aux points temps précoce (< 20 min) à faible dose appliqué.

Des expériences similaires ont été effectuées à l’aide de basse (8 i/s) et une dose élevée (0,5 ips) 405 nm laser la stimulation (Figure 4). À cette longueur d’onde une accumulation importante de l’intensité de fluorescence dans le ROI des dommages a été observée pour les 53BP-1 et γH2AX quelle que soit la dose appliquée, ce qui indique que ces doses produisent un mélange complexe de brins simples et doubles presque immédiatement après l’induction de dommages à l’ADN (Figure 4). En outre, les fortes doses de 405 émission nm γH2AX pan-nucléaire coloration moins de 10 min d’induction de dommages (Figure 4B, en bas) une augmentation qui est difficile détection des dommages ROI au rapport, tandis que l’accumulation de 53BP-1 est plus contenus dans les dommages ROI.

Ces résultats démontrent clairement que 405 nm micro-irradiation n’est pas approprié pour la surveillance SSBR ou BER, et que plusieurs marqueurs ADN adduits et cassures de brins devraient être utilisées pour caractériser complètement les lésions induites et les réponses de réparation de l’ADN.

Modification de la dose-dépendante dans le recrutement et la rétention de XRCC1-GFP
Une fois que les lésions de l’ADN induites a été caractérisée, micro-irradiation laser peut être une plate-forme idéale pour étudier la dynamique des protéines de réparation de l’ADN. La cinétique de rétention et la dissociation de la GFP-XRCC1 montre une dépendance de dose (Figure 1), qui n’est pas surprenante compte tenu de l’induction de mélanges différents dommages de chaque longueur d’onde. Les plus fortes doses d’irradiation (10 s et fps 0,5) montrent un recrutement d’intensité plus élevé de XRCC1-GFP par rapport aux faibles doses et de rétention de le XRCC1-GFP sur le site de dommages au cours de temps de 20 min (Figure 1C). Cela indique que les dommages à l’ADN créé aux doses plus élevées pour les 355 et 405 nm sont probablement ne pas résolu au cours de l’expérience, ce qui concorde avec l’apparence et la rétention des marqueurs, des γH2AX et des 53BP-1 ORD (Figures 3 & 4 ).

Fait intéressant, les doses plus faibles de dommages (2 s et 8fps) montrent recrutement rapide de XRCC1-GFP vers les sites de dommages et de la dissociation de XRCC1-GFP au cours temps expérimental à des niveaux d’irradiation préalable (Figure 1C). Sans la caractérisation complète du mélange des dommages, ceci peut conduire à la conclusion que BSN et lésions base sont complètement résolues à l’aide de ces conditions dommageables. Toutefois, la présence de γH2AX et 53BP-1 à 40 min pour 355 nm et à 5 min du 405 nm peut conduire à des interprétations différentes. Pour la dose de s 355 nm 2, le mélange de dommages peut être majoritairement SSBs, alors l’apparition des marqueurs ORD 40 min peut indiquer que certaines lésions non réparées peuvent être conduit à la CDB ou que CDB générée par cette énergie est réparées sur une échelle de temps plus longue. Différences d’échelle de temps entre réparation SSBR et Ord ont été rapportées antérieurement28,41,,42. De même, la dissociation de faible dose (8 i/s) 405 nm peut indiquer un faible niveau de BSN ou un clustering de BSN qui sont transforment rapidement à la CDB, qui se distingue par la haute endommager ADN micro-irradiation et autre nuisibles des agents précédemment43, 44 , 45.

Ensemble, ces résultats soulignent l’importance de caractériser les mélanges de dommages induits et utilisant l’ADN de plusieurs protéines de réparation et marqueurs pour interpréter le recrutement et la rétention de l’ADN réparation protéines aux sites des dommages induits.

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Figure 1 . Micro-irradiation laser induit le recrutement de XRCC1-GFP. 
(A) CHO-K1 cellules exprimant de manière stable XRCC1-GFP ont été irradiés et imagés avant et immédiatement après l’induction de dommages. Les flèches indiquent l’emplacement de dose d’irradiation micro et barre d’échelle est 10 µm. B recrutement est mesurée en déterminant l’intensité moyenne fluorescente dans le ROI des dommages et en normalisant à l’intensité de fluorescence moyenne du noyau entier. (C) dynamique de recrutement peut être mesurée pour chaque image de timelapse. Graphiques sont représentatives des deux expériences indépendantes avec barres d’erreur qui représente le SEM (n = 24). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 . Micro-irradiation laser induit des dommages de nucléotides. 
Cellules CHO-K1 ont été soumis au laser micro-irradiation et fixés immédiatement après l’induction de dommages. 8-oxodG adduits et immunofluorescence ont été effectué pour détecter les CPD. (A) haut, diagramme de dispersion de la fluorescence de ROI moyenne intensités observées dans les cellules endommagées après coloration de la CPD. Bas, images représentatives de coloration de la CPD. Les flèches indiquent l’emplacement du micro-irradiation et la barre d’échelle est de 10 µm (n = 12). (B) les images représentatives pour la coloration de la 8-oxodG. Flèchesindiquer l’emplacement du micro-irradiation et la barre d’échelle est 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 . Marqueurs d’ADN double brin pause répondent à 355 nm micro-irradiation dans une façon dose-dépendante. 
Cellules CHO-K1 ont été soumis à une irradiation-micro et fixés à la fois points indiqués après stimulation. Immunofluorescence pour la DSB marqueurs γH2AX et 53BP-1 a été réalisée. (A) Nuage de points de dégâts normalisée ROI signifie les intensités de fluorescence mesurées pour les cellules intactes et endommagés. Barres d’erreur représentent le SEM (n = 12). (B) les images représentatives pour γH2AX et coloration 53BP-1. Les flèches indiquent l’emplacement du micro-irradiation et la barre d’échelle est 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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La figure 4. Marqueurs d’ADN double brin pause répondent fermement à 405 nm micro-irradiation.
Cellules CHO-K1 ont été soumis à une irradiation-micro et fixés à la fois points indiqué après stimulation. Immunofluorescence pour la DSB marqueurs γH2AX et 53BP-1. (A) Nuage de points de dégâts normalisée ROI signifie les intensités de fluorescence mesurées pour les cellules intactes et endommagés. Barres d’erreur représentent le SEM (n = 12). (B) les images représentatives pour γH2AX et coloration 53BP-1. Les flèches indiquent l’emplacement du micro-irradiation et la barre d’échelle est 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Utilisant les conditions décrites ici, un microscope confocal avec une UV ou laser à 405 nm, soit intégrés par le fabricant ou ajoutés par l’utilisateur final, peut induire des lésions de l’ADN dans le noyau d’une cellule et permettre le recrutement de protéines de réparation d’ADN sur le site de a induit des lésions de l’ADN à surveiller. Toutefois, comme il est indiqué dans le protocole et les résultats représentatifs, sélection de longueur d’onde, appliqué de puissance, et caractérisation de dommages sont toutes importantes questions auxquelles il faudra répondre tout d’abord par l’utilisateur afin d’étudier un ADN spécifique réparer la voie. En outre, il y a autres considérations dans une conception expérimentale qui doit également être considérée par les utilisateurs.

Afin de surveiller le comportement de la protéine dans des cellules vivantes post micro-irradiation, une protéine fluorescent étiquetée doit être créée. La disponibilité d’une large gamme de protéines fluorescentes qui peuvent être séparés spectralement propose des outils pour créer des fusions de protéine qui peuvent être utilisées pour caractériser les réponses cellulaires à l’induction de dommages à l’ADN. Permet de transfection transitoire de protéines fluorescentes d’intérêt pour le dépistage rapide des problèmes potentiels, les mutations ou inhibiteurs de la même, tandis que les cellules transfectées stablement offrent plus de contrôle sur les niveaux d’expression et permettent d’autres biochimiques caractérisations à accomplir, valider les résultats de micro-irradiation. Des protéines fluorescentes spectralement distinctes peuvent également être utilisés dans la même cellule pour surveiller les interactions entre les protéines dans la même voie ou dans des voies différentes. Protéines fluorescentes également éliminent la nécessité d’anticorps spécifiques pour chaque protéine d’intérêt et permettre aux cellules vivantes suivi du comportement de protéine pendant de longues périodes de temps après l’induction de dommages.

Cependant, l’utilisation de protéines fluorescentes a aussi des inconvénients. Sans antécédents génétiques déficients dans les protéines d’intérêt, seront en compétition avec les protéines fluorescent étiquetés protéines endogènes. Conjugaison du marqueur fluorescent à l’extrémité N ou C de la protéine peut altérer le repliement des protéines, entravent les interactions protéine-protéine clé ou bloquent les signaux de la translocation ; modifier fonction et potentiellement un impact dynamique de recrutement. Ces effets ont été démontrés dans un certain nombre de rapports où immunofluorescence démontré recrutement radicalement différent et des temps de rétention des protéines endogènes à la site de dommages28. Utilisation de transfection transitoire ou clones stables peut également altérer la réponse observée, généralement par le biais de variations dans les niveaux d’expression de protéine. En outre, l’utilisation de protéines fluorescentes multiples en une seule expérience peut également changer la dynamique du recrutement, si le taux de protéines ne sont pas équilibrés bien ou si le recrutement de la plus grande protéine fluorescent-étiquetées bloque le recrutement d’autres protéines . Enfin, les protéines fluorescentes peuvent agir comme agents de sensibilisation faible, augmentant la formation d’espèces réactives de l’oxygène et susceptibles de modifier l’ADN des dommages mélanges induite46,47. Malgré ces inconvénients, les protéines fluorescentes offrent un certain nombre d’avantages distincts dans l’étude ADN réparez avec micro-irradiation, et si les utilisateurs intègrent des contrôles appropriés, tels que la caractérisation de dommages décrits ici, ils peuvent fournir un nouvel aperçu en dommages réponse et protéines interactions3.

Si l’imagerie de cellules vivantes n’est pas nécessaire, immunofluorescence peut être utilisé pour surveiller la réponse aux dommages induits. Par la fixation des cellules à des moments précis après induction de dommages et de coloration avec des anticorps spécifiques pour les protéines et les lésions d’intérêt, des clichés statiques d’induction de dommages et le recrutement et la rétention de réparation protéines peuvent être construits. Anticorps peuvent être utilisés pour surveiller le recrutement de plusieurs protéines d’intérêt et/ou de modifications post-traductionnelles induites par la réponse aux dommages de l’ADN. Utilisation de l’immunofluorescence élimine le besoin de protéines fluorescentes et permet pour le comportement de la protéine endogène à examiner. Toutefois, cette méthode a aussi ses inconvénients. Anticorps hautement spécifiques sont nécessaires, et perméabilisation et les procédures de blocage doivent être optimisés pour permettre une détection de recrutement avec une intensité de signal suffisant. Procédures de fixation ne sont pas instantanées, et cette contrainte physique limite la résolution temporelle de cette approche. Cartographie du site de l’induction de dommages donc des cellules peuvent être re-localisés après coloration peut également présenter des défis importants. Le microscope confocal utilisé dans ce travail permet d’enregistrement basé sur l’image comme décrit ci-dessus, alors les cellules endommagées peuvent être déplacés avec une grande précision. Si l’étape d’inscription ou de la lamelle gravé n’est pas disponible, le temps d’investissement impliquée dans les cellules puisqu’il déplace sans inscription étape, couplé avec le délai inhérent entre l’induction des dommages et le recrutement imagé, peuvent rendre immunofluorescence attrayant pour certains utilisateurs. Cependant, le plus précis et complet micro-irradiation expérimentaux intégrera ces types d’approches en parallèle avec l’utilisation de protéines fluorescentes, comme décrit dans le protocole présenté.

Ici, l’imagerie de cellules vivantes et immunofluorescence est utilisé pour démontrer l’utilité de micro-irradiation laser. Immunofluorescence permet d’examiner avec précision le mélange de dommages à l’ADN créé et le recrutement des protéines induites par chaque puissance de laser, qui nous permettent de mieux interpréter les altérations observées dans le recrutement et la rétention de XRCC1-GFP. Selon ces résultats, l’utilisation du 405 nm laser devrait être limitée à l’examen des protéines BER et SSBR. En outre, le protocole expérimental optimal comprendrait des mesures de puissance après l’objectif, une caractérisation du mélange plein de dégâts pour chaque lignée cellulaire utilisée et la validation du recrutement et rétention chez fluorescent étiqueté protéines avec immunofluorescence. De toute évidence, matériel, du temps et des considérations de coût pourraient rendre ces modèles expérimentaux optimales impossible pour certains utilisateurs. Toutefois, l’importance de chacun de ces éléments est démontré ici, et utilisateurs devraient garder ces considérations à l’esprit au début des expériences d’irradiation micro.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Samuel H. Wilson à la National Institute of Environmental Health Sciences pour les lignées de cellules utilisées dans ce travail.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Nikon A1rsi laser scanning confocal microscopeNikon
NIS Elements softwareNikon
355 nm laserPicoQuant VisUVRadiation source
Galvanometer photoactivation miniscannerBruker
Microscope slide photodiode power sensorTHORLabsS170C
Fiber photodiode power sensorTHORLabsS150C
Digital handheld optical power and energy meterTHORLabsPM100D
CHO-K1From Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS
Minimal essential mediaHycloneSH3026501
Fetal bovine serumAtlanta biologicalsS11550
XRCC1-GFPOrigeneRG204952
JetprimePolyplus transfection11407
GeneticinThermoFisher10131035
4 chambered coverglassThermoFisher155382
8 chambered coverglassThermoFisher155409
Anti 53BP-1NovusNB100304
Anti-phospho-histone H2AX Millipore05-636-I
Anti cyclobutane pyrimidine dimerCosmo Bio cloneCAC-NM-DND-001
Anti 8-oxo-2´-deoxyguanosine Trevigen4354-MC-050
Alexa 488 goat anti-mouseThermoFisherA11029
Alexa 546 goat anti-rabbitThermoFisherA11010
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)ThermoFisherR37606Caution toxic!
Phosphate buffered salineThermoFisher0780
Normal goat serumThermoFisher31873
Bovine serum albumin (BSA)Jackson Immuno Research001-000-162
37% FormaldehydeThermoFisher9311Caution toxic!
EthanolDecon Labs2716
MethanolVWRBDH1135Caution toxic!
HClFisherSA49
Sodium azideSigma-AldrichS2002Caution toxic!
Tris HydrochlorideAmrescoO234
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

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