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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir sind zwei Chemie-basierte Protokolle für die Kultivierung embryonalen Stammzellen der Maus ausführlich beschrieben. Diese neue Methode nutzt synergistische Mechanismen der Förderung Tet-vermittelten Oxidation (durch Vitamin C) und de-Novo -Synthese von 5-Methylcytosine (durch PD0325901) zu unterdrücken, um DNA-Hypomethylierung und Pluripotenz von embryonalen Stammzellen der Maus zu erhalten.

Zusammenfassung

Embryonale Stammzellen (ES) haben das Potenzial, sich in eines der drei mikrobeschichten (Entoderm, Mesoderm und Ektoderm) differenzieren und erzeugen viele Linien für die regenerative Medizin. ES Zelle Kultur in Vitro seit langem Gegenstand weit verbreitete Bedenken. Klassisch, Maus-ES-Zellen in Serum und Leukämie hemmenden Faktor (LIF) gepflegt werden-Medium enthält. Allerdings Bedingungen Serum/LIF Zellen zeigen Heterogenität in Morphologie und das Expressionsprofil von Pluripotenz-Genen und sind meist in einem metastabilen Zustand. Darüber hinaus kultivierte ES-Zellen zeigen globale Hypermethylation, aber naiv ES-Zellen der inneren Zellmasse (ICM) und primordialen Keimzellen (PGCs) sind in einem Zustand der globalen Hypomethylierung. Der hypomethyliert Zustand des ICM und PGCs ist eng verbunden mit ihrer Pluripotenz. Zur Verbesserung der Maus-ES Zelle Kulturmethoden entwickelten wir vor kurzem eine neue Methode basiert auf der gezielt kombinierte Nutzung von zwei kleine Molekül-Verbindungen, die DNA-hypomethyliert und pluripotenten Zustand zu halten. Hier präsentieren wir die Mitbehandlung von Vitamin C (Vc) und PD0325901 können etwa 90 % der 5-Methylcytosine (5mC) an 5 Tagen in ES-Zellen löschen. Der generierte 5mC Inhalt ist vergleichbar mit dem in PGCs. Die mechanistische Untersuchung zeigt, dass PD0325901 bis Prdm14 Ausdruck Dnmt3b unterdrücken regelt (de Novo DNA-Methyltransferase) und Dnmt3l (der Cofaktor von Dnmt3b), durch die Reduzierung 5mC- de-Novo -Synthese. VC erleichtert die Umstellung der 5mC auf 5-Hydroxymethylcytosine (5hmC) katalysiert hauptsächlich durch Tet1 und Tet2, zeigt die Einbindung der passiven und aktiven DNA-Demethylations. Darüber hinaus zeigen ES-Zellen unter Vc/PD0325901 Bedingungen, homogene Morphologie und pluripotenten Zustand. Gemeinsam schlagen wir eine neuartige und Chemikalie-Synergie-Kultur-Methode für DNA-Hypomethylierung und Aufrechterhaltung der Pluripotenz in Maus-ES-Zellen zu erreichen. Die kleine Molekül chemisch-abhängige Methode überwindet die größten Schwächen der Serum-Kultur und hält Versprechen, homogene Embryonaler Stammzellen für weitere klinische Anwendungen und Forschungen zu generieren.

Einleitung

ES-Zellen stammen vom ICM einer Blastozyste1. Die Zellen sind in einem Zustand der Pluripotenz und alle somatischen Abstammungen und Germline Zellen2bilden können. Einrichtung von ES-Zellen bietet die Möglichkeit zur Entwicklung zu untersuchen in-vitro- Verfahren und medizinische Relevanz für die regenerative Medizin, basierend auf ihre Pluripotenz3Zellen zu generieren.

Zwei Gruppen seminally der Maus-ES-Zell-Linien im Jahr 1981 gegründet und wenn Zellen aus der frühen Maus-Embryo im fetalen bovine Serum (FBS) kultiviert wurden-mit Medium mit Maus embryonalen Fibroblasten (MEFs) als Feeder Layer1,4 . MEFs mitotically inaktiviert wurden und wurden bereits in Gerichte vor der Kultivierung Embryonaler Stammzellen angebaut. MEFs bieten Unterstützung für Maus-ES Zellhaftung und produzieren Wachstumsfaktoren zur Förderung der Verbreitung und der Differenzierung5, zu unterdrücken, während FBS wesentliche trophische Faktoren und Hormone für die Zellproliferation bietet. Nachfolgende Studien gezeigt, dass LIF von Feeder-Zellen produziert die wichtigen Zytokin für Selbsterneuerung und Aufrechterhaltung der Pluripotenz in ES-Zellen wurde, und die Zugabe von LIF in das Medium Feeder Zellen6ersetzen könnte. Derzeit ist die Erhaltung der Maus-ES-Zellen in FBS/LIF Medium Feeder noch die standard-Methode von vielen Forschern angenommen. Ergeben sich jedoch einige Probleme mit diesem Ansatz der klassischen Kultur. Erstens, Feeder-Zellen sezernieren übermäßige und unkontrollierte Faktoren und pathogenen Verunreinigungen7verursachen. Zur Vermeidung von dieser Interferenzen, Beschichtung der Oberfläche der Gerichte mit Gelatine und die Zugabe von LIF in Serum-haltigen Medium sind alternative Methoden für die Aufrechterhaltung der Maus-ES-Zellen ohne Feeder-Schicht Zellen. Zusätzlich, zeigen ES-Zellen unter Serum/LIF Bedingungen gewachsen morphologische Heterogenität in Zell-Populationen und sogar in die Expression von Pluripotenz-bezogene Faktoren8. Neuere Studien legen nahe, dass Serum/LIF Bedingungen der Pluripotenz-bezogene Kern Transkriptionsfaktoren (einschließlich OCT4, SOX2 und Nanog) der Pluripotenz durch LIF und WNT signalisieren aufrecht erhalten können; Bemerkenswert ist, aktivieren sie jedoch auch ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) Signal an Differenzierung8auslösen. Aufgrund der ambivalente duale Wirkung von den Kern-Transkriptionsfaktoren präsentieren ES-Zellen kultiviert im Serum Heterogenität, bestehend aus zwei austauschbare Populationen, eine ähnlich ICM und anderen ähnlich grundiert Epiblast Stand8. Darüber hinaus weisen Maus-ES-Zellen im Serum häufig global Hypermethylation9, während ICM und PGCs in einem globalen hypomethyliert Zustand sind, die eng mit ihrer Pluripotenz9,10.

Es gibt eine hohe Nachfrage, neue Methoden zur Kultivierung von Maus-ES-Zellen entwickeln. Einige verbesserte Protokolle wurden seit 200311 aber weiterhin einige Einschränkungen und Mängel7. Seit 2008, die kombinierte Nutzung von zwei kleinen Molekül-Kinase-Inhibitoren, PD0325901 (der Inhibitor der Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) / extrazelluläre Signal-regulierte Kinase (ERK) (MEK)) und CHIR99021 (der Inhibitor der Glykogen-Synthase Kinase 3 (GSK3)), in N2B27 Medium mit LIF und ohne Serum hat eröffnet neue Perspektiven für Maus-Kultivierung ES12Zellen. Dieses neue definierte Medium zeichnet sich durch die Verwendung von zwei Inhibitoren (2i). Maus Embryonische Stammzellen in 2i/LIF Medium kultiviert sind homogener in Zell-Populationen und der Ausdruck der Pluripotenz Faktoren. Darüber hinaus weisen 2i/LIF-kultivierte Maus-ES-Zellen DNA-Hypomethylierung weltweit, welche kommt ICM-wie Zellen9,13. 2i Kultur hat auch so seine Nachteile. PD0325901 und CHIR99021 sind unlöslich in Wasser und in der Regel aufgelöst in Dimethyl Sulfoxid (DMSO)-basierte Stammlösung in Kulturmedium hinzuzufügen. Studien haben gezeigt, dass langfristige und niedrig dosierte Belastung von Zellen mit DMSO zu Zytotoxizität14führen kann.

Hier haben wir zwei kleine Molekül-Verbindungen genutzt und eine neue Kultur-Methode von Maus-ES-Zellen entwickelt. Die neue Kultur-Methode kombiniert Vc und MEK-Inhibitor PD0325901 zur Förderung der DNA-Hypomethylierung schnell und effektiv auf ein vergleichbares Niveau der PGC, benannt als Vc/PD0325901 Kultivierung Protokoll. Maus Embryonische Stammzellen in Vc/PD0325901-added Serum-haltigen Medium Homogenität in der Morphologie aufweisen und sind in einem Grundzustand nachhaltig. Im Vergleich zu 2i Kultur, Maus Embryonische Stammzellen unter Vc/PD0325901 Bedingungen kultiviert weisen schnellere Kinetik der DNA Demethylierung und erreichen die Hypomethylierung Ebene von PGC vergleichbar. Darüber hinaus verringert sich die Verwendung einer einzigen Hemmstoff (PD0325901) der eingangsbetrag von DMSO in Medium im Vergleich zu dem in 2i verwendet (PD0325901/CHIR99021) und reduziert den Schaden auf Zellen.

Protokoll

1. Vorbereitungen

  1. Bereiten Sie eine Lösung von 1,0 mM PD0325901 (MEK-Inhibitor) und 3,0 mM CHIR99021 (GSK3-Hemmer).
    1. Wiegen Sie 2 mg PD0325901 und 4,15 mL DMSO in eine Braunglas-Fläschchen.
    2. Wiegen Sie 2 mg CHIR99021 und 1,43 mL DMSO in eine Braunglas-Fläschchen.
    3. Folgende Wiederherstellung speichern Aliquote (50 µL/Rohr in 200 µL PCR-Röhrchen) bei-20 ° C und vor Licht geschützt werden. Ein Röhrchen mit den gefrorenen bestand aus einem Gefrierschrank und Auftauen bei Raumtemperatur vor dem Gebrauch zu entfernen.
  2. 0,0176 g Vc in ein Zentrifugenröhrchen 1 mL wiegen und mit 1 mL sterilem Wasser, eine Endkonzentration von 100 mM vor dem Gebrauch wiederherzustellen.
  3. Inaktivieren FBS: inkubieren Sie 500 mL FBS in einem Wasserbad bei 56 ° C für 30 min.
  4. Bereiten Sie 600 mL Basismedium für die Kultivierung von Maus-ES-Zellen.
    1. Verwenden Sie eine Flasche DMEM/hohe Glukose Medium (500 mL) und entfernen Sie 40 mL zu.
    2. Ergänzung 460 mL DMEM/hohe Glukose Medium mit 20 % inaktiviert FBS (120 mL), 1.000 U/mL LIF (60 µL 107 U/mL Stammlösung), 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) (6 mL Stammlösung 10 mM), 1 mM Natrium Pyruvat (6 mL 100 mM Stammlösung) , 2 mM L-Glutamin (6 mL Stammlösung 200 mM), 0,1 mM β-Mercaptoethanol (600 µL der Stammlösung 100 mM), und 33 IU/mL Penicillin und 33 µg/mL Streptomycin (2 mL von Penicillin-Streptomycin gemischt Lösung (10.000 IU/mL Penicillin und 10.000 µg/mL Streptomycin)) . Definieren Sie das Basismedium als Serum Medium.
    3. Pipette 50 µL der Stammlösung von PD0325901 (1,0 mM) und Vc (100 mM), jeweils in 50 mL des Mediums Serum (Endkonzentration: 1,0 µM PD0325901 und 100 µM Vc), und definieren Sie das Medium als Vc/PD0325901 Medium.
      Hinweis: Die Vc/PD0325901 mittlere frisch vor Gebrauch aufgrund der Instabilität der Vc zubereiten.
    4. Mit einer Pipette 50 µL der Stammlösung von PD0325901 übertragen (1,0 mM) und CHIR99021 (3,0 mM), jeweils in 50 mL des Mediums Serum (Endkonzentration: PD0325901 1,0 µM und CHIR99021 3,0 µM), und definieren Sie das Medium als 2i Medium.
  5. Die Gelatine beschichtet Gerichte zuzubereiten.
    1. Bereiten Sie die 0,1 % Gelatine-Lösung: 0,3 g Gelatine in 300 mL Reinstwasser in einer Glasflasche Reagenz mit einer Kappe und Sterilisieren in einem Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. Store die sterile Lösung bei Raumtemperatur.
    2. Inkubieren Sie die Zelle-Kultur-Gerichte (6 cm Durchmesser) mit 2 mL 0,1 % Gelatine-Lösung für 15 min bei Raumtemperatur und Aspirieren Sie die Gelatine. Trocknen Sie die Gerichte in der Luft zu und verwenden sie innerhalb von 12 h.
  6. 10 mL von Maus-ES-Zellen einfrieren Medium in einer 15 mL Zentrifugenröhrchen vorbereiten: 90 % FBS (9 mL) und 10 % DMSO (1 mL). Nutzen Sie das Medium innerhalb von 1 Tag.
  7. Bereiten Sie einen eiskalten Container: die Füllhöhe des Behälters Einfrieren 100 % Isopropyl-Alkohol hinzu, und entsorgen Sie die alte Isopropyl-Alkohol. Fügen Sie neue Isopropyl-Alkohol direkt nach jedem fünften Gebrauch.
  8. Die enzymatische Verdauung Puffer zu machen: wiegen 1,2114 g Tris-Pulver in 100 mL Reinstwasser zur Vorbereitung 100 mM Tris-Lösung und fügen konzentrierte HCl-Lösung (ca. 12 M) in der Tris-Lösung zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,6 (ca. 0,6 mL konzentrierte HCl-Lösung).
  9. Bereiten Sie 50 mL Radio Immunopräzipitation testpuffer (RIPA Puffer): 20 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 20 % Glycerin, 0,5 % NP40, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA. Ergänzen Sie mit 1 mM DVB-t, 1 X cocktail-Proteasehemmer und 1 mM PMSF vor dem Gebrauch. Sobald der PMSF hinzugefügt wird, verwenden Sie den Puffer innerhalb von 30 min.

(2) wachsen Sie ES-Zellen auf Gelatine beschichtet Gerichte

  1. Pre-warme Maus-ES-Zellen (Wildtyp, 129 SvEv) Kultur, Medium, Trypsin und Phosphat gepufferte Lösung (PBS) in einem Wasserbad bei 37 ° C.
  2. Die Passage der Zellen. Aspirieren Sie das Medium vollständig aus der Schale und Pipette 2 mL PBS, das Geschirr zu spülen Sie die Zellen.
    1. Entfernen Sie die PBS mit einer Pipette zu und waschen Sie die Zellen wieder mit 2 mL PBS.
    2. Entfernen der PBS und 0,3 mL Trypsin-EDTA (0,25 %) in jedes Gericht.
    3. Die ganze Schüssel mit dem Trypsin schnell und dann sofort entfernen.
    4. Setzen Sie die Schale in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 min um die Zellen aus der Schale lösen. Nehmen Sie das Geschirr aus dem Inkubator und 2 mL vorgewärmten Serum Medium, die Wirkung von Trypsin zu kündigen.
    5. Die Zelle Kolonien in eine einzelne Zelle Suspension zu distanzieren, resuspending mit einer Pipette (5 mL PIPETTENSPITZE) 10 mal.
  3. Übertragen Sie 150 µL 2 ml der Zelle-Lösung (ca. 190.000 Zellen durch zählen mit einem Hemocytometer) zu, in eine neue Schale Gelatine beschichtet und mit 3 mL frisch zubereiteten Vc/PD0325901 Medium pro 6 cm Kulturschale ergänzen. Kultur der Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2.
  4. Alle 24 h während der Inkubation, entfernen Sie das alte Kulturmedium und 3 mL frisches Vc/PD0325901-Medium in der Kulturschale aufgrund der Instabilität der Vc. erwarten 70 – 80 % Konfluenz nach 2 – 3 Tagen.
  5. Nach erreichen von 70-80 % Konfluenz, Durchgang der Zellen und sie wie beschrieben 2.2 – 2.4 Kultur weiterhin.

(3) frieren Sie ein und tauen Sie Maus Embryonische Stammzellen auf

  1. Maus-ES-Zellen einfrieren.
    1. Die Zellen von den Gerichten mit Trypsin durch folgende Schritt 2.2 abnehmen.
    2. Übertragen Sie die Zellen in einem Kunststoffrohr 15 mL und Zentrifuge bei 800 x g und Raumtemperatur für 3 min.
    3. Dump des Überstands sanft in einen Becher füllen und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 1 mL frisch Einfrieren Medium gemacht. Bereiten Sie einfrierende mittlere 30 min vor diesem Schritt, damit es Raumtemperatur vor der Anwendung ist.
    4. Die Zellen in das Medium zu einem 1,8 mL Microcentrifuge Schlauch mit einer 1-mL-Pipette Einfrieren und den Microcentrifuge Schlauch in einen eiskalten Behälter. Die Füllhöhe des Behälters Einfrieren Isopropyl-Alkohol hinzu und vor der Benutzung bei Zimmertemperatur aufbewahren.
    5. Lassen Sie die eiskalten Behälter über Nacht in einem-80 ° C Gefrierschrank.
    6. Übertragen der Mikrozentrifugenröhrchen auf einem Flüssigstickstoff-Behälter für bis zu 2 – 3 Jahre.
      Hinweis: Nicht halten Zellen einfrieren mittelfristig für eine lange Zeit und schnelle Übertragung von Zellen in einem-80 ° C Gefrierschrank wegen der Giftigkeit von DMSO.
  2. Tauen Sie ES Mauszellen.
    1. Wärmen Sie 50 mL Serum Medium in einem 37 ° C-Wasserbad vor.
    2. Ein Zelle-haltigen Fläschchen aus dem Flüssigstickstoff-Behälter herausnehmen und das angeschnittene Ärmel Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad eintauchen. Schütteln Sie sie schnell in das Wasserbad aufzutauen. Übertragen Sie die Zellen in einem 15 mL-Tube mit einer 1-mL-Pipette. Fügen Sie 2 mL vorgewärmten Serum Kulturmedium in das Rohr zu verdünnen Mediums Einfrieren und dann bei 800 X g und Raumtemperatur für 3 min zentrifugieren.
    3. Entfernen Sie den überstand und Aufschwemmen Sie sanft der Zelle Pellets mit 3 mL frisches Vc/PD0325901 Medium mit einer 5 mL-Pipette.
    4. Die Zellen von der 15 mL Tube auf ein Gelatine beschichtet Gericht übertragen und Kultur der Zellen für 24 h Kultur die Zellen wieder wie in Schritt2 beschrieben.

4. Gesamt-Protein aus Zellen extrahieren

  1. Spülen Sie die gesammelten Zellen mit 1 mL PBS und dann bei 800 X g und Raumtemperatur für 3 min zentrifugieren.
  2. Den überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zelle Pellet gründlich mit RIPA Buffer sanft Pipettieren mit DVB-t, Protease-Inhibitor cocktail und PMSF ergänzt. Das Volumen des RIPA Puffer ist ca. 5 X, die der Zelle pellet.
    Hinweis: Führen Sie die Zelle Wiederfreisetzung auf Eis.
  3. Halten Sie die Zellen im RIPA Puffer für 30 min auf Eis und Zentrifuge bei 13.000 x g und 4 ° C für 5 min.
  4. Übertragen Sie den überstand zu einem neuen Schlauch und speichern Sie Aliquote bei-80 ° C.
  5. Bestimmen Sie die Konzentration des Proteins mit einem Bradford Protein Assay Kit.

5. Extrahieren Sie DNA aus Zellen und Digest DNA in einem einzigen Nukleosid mit Hilfe von Enzymen

  1. Sammeln Sie die Zellen mit Trypsin, wie in den Schritten 3.1.1 und 3.1.2 beschrieben.
  2. Führen Sie die DNA-Extraktion mit den genomischen DNA-Reinigung-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
  3. Speichern Sie die extrahierte DNA in 1 mL Zentrifuge Röhren. 100 µL Reinstwasser in die Zentrifugenröhrchen einfügen und die DNA durch pipettieren etwa 15 Mal auflösen. Die Konzentration ermitteln und bewerten die Qualität der DNA durch die Messung der Absorption bei 260 nm und 280 nm15. Die DNA-Konzentration beträgt etwa 500 ng/µL.
  4. Digest 5 µg DNA in einem 50 µL Lösung System: Fügen Sie 5 µL 100 mm Tris-HCl-Lösung, pH 7.6 (Endkonzentration: 10 mM), 2 U Kalb intestinale Phosphatase, 1 U DNase I, 0,005 U snake Venom Phosphodiesterase ich und 5 µg DNA (das zusätzliche Volumen entsprechend der gemessenen berechnen Rote DNA-Konzentration, ~ 10 µL) in ein Zentrifugenröhrchen und erhöhen das Volumen der Lösung zu 50 µL mit Reinstwasser. Über Nacht inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C. Zentrifugieren Sie die verdaute DNA-Lösung bei 1.000 g und Raumtemperatur für 1 min um die Lösung am Ende der Rohre zu sammeln.
  5. Die verdaute DNA-Lösung aus der Zentrifuge Rohre in Ultrafiltration Röhren übertragen (ein Molekül Gewicht cutoff: 3 kDa) und Zentrifuge bei 13.000 g und 4 ° C für 30 min, die Verdauung Enzyme zu entfernen.
  6. 5mC und 5hmC Analyse der Proben vorbereiten.
    1. Für die 5hmC Analyse: pipettieren 36 µL Filterlösung für eine neue Zentrifuge tube (1 mL) und fügen Sie 4 µL 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-Deoxycytidine ([D3]-5hmC) mit der Endkonzentration von 3 nM.
    2. 5mC Analyse: das Rohr (50-fold Verdünnung), aufgrund der hohen Dichte an 5mC in genomischer DNA 196 µL Reinstwasser in einem neuen Zentrifugenröhrchen und pipettieren 4 µL Filterlösung hinzufügen. Übertragen Sie 36 µL der verdünnten Lösung zu einem neuen Zentrifugenröhrchen geben und 4 µL (5'-(methyl-d3)-2'-Deoxycytidine ([D3]-5mC) mit der Endkonzentration von 50 nM. Verwendung [D3]-5hmC und [D3]-5mC als interner Standard, 5hmC und 5mC, bzw. zu kalibrieren.
  7. Übertragen Sie die Beispiellösung auf Messrohre und Lagerung bei 4 ° C. Analysieren Sie 5mC und 5hmC mit ultra-high-Performance liquid Chromatography-Triple Quadrupol-Massenspektrometrie mit Multiple-Reaktionskontrolle (UHPLC-MS/MS (MRM)) wie in einem früheren Bericht15beschrieben.

6. analysieren 5mC und 5hmC mit UHPLC-MS/MS-15

  1. Richten Sie verschiedene Parameter für die Analyse 5mC und 5hmC mit Hilfe der UHPLC-MS-Software.
    1. Eine neue Methode zu etablieren. Öffnen Sie die Software und klicken Sie auf "Datei | Neu | Methode". Zeigen Sie dem Meldungsfeld "Methode Editor" mit dem Inhalt "Möchten Sie die Änderungen für die aktuelle Methode speichern" und klicken Sie auf "Nein".
    2. Bauen Sie die Parameter des Samplers. Klicken Sie auf "Sampler | Setup | Injection". Wählen Sie "Standard-Injektion" und geben Sie "5 µL bei Injektionsvolumen".
    3. Die Parameter der Pumpe in UHPLC zu bauen.
      1. Klicken Sie auf "BinPump2 | Setup", um die Parameter der Pumpe zu bauen. "Flow" auf "0,25 mL/min" und "Endzeit" "15 min" eingerichtet.
      2. Richten Sie "Lösungsmittel B bei 5 %" und "Grenzen" in "Max 600 Bar".
      3. Klicken Sie auf "BinPump2 | Fahrplan"der isokratischen Elution Parameter für 5mC Analyse bauen. Klicken Sie auf "Anfügen", um eine Zeile hinzuzufügen. Geben Sie "0,00" in "Time" und "5.0" auf "B %". Klicken Sie auf "Append" einmal mehr um eine neue Zeile hinzuzufügen. Geben Sie "15,00" zur "Zeit" und "5.0" auf "B %".
      4. Klicken Sie auf "BinPump2 | Fahrplan", die Gradienten Elution Parameter für 5hmC Analyse zu bauen. Klicken Sie auf "Anhängen, um eine Zeile hinzuzufügen. 0.00 bei Zeit und 5.0 "B %" eingeben. Klicken Sie auf "Append" einmal mehr um eine neue Zeile hinzuzufügen. Geben Sie "3,00" zur "Zeit" und "5.0" auf "B %". Klicken Sie auf "Anfügen" für weitere 6 mal 6 Zeilen hinzufügen. Geben Sie "3.01" bei "Time" und "15,0" bei "B %", "6.00" bei "Time" und "15,0" bei "B %", "6.01" zur "Zeit" und "100" "B %", "10,00" zur "Zeit" und "100,0" bei "B %", "10.01" bei "Time" und "5.0" auf "B %", "15,00" zur "Zeit" und "5.0" auf "B %" in Folge.
        Hinweis: Führen Sie die Analyse der 5mC und 5hmC individuell aufgrund der Trennung der verschiedenen Bedingungen der UHPLC.
    4. Die Parameter der Temperatur der Spalte Fach (TCC) in UHPLC zu bauen.
      Klicken Sie auf "TCC | Setup | Temperatur (links) "und"30 ° C"eingeben.
    5. Legen Sie die Parameter der QQQ-MS/MS.
      1. Klicken Sie auf "MS QQQ | Zeit anhalten | Kein Limit/als pump"," Ionenquelle | ESI"," Zeit Filtern | Peak-Breite: 0,07 min ". Richten Sie "Zeit Segmente: Startzeit: 0"; "Scan-Typ: MRM"; "Div Wert: ms"; "Delta EMV (+): 200" und "Delta EMV (-): 0".
      2. Bauen Sie die Parameter der Überwachung die Übergänge der 5mC, D3-5mC, dC, 5hmC und D-3-5hmC
        1. Klicken Sie auf "MS QQQ | Erwerb | Scan-Segmente: wohnen: 90"; "Fragmentor: 90"; "Kollision Energie: 5"; "Handy-Beschleuniger Spannung: 4" und "Polarität: Positive".
        2. Geben Sie "5mC" auf "Zusammengesetzte Name", "242" at "Vorläufer Ion", "126" auf "Produkt-Ion" für 5mC Analyse. Klicken Sie die Rechte Maustaste und wählen Sie "Zeile hinzufügen" um eine neue Zeile hinzuzufügen. Eingabe "D-3-5mC" bei "Zusammengesetzte Name", "245" at "Vorläufer Ion", "129" auf "Produkt-Ion" für D3-5mC Analyse.
        3. Ergänzung einer anderen drei Zeilen mit dem gleichen Modus. Geben Sie "dC", "Zusammengesetzte Name", "228" at "Vorläufer Ion", "112" auf "Produkt-Ion" für dC-Analyse. Geben Sie "5hmC" bei "Zusammengesetzte Name", "258" at "Vorläufer Ion", "142" auf "Produkt-Ion" für die 5hmC Analyse. Eingang D3-5hmC auf zusammengesetzte Namen, "261" at "Vorläufer Ion", "145" auf "Produkt-Ion" für D-3-5hmC-Analyse.
      3. Bauen Sie die Parameter für die Gasquelle. Klicken Sie auf "MS QQQ | Quelle | Source-Parameter: Gas Temp: 300 ° C "; "Gas-Flow: 11 L/min"; "Vernebler: 15 Psi"; "Positiv-Kapillare: 3500 V".
      4. Speichern Sie die vorgeschlagene Methode. Klicken Sie auf "MS QQQ | Instruments | Save-Methode". Wählen Sie einen Pfad für die vorgeschlagene Methode von "Directory" und geben Sie einen Namen für die Methode durch die Eingabe der Inhalte in "Methode", zum Beispiel: 5mC und 5hmC Analyse.
  2. UHPLC-Trennung und MS/MS-Analyse von mononucleosides
    1. Vorbereiten die mobile Phase für 5mC und Cytosin (C) Analyse: bilden die mobile Phase der Lösung A und B. Lösung A: 500 mL Reinstwasser mit 500 µL der Ameisensäure (Endkonzentration: 0,1 %), und Lösung B: 500 mL 100 % Methanol. Mischen Sie Lösung A und B bei 95:5 (V: V) der mobilen Phase zu eluieren 5mC und C (festgelegt im Schritt 6.1.3.3). Legen Sie die Durchflussmenge bei 0,25 mL/min (festgelegt im Schritt 6.1.3.1).
    2. Bereiten Sie die mobile Phase durch Lösungsmittel A und B für die 5hmC Analyse. Solvent A ist 2,0 mM NH4HCO3 wässrige Lösung (pH 9,0) (500 mL), und Lösungsmittel B ist 100 % Methanol (500 mL). Separate 5hmC durch eine optimierte Gradienten Elution: 0-3 min, 5,0 % B und 95 % pro (V: V); 3-6 min, 15,0 % B und 85 % A; 6-10 min, 100 % B; 10-15 min, 5,0 % B und 95 % A (festgelegt im Schritt 6.1.3.4). Legen Sie die Durchflussmenge bei 0,25 mL/min (festgelegt im Schritt 6.1.3.1).
  3. Nutzen Sie Elektrospray MS/MS mit MRM-Modus (im Schritt 6.1.5.1) analysieren die Elution aus der Spalte und Annahme des positiven Ionen-Modus (festgelegt im Schritt 6.1.5.2.1).
    1. Die Übergänge zu überwachen: 5mC, m/Z 242→126 (Aufprallenergie, 5 eV); [D3]-5mC, m/Z 245→129 (5 eV); dC, m/Z 228→112 (5 eV); 5hmC, m/Z 258→142 (5 eV); [D3]-5hmC, m/Z 261→145 (5 eV) (Set im Schritt 6.1.5.2.2).
    2. Die Kapillare und Fragment Spannungen am +3,500 V (festgelegt im Schritt 6.1.5.3) und 90 V (festgelegt im Schritt 6.1.5.2.1), beziehungsweise.
    3. Das Injektionsvolumen auf 5 µL und analysieren Sie jede Probe 3 mal (festgelegt im Schritt 6.1.2). Setzen Sie die entsprechenden standard Kurven, die Menge an 5mC und 5hmC zu bewerten.
      1. Die Standardkurve 5mC zu etablieren: 1 – 50 nM übertragen (1, 5, 10, 20, 50 nM, Endkonzentration) standard-Lösung von 5mC in Zentrifuge Rohre und fügen Sie 50 nM [D3]-5mC Rohre. Ergänzung das Gesamtvolumen zu 50 µL. führen Sie die Analyse der standard 5mC folgen Sie den Anweisungen für die 5mC Probe (Schritt 6).
      2. Bauen die Standardkurve von 5hmC: 1-20 nM übertragen (1, 2, 5, 10, 20 nM, Endkonzentration) Standardlösung von 5hmC Zentrifugieren Sie Rohre und fügen 3 nM [D3]-5hmC an den Rohren. Ergänzung das Gesamtvolumen zu 50 µL. führen Sie die Analyse von standard 5hmC folgen Sie den Anweisungen für die 5hmC Probe (Schritt 6).

7. Analyse der statistischen Signifikanz

  1. Durchführen Sie die statistische Auswertung mit Software.
    1. Öffnen Sie die Software und wählen Sie "Spalte" in "neue Tabelle & Grafik". Legen Sie die Parameter wie folgt: "Beispieldaten | Beginnen Sie mit einer leeren Tabelle"; "Wählen Sie einen Diagramm der ersten Mode"; "Grafik-Wiederholungen oder Fehlerbalken | Plot | Mit SEM bedeutet".
    2. Klicken Sie auf "Erstellen", um die drei Wiederholungen der Kontroll- und Vc/PD0325901-behandelten Gruppe in der Zeile "A" und "B" bzw. einzugeben. Wählen Sie die sechs Daten und klicken Sie auf "Analysieren" in der "Analyse".
    3. Wählen Sie"t -Tests (und Nichtparametrische Tests)" in "Spalte Analysen", und klicken Sie auf "OK", um die nächste Schnittstelle zu öffnen.
    4. Legen Sie die Parameter wie folgt: "Choose Test | Name des Tests | Ungepaarten t -Test; Optionen | Zwei-tailed"; "Konfidenzintervalle: 95 %"; "Signifikante Ziffern | Zeigen Sie 4 signifikante Ziffern." Klicken Sie auf "OK", um den p -Wert zwischen der Steuerung und Vc/PD0325901 Behandlung zu erwerben.
  2. Auswertung die statistische Signifikanz zwischen dem Steuerelement und den experimentellen Gruppen beschäftigt die zweiseitigen und ungepaarten Student t-test16.
    Hinweis: p < 0,05 bezeichnet den Unterschied statistischen Signifikanz besitzen. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Ergebnisse

VC/PD0325901 induzierte synergistisch globale Löschung von ES-Zellen. Maus Embryonische Stammzellen im Serum weisen DNA Hypermethylation, während ICM pluripotenten Zellen und PGCs globale Löschung der DNA-Methylierung zeigen und der hypomethyliert Staat eng verbunden mit ihrer Pluripotenz9,10 ist.

Zuvor fanden wir und andere, dass Vc Tet-vermittelten 5mC Demethylierun...

Diskussion

In der Arbeit haben wir eine neuartige Methode der Kombination von Vc und PD0325901 um Maus-ES-Zellen in einem undifferenzierten und hypomethyliert Zustand aufrecht zu erhalten, die durch eine synergistische Wirkung der Förderung der DNA Demethylierung von Vc und unterdrücken de Novo DNA erreicht wurde gezeigt. Methylierung von PD0325901. Darüber hinaus zeigte ES-Zellen große Morphologie unter dem Vc/PD0325901-Kultur-System.

Um besser den Zustand der Maus-ES-Zellen in das Vc/PD032...

Offenlegungen

Die Autoren offenbaren keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (21435008 und 21327006, h.w.) und die strategische Priorität Forschungsprogramm von der chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDB14030200, HW).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
fetal bovine serum Australia sourceCorning35-076-CVComponent of mouse ES cell medium
DMEM/high glucoseHycloneSH30022Component of mouse ES cell medium
LIFMilliporeESG1107Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA)Gibco11140050Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvateGibco11360070Component of mouse ES cell medium
L-glutamineGibco25030081Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solutionGibco15140122Component of mouse ES cell medium
PBSSigmaP5493Cells rinse
trypsinHycloneSH30042Cell dissociation
gelatinSigma48722Dishes coating
PD0325901Stemolecule04-0006-10small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021Stemolecule04-0004small-molecule chemical for cell culture
vitamin CSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd XW00508171small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemrPurelabUltraUltra water
DMSOSigmaD8418Cell freezing medium
centrifugerEppendorf5427RDNA and protein extraction
protease inhibitor cocktailSigmaP8340Component of RIPA buffer
PMSF Protease InhibitorThermoFisher Scientific36978Component of RIPA buffer
DTTSigma43815Component of RIPA buffer
EGTASigmaE3889Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit PromegaA1125Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000ThermoFisher ScientificNanoDrop 2000Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphataseNew England BiolabsM0290DNA digestion
DNase INew England BiolabsM0303DNA digestion
snake venom phosphodiesterase ISigmaP4506DNA digestion
Nanosep 3K OmegaPallOD003C35filtration of digested DNA
1290 UHPLC systemAgilent 1290UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometerAgilent G6410BMS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 columnAgilent Zorbax Eclipse Pluscolume for UHPLC separation
5-methylcytosineSolarbio Life SciencesSM8900 standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard)Toronto Research ChemicalsM295900standard 5hmC
Prdm14 antibodybioworldBS7634Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibodybioworldBS6587Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibodyabcamab13604Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibodyabcamab3493Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibodyabcamab13537Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibodybioworldBS1482MHWestern blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgGabcamab6721Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgGabcamab6789Western blot analysis-secondary antibody
TrizolInvitrogen15596-026RNA extraction
reverse transcription systemPromegaA3500RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6001RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kitCells Biolabs, Inc.CBA-302 alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEvProvided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)cell strain of mouse ES cells
microscopeZeissLSM510cells observation
GraphPad Prism 5.0GraphPad Prism Software Inc.5.0statistical analysis

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