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Résumé

Nous avons décrit en détail deux protocoles de base chimique pour la culture des cellules souches embryonnaires de souris. Cette nouvelle méthode utilise des mécanismes synergiques de promouvoir l’oxydation induite par le Tet (par la vitamine C) et réprimant la synthèse de novo de la 5-méthylcytosine (par PD0325901) pour maintenir l’hypométhylation de l’ADN et la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris.

Résumé

Les cellules souches embryonnaires (ES) sont susceptibles de faire la différence dans l’une des trois couches germinales (endoderme, mésoderme et ectoderme) et peuvent générer de nombreux lignages pour la médecine régénérative. ES cellules la culture in vitro est depuis longtemps l’objet de préoccupations répandues. Classiquement, les souris ES cellules sont maintenues en facteur inhibiteur sérique et la leucémie (LIF)-contenant le support. Toutefois, dans des conditions de sérum ou d’un FRV, cellules montrent l’hétérogénéité dans la morphologie et le profil d’expression des gènes reliés à la pluripotence et sont pour la plupart dans un état métastable. En outre, des cellules ES pièce hyperméthylation globale, mais cellules ES naïve de la masse cellulaire interne (MCI) et les cellules germinales primordiales (PGC) sont dans un état de l’hypométhylation globale. L’État hypométhylés de l’ICM et PGC est étroitement associé à leur pluripotence. Pour améliorer les méthodes de culture cellulaire souris ES, nous avons récemment mis au point une nouvelle méthode basée sur l’utilisation sélective combinée des deux composés de petites molécules pour maintenir l’état de hypométhylés et pluripotentes d’ADN. Ici, nous présentons qui le co-traitement de vitamine C (Vc) et PD0325901 permet d’effacer environ 90 % de la 5-méthylcytosine (5mC) à 5 jours dans les cellules ES de souris. Le contenu généré 5mC est comparable à celui dans le PGC. L’enquête mécaniste montre que PD0325901 up-régule l’expression Prdm14 pour supprimer Dnmt3b (de novo ADN méthyltransférase) et Dnmt3l (le cofacteur de Dnmt3b), en réduisant la synthèse de novo de 5mC. VC facilite la conversion de 5mC à 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) catalysée principalement par Tet1 et Tet2, en indiquant l’implication des demethylations ADN passives et actives. Par ailleurs, dans des conditions de Vc/PD0325901, cellules ES souris montrent morphologie homogène et état pluripotent. Collectivement, nous vous proposons un procédé nouveau et culture chimique-synergie pour atteindre l’hypométhylation de l’ADN et l’entretien de la pluripotence des cellules de souris ES. La méthode chimique dépendant de petites molécules permet de surmonter les lacunes importantes de la culture de sérum et promesse de cales pour générer des cellules ES homogènes pour davantage les applications cliniques et de recherches.

Introduction

CSEh est provenus de l’ICM un blastocyste1. Les cellules sont dans un état de pluripotence et peuvent former tous les lignages somatiques et de cellules germinales2. Mise en place de cellules d’ES fournit l’occasion d’étudier le développement des processus in vitro et peut générer des cellules médicales présentant un intérêt pour la médecine régénérative basée sur leur pluripotence3.

Deux groupes seminally établi les lignées de cellules de souris ES en 1981 et quand a cultivé des cellules dérivées de l’embryon précoce de souris en sérum fœtal (SVF)-contenant le support avec les fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) que le chargeur couche1,4 . MEFs étaient inactivés mitose et ont été préalablement cultivées dans les plats avant mise en culture des cellules ES. MEFs appuient à la fixation des cellules ES de souris et produisent des facteurs de croissance pour promouvoir la propagation et de réprimer la différenciation5, tandis que le FBS propose des facteurs trophiques essentiels et hormones pour la prolifération cellulaire. Des études subséquentes indiquent que FRV produite par des cellules nourricières était la cytokine clée pour l’auto-renouvellement et l’entretien de pluripotence dans les cellules ES de souris, et l’addition de FRV dans le milieu pourrait remplacer alimentation cellules6. Actuellement, le maintien des cellules ES de souris dans un milieu FBS/FRV sur mangeoires est toujours la méthode standard adoptée par de nombreux chercheurs. Cependant, quelques problèmes avec cette approche de la culture classique. Tout d’abord, des cellules nourricières sécrètent des facteurs excessives et incontrôlées et peuvent causer la contamination pathogène7. Pour éviter cette ingérence, revêtement de la surface des plats avec de la gélatine et l’ajout de FRV dans contenant du sérum moyen sont des méthodes alternatives pour maintenir les cellules de souris ES sans cellules de la couche de conducteur. En outre, les cellules d’ES de souris cultivées dans des conditions de sérum/FRV pièce hétérogénéité morphologique dans les populations de cellules et même dans le niveau d’expression de facteurs liés à la pluripotence8. Des études récentes suggèrent que, dans des conditions de sérum ou d’un FRV, les facteurs de transcription de base liées à la pluripotence (y compris OCT4, SOX2 et Nanog) peuvent maintenir la pluripotence FRV et WNT signaling ; Cependant, en particulier, ils activent également un signal de facteur de croissance (FGF) de fibroblastes pour déclencher la différenciation8. En raison de la double action ambivalente, les base de facteurs de transcription, souris ES cellules cultivées dans le sérum présentes hétérogénéité, composé de deux sous-groupes interchangeables, un semblable à l’ICM et une autre qui ressemble à l’épiblaste apprêtée état8. En outre, les cellules de souris ES dans le sérum présentent souvent hyperméthylation global9, tandis que ICM et PGC est dans un état de hypométhylés global, qui est étroitement lié à leur pluripotence9,10.

Il y a une demande considérable pour développer de nouvelles méthodes de culture de cellules de souris ES. Plusieurs protocoles améliorés ont été établis depuis 200311 , mais il y a encore quelques limitations et défauts7. Depuis 2008, l’utilisation combinée des deux inhibiteurs de la kinase de petites molécules, PD0325901 (l’inhibiteur de la protéine mitogène-kinase (MAPK) / extracellulaire-signal-regulated kinase ERK (MEK)) et CHIR99021 (l’inhibiteur de la glycogène synthase kinase 3 (GSK3)), en N2B27 milieu avec FRV et sans sérum a ouvert des nouvelles perspectives culture souris ES cellules12. Ce nouveau milieu défini est caractérisé par l’utilisation de deux inhibiteurs (2i). Les cellules ES de souris cultivées dans un milieu 2i/FRV sont plus homogènes dans les populations de cellules et l’expression des facteurs de pluripotence. En outre, des cellules de souris cultivées 2i/FRV ES pièce hypométhylation de l’ADN dans le monde, qui est plus proche de cellules ICM9,13. Malgré cela, la culture 2i a ses inconvénients. PD0325901 et CHIR99021 sont insolubles dans l’eau sont généralement dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)-base de solution mère pour les ajouter dans le milieu de culture. Des études ont montré qu’à long terme et exposition de faible dose de cellules à DMSO peut conduire à la cytotoxicité14.

Ici, nous avons utilisé deux composés de petites molécules et mis au point une nouvelle méthode de culture de cellules de souris ES. La méthode de culture originale allie Vc et MEK inhibiteur PD0325901 pour promouvoir l’hypométhylation de l’ADN rapidement et efficacement à un niveau comparable de PGC, nommé comme le protocole de culture Vc/PD0325901. Les cellules de souris ES dans Vc/PD0325901-ajout d’un milieu contenant du sérum pièce homogénéité morphologique et sont maintenues dans un état fondamental. Par rapport à la culture de 2i, cellules ES de souris cultivées dans des conditions de Vc/PD0325901 pièce cinétique rapide de déméthylation de l’ADN et peuvent atteindre le niveau de l’hypométhylation comparable à celle du PGC. En outre, l’utilisation d’un inhibiteur d’unique (PD0325901) diminue la quantité d’entrée de DMSO en moyenne par rapport à celle utilisée dans la 2i (PD0325901/CHIR99021) et réduit les dommages aux cellules.

Protocole

1. les préparatifs

  1. Préparer une solution de 1,0 mM PD0325901 (inhibiteur de la MEK) et 3,0 mM CHIR99021 (inhibiteur de GSK3).
    1. Peser 2 mg de PD0325901 et ajouter 4,15 mL de DMSO dans un flacon de verre ambré.
    2. Peser 2 mg de CHIR99021 et ajouter 1,43 mL de DMSO dans un flacon de verre ambré.
    3. Suivante reconstitution, stocker aliquotes (50 µL/tube en tube PCR 200 µL) à-20 ° C et l’abri de la lumière. Retirer un tube contenant le stock congelé d’une congélation et décongélation à température ambiante avant utilisation.
  2. Peser 0,0176 g du CR dans 1 mL d’un tube à centrifuger et reconstituer avec 1 mL d’eau stérile à une concentration finale d’avant 100 mM.
  3. Inactiver FBS : incuber 500 mL de FBS dans un bain d’eau à 56 ° C pendant 30 min.
  4. Préparez 600 mL de milieu de base pour la culture des cellules de souris ES.
    1. Utiliser une bouteille de milieu glucosé DMEM/haut (500 mL) et prélever 40 mL.
    2. Supplément 460 mL de milieu DMEM/haut glucose 20 % inactivé FBS (120 mL), 1 000 U/mL FRV (60 µL de solution-mère 107 U/mL), 0,1 mM non essentiels des acides aminés (NEAA) (6 mL de solution mère de 10 mM), le pyruvate de sodium 1 mM (6 mL de solution étalon de 100 mM) , 2 mM de L-glutamine (6 mL de solution mère de 200 mM), 0,1 mM β-mercaptoéthanol (600 µL de solution étalon de 100 mM) et 33 IU/mL de pénicilline et 33 µg/mL de streptomycine (2 mL de solution (10 000 UI/mL de pénicilline et 10 000 µg/mL de streptomycine) mixte de pénicilline-streptomycine) . Décrivez le milieu de base comme moyen de sérum.
    3. Distribuer 50 µL de la solution mère de PD0325901 (1,0 mM) et Vc (100 mM), respectivement, dans 50 mL de milieu sérum (concentration finale : 1,0 µM PD0325901 et 100 µM Vc) et définir le milieu comme support de Vc/PD0325901.
      NOTE : Préparer fraîches moyennes avant de l’utiliser en raison de l’instabilité du Vc Vc/PD0325901.
    4. À l’aide d’une pipette, transférer 50 µL de la solution mère de PD0325901 (1,0 mM) et CHIR99021 (3. 0 mM), respectivement, dans 50 mL de milieu sérum (concentration finale : PD0325901 1,0 µM et CHIR99021 3.0 µM) et définir le milieu comme support de 2i.
  5. Préparer les plats enduit de gélatine.
    1. Préparer la solution de gélatine de 0,1 % : dissoudre 0,3 g de gélatine dans 300 mL d’eau ultrapure dans un flacon de réactif de verre avec un bouchon et stériliser à l’autoclave à 121 ° C pendant 20 min. Store la solution stérile à la température ambiante.
    2. Incuber les récipients de culture de cellules (6 cm de diamètre) avec 2 mL de solution de gélatine de 0,1 % pendant 15 min à température ambiante et puis aspirer les feuilles de gélatine. Sécher la vaisselle à l’air et de les utiliser dans les 12 h.
  6. Préparer 10 mL de cellules de souris ES congélation moyen dans un tube à centrifuger 15 mL : 90 % SVF (9 mL) et 10 % DMSO (1 mL). Utiliser le support sous 1 jour.
  7. Préparer un récipient congélation : ajouter 100 % d’alcool isopropylique à la ligne de remplissage du conteneur congélation et jeter le vieux l’alcool isopropylique. Ajouter l’alcool isopropylique nouveau directement après chaque utilisation de cinquième.
  8. Faire le tampon de la digestion enzymatique : pesée 1,2114 g de poudre de Tris dans 100 mL d’eau ultrapure pour préparer 100 mM Tris solution et ajouter concentré HCl solution (environ 12 M) dans la solution de Tris pour ajuster le pH à 7,6 (environ 0,6 mL de solution de HCl concentrée).
  9. Préparation de 50 mL de tampon radio immunoprécipitation (tampon RIPA) : 20 mM Tris, pH 7,4, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 20 % de glycérol, 0,5 % NP40, EDTA 1 mM, 1 mM EGTA. Compléter avec 1 millimètre DTT, 1 X cocktail inhibiteur de protéase et 1 mM avant PMSF à utiliser. Une fois le PMSF ajouté, utilisez la mémoire tampon dans les 30 minutes.

2. la croissance de cellules ES souris sur enduit de gélatine plats

  1. La culture des cellules de souris Préchauffez ES (type sauvage, SvEv 129) moyen, la trypsine et solution tamponnée au phosphate (PBS) dans un bain-marie à 37 ° C.
  2. Le passage des cellules. Aspirez le milieu complètement de l’antenne et la pipette de 2 mL de PBS aux plats de rincer les cellules.
    1. Retirez le PBS avec une pipette et laver les cellules avec 2 mL de PBS.
    2. Retirez le PBS et ajouter 0,3 mL de trypsine-EDTA (0,25 %) à chaque plat.
    3. Couvrir le plat entier avec la trypsine rapidement et puis retirez-le immédiatement.
    4. Mettre le plat dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 min détacher les cellules du plat. Sortez les plats de l’incubateur et ajouter 2 mL de milieu de sérum pré chauffé pour mettre fin à l’action de la trypsine.
    5. Dissocier les colonies de cellules en suspension monocellulaire en resuspendant avec une pipette (embout de la pipette 5 mL) 10 fois.
  3. Transférer 150 µL de 2 mL de la solution de cellules (environ 190 000 cellules en comptant avec un hémocytomètre) dans une autre boite enduit de gélatine et compléter avec 3 mL de milieu de Vc/PD0325901 fraîchement préparé par boîte de Petri de 6 cm. La culture des cellules dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2.
  4. Toutes les 24 h pendant l’incubation, enlever le milieu de culture ancien et ajouter 3 mL de Vc/PD0325901-milieu frais dans la boîte de Petri en raison de l’instabilité de la confluence de la Vc. Expect 70 – 80 % après 2 – 3 jours.
  5. Après avoir atteint 70 à 80 % confluence, les cellules de passage et continuer à la culture à eux comme décrit aux points 2.2 à 2.4.

3. congeler et décongeler les cellules ES de souris

  1. Congeler des cellules de souris ES.
    1. Détacher les cellules de la vaisselle avec de la trypsine en suivant le point 2.2.
    2. Transférer les cellules dans un tube en plastique de 15 mL et centrifuger à 800 x g et à température ambiante pendant 3 min.
    3. Jeter le surnageant doucement dans un bécher et Resuspendre le culot cellulaire avec 1 mL de fraîchement congélation moyen. Préparer la congélation moyen 30 min avant cette étape pour s’assurer qu’il est à température ambiante avant utilisation.
    4. Les cellules au moyen d’un tube de microcentrifuge de 1,8 mL avec une pipette 1 mL de gel de transfert et placer le tube de microcentrifuge dans un récipient froid. Ajouter l’alcool isopropylique à la ligne de remplissage du conteneur congélation et gardez-le à température ambiante avant de l’utiliser.
    5. Laisser une nuit les conteneurs congélation dans un congélateur à-80 ° C.
    6. Transférer les tubes de microcentrifuge dans un contenant de l’azote liquide jusqu'à 2 à 3 ans.
      NOTE : Ne pas garder les cellules dans le milieu de congélation pendant un long temps et transférer rapidement les cellules à un congélateur-80 ° C en raison de la toxicité du DMSO.
  2. Décongelez les cellules de souris ES.
    1. Réchauffez 50 mL de milieu de sérum dans un bain-marie à 37 ° C.
    2. Sortir un flacon contenant des cellules du contenant de l’azote liquide et y plonger le flacon plafonné dans un bain-marie à 37 ° C. Agiter rapidement dans le bain d’eau à dégeler. Transférer les cellules dans un tube de 15 mL avec une pipette de 1 mL. Ajouter 2 mL de milieu de culture de sérum pré chauffé dans un tube à diluer le milieu de congélation et puis centrifuger à 800 x g et à température ambiante pendant 3 min.
    3. Retirez le surnageant et remettre doucement les boulettes de cellule avec 3 mL de milieu frais de Vc/PD0325901 à l’aide d’une pipette de 5 mL.
    4. Transférer les cellules du tube de 15 mL dans un plat enduit de gélatine et de la culture les cellules pendant 24 h. Culture des cellules marche, comme décrit à l’étape 2.

4. extrait de protéine totale de cellules

  1. Rincer les cellules recueillies avec 1 mL de PBS et puis centrifuger à 800 x g et à température ambiante pendant 3 min.
  2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire soigneusement avec un tampon RIPA additionné de DTT et inhibiteur de la protéase cocktail PMSF par pipetage doucement. Le volume de tampon RIPA est environ 5 fois celle de la cellule de granule.
    NOTE : Effectuer la remise en suspension des cellules sur la glace.
  3. Garder les cellules dans un tampon RIPA pendant 30 min sur glace et centrifuger à 13 000 x g et 4 ° C pendant 5 min.
  4. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et stocker les aliquotes à-80 ° C.
  5. Déterminer la concentration de la protéine avec un kit de dosage de protéine de Bradford.

5. extraire l’ADN des cellules et l’ADN condensé dans un nucléoside unique à l’aide d’Enzymes

  1. Recueillir les cellules avec la trypsine, comme indiqué aux paragraphes 3.1.1 et 3.1.2.
  2. Effectuer l’extraction de l’ADN avec un kit de purification de l’ADN génomique suivant les instructions du fabricant.
  3. Stocker l’ADN extrait de tubes à centrifuger 1 mL. Ajouter 100 µL d’eau ultrapure dans le tube à centrifuger et dissoudre l’ADN en pipettant également, environ 15 fois. Déterminer la concentration et évaluer la qualité de l’ADN par la mesure de l’absorbance à 260 nm et 280 nm15. La concentration d’ADN est environ 500 ng/µL.
  4. Digest 5 µg d’ADN dans un système 50 µL de la solution : ajouter 5 µL de 100 mM Tris-HCl solution, pH 7,6 (concentration finale : 10 mM), 2 phosphatase intestinale de U veau, 1 U DNase I, 0,005 U phosphodiestérase du venin de serpent I et 5 µg d’ADN (calculer le volume ajouté selon la mesure concentration d’ADN rouge, ~ 10 µL) dans un tube à centrifuger et augmenter le volume de solution à 50 µL d’eau ultrapure. Incuber le mélange à 37 ° C pendant la nuit. Centrifuger la solution d’ADN digérée à 1 000 g et à température ambiante pendant 1 min recueillir la solution vers le bas des tubes.
  5. Transférer la solution d’ADN digérée provenant des tubes de centrifugeuse dans des tubes d’ultrafiltration (un poids de molécule coupure : 3 kDa) et centrifuger à 13 000 g et 4 ° C pendant 30 min éliminer les enzymes de la digestion.
  6. Préparer les échantillons pour l’analyse 5mC et 5hmC.
    1. Pour une analyse 5hmC : ajouter 36 µL de solution de filtration à une centrifugeuse nouveau tube (1 mL) et ajouter 4 µL de 5'-(hydroxymethyl-d3)-2'-désoxycytidine ([D3]-5hmC) avec la concentration finale de 3 nM.
    2. Pour l’analyse de 5mC : Ajouter 196 µL d’eau ultrapure dans un nouveau tube à centrifuger et ajouter 4 µL de solution de filtration dans le tube (50 fois dilution), en raison de la forte densité de 5mC dans l’ADN génomique. Transfert de 36 µL de la solution diluée dans un nouveau tube à centrifuger et ajouter 4 µL de (5'-(methyl-d3)-2'-désoxycytidine ([D3]-5mC) avec la concentration finale de 50 nM. Utilisation [D3]-5hmC et [D3]-5mC comme étalon interne pour calibrer les 5hmC et 5mC, respectivement.
  7. Transférer la solution d’échantillon aux tubes de mesure et stocker à 4 ° C. Analyser 5mC et 5hmC avec la spectrométrie de masse ultra performant liquid chromatography-triple quadripôle à multiple-reaction monitoring (UHPLC-MS/MS (MRM)) tel que décrit dans un précédent rapport15.

6. analyser 5mC et 5hmC à l’aide de UHPLC-MS/MS15

  1. Mis en place différents paramètres d’analyse 5mC et 5hmC en utilisant le logiciel UHPLC-MS.
    1. Mettre en place une nouvelle méthode. Ouvrez le logiciel et cliquez sur « fichier | Nouveau | Méthode ». Pièce de la boîte de message avec le contenu de « Éditeur de méthode » « Voulez-vous enregistrer les modifications pour la méthode actuelle » et cliquez sur « Non ».
    2. Établir les paramètres de l’échantillonneur. Cliquez sur « Sampler | Le programme d’installation | Injection ». Sélectionnez « Standard injection » et entrez « 5 µL à volume d’Injection ».
    3. Établir les paramètres de la pompe en UHPLC.
      1. Cliquez sur « BinPump2 | Setup » pour établir les paramètres de la pompe. Mettre en place « Flow » à « 0,25 mL/min » et « Arrêter le temps » à « 15 min ».
      2. Mettre en place « Solvant B à 5 % » et les « Limites de pression » au « bar Max 600 ».
      3. Cliquez sur « BinPump2 | Calendrier » pour construire l’isocratique paramètres d’élution pour analyse de 5mC. Cliquez sur « Ajouter » pour ajouter une ligne. Des commentaires « 0.00 » au « Time » et « 5.0 » à « B% ». Cliquez sur « Ajouter » une fois de plus pour ajouter une nouvelle ligne. Entrée « 15.00 » à « Time » et « 5.0 » à « B% ».
      4. Cliquez sur « BinPump2 | Calendrier » pour créer les paramètres de gradient d’élution pour l’analyse de 5hmC. Cliquez sur « Append pour ajouter une ligne. L’entrée de 0,00 à temps et 5.0 à « B% ». Cliquez sur « Ajouter » une fois de plus pour ajouter une nouvelle ligne. Des commentaires « 3.00 » au « Time » et « 5.0 » à « B% ». Cliquez sur « Ajouter » pour un autre 6 fois d’ajouter 6 rangs. Entrée « 3.01 » à « Time » et « 15,0 » à « B% », « 6.00 » à « Time » et « 15,0 » à « B% », « 6.01 » à « Time » et « 100 » « % B », « 10,00 » à « Time » et « 100,0 » à « B% », « 10.01 » à « Time » et « 5.0 » à « B% », « 15.00 » à « Time » et « 5.0 » à « B% » dans l’ordre.
        Remarque : Effectuer l’analyse de 5mC et 5hmC individuellement en raison des conditions de séparation différente de UHPLC.
    4. Établir les paramètres de la température de l’espace de la colonne (TCC) dans UHPLC.
      Cliquez sur « TCC | Le programme d’installation | température (à gauche) » et entrez « 30 ° C ».
    5. Établir les paramètres de la QQQ-SM/SM.
      1. Cliquez sur « MS QQQ | Arrêter le temps | Aucune limite/comme pompe », « Source d’ions | ESI », « temps filtrage | Largeur du PIC : 0,07 min ». Mettre en place « segments de temps : heure de début : 0 » ; « Scan Type : MRM » ; « Valeur Div : ms » ; « Delta EMV (+) : 200 » et « Delta EMV (-) : 0".
      2. Établir les paramètres de surveillance les transitions de 5mC, D3-5mC, dC, 5hmC et D3-5hmC
        1. Cliquez sur « MS QQQ | Acquisition | Analyse des segments : habiter : 90" ; « Fragmentor : 90 » ; « Énergie de collision : 5 » ; « Cell accélérateur tension : 4 » et « polarité : Positive ».
        2. Entrée « 5mC » à « Compound Name », « 242 » at « Ion précurseur », « 126 » à « Produit Ion » pour l’analyse de 5mC. Cliquez avec le bouton droit et sélectionnez « Ajouter la ligne » ajouter une nouvelle ligne. Entrée « D3-5mC » à « Compound Name », « 245 » at « Ion précurseur », « 129 » à « Ion produit » pour D3-analyse de 5mC.
        3. Un autre supplément trois lignes en utilisant le même mode. Entrée « dC » à « Compound Name », « 228 » at « Ion précurseur », « 112 » à « Produit Ion » pour l’analyse dC. L’entrée « 5hmC » à « Compound Name », « 258 » at « Ion précurseur », « 142 » à « Produit Ion » pour l’analyse de 5hmC. Entrée D3-5hmC au nom composé, « 261 » at « Ion précurseur », « 145 » à « Ion produit » pour D3-analyse de 5hmC.
      3. Établir les paramètres de la source de gaz. Cliquez sur « MS QQQ | Source | Paramètres de la source : Temp de gaz : 300 ° C » ; « Débit de gaz : 11 L/min » ; « Nébuliseur : 15psi » ; « Positif-capillaire : 3500 V ».
      4. Enregistrer la méthode proposée. Cliquez sur « MS QQQ | Instrument | Enregistrer la méthode ». À choisir une voie pour la méthode proposée par « Répertoire » et donner un nom pour la méthode par l’introduction de la teneur en « Méthode », par exemple : analyse 5mC et 5hmC.
  2. Séparation de UHPLC et analyse MS/MS d’oligonucléosides
    1. Préparer la phase mobile pour 5mC et cytosine (C) analyse : former la phase mobile de la solution A et B. Solution A: 500 mL d’eau ultrapure avec 500 µL d’acide formique (concentration finale : 0,1 %) et la solution b : 500 mL de méthanol à 100 %. Mélanger une solution A et B à 95 : 5 (v : v) comme phase mobile pour éluer 5mC et C (définie à l’étape 6.1.3.3). Régler le débit à 0,25 mL/min (définie à l’étape 6.1.3.1).
    2. Préparer la phase mobile par solvant A et B pour l’analyse de 5hmC. Solvant A est de 2,0 mM NH4HCO3 soluté (pH 9,0) (500 mL), et le solvant B est 100 % de méthanol (500 mL). 5hmC séparées par une élution gradient optimisée : 0-3 min, 5,0 % B et 95 % A (v : v) ; 3-6 min, 15,0 % B et 85 % A ; 6-10 min, 100 % B ; 10-15 min, 5,0 % B et 95 % A (définie à l’étape 6.1.3.4). Régler le débit à 0,25 mL/min (définie à l’étape 6.1.3.1).
  3. Utiliser par électronébulisation MS/MS avec mode MRM (défini à l’étape 6.1.5.1) pour analyser l’élution de la colonne et adopter le mode d’ions positifs (défini à l’étape 6.1.5.2.1).
    1. Surveiller les transitions : 5mC, m/z 242→126 (énergie de collision, 5EV) ; [D3]-5mC, m/z 245→129 (5 eV) ; dC, m/z 228→112 (5 eV) ; 5hmC, m/z 258→142 (5 eV) ; [D3]-5hmC, m/z 261→145 (5 eV) (défini dans l’étape 6.1.5.2.2).
    2. Régler les tensions capillaire et fragment à +3,500 V (définie à l’étape 6.1.5.3) et 90 V (définie à l’étape 6.1.5.2.1), respectivement.
    3. Régler le volume d’injection à 5 µL et analyser chaque échantillon 3 fois (définies à l’étape 6.1.2). Employer les courbes standards correspondantes pour évaluer la quantité de 5mC et 5hmC.
      1. Tracer la courbe d’étalonnage de 5mC : transférer 1 – 50 nM (1, 5, 10, 20, 50 nM, concentration finale) solution titrée de 5mC dans centrifugeuse tubes et ajouter 50 nM [D3]-5mC à tubes. Supplément au volume total de 50 µL. effectuer l’analyse de 5mC standard en suivant les instructions de l’exemple de 5mC (étape 6).
      2. Construire la courbe d’étalonnage du 5hmC : transfert de 1 à 20 nM (1, 2, 5, 10, 20 nM, concentration finale) solution titrée de 5hmC pour tubes de centrifugeuse et ajouter 3 nM [D3]-5hmC aux tubes. Supplément au volume total de 50 µL. effectuer l’analyse de 5hmC standard en suivant les instructions de l’exemple 5hmC (étape 6).

7. analyser la signification statistique

  1. Effectuer l’analyse statistique en utilisant le logiciel.
    1. Ouvrez le logiciel et sélectionnez « Colonne » dans « nouveau tableau & graphique ». Réglez les paramètres comme suit : « ECHANTILLONS | Démarrer avec une table de données vide » ; « Choisir un mode graphique, le premier » ; « Représentation graphique des répétitions ou des barres d’erreur | Tracer | Dire avec SEM. »
    2. Cliquez sur « Créer » à l’entrée des trois répétitions du groupe contrôle et Vc/PD0325901-traitées à la ligne « A » et « B », respectivement. Sélectionnez les données de six, puis cliquez sur « Analyser » en « Analyse ».
    3. Sélectionnez « testt (et tests non paramétriques) » dans les « Analyses de colonne » et cliquez sur « OK » pour accéder à l’interface suivante.
    4. Réglez les paramètres comme suit : « choisissez test | Nom du test | Test de non-appariés t ; Options | Bilatéral » ; « Les intervalles de confiance : 95 % » ; « Chiffres significatifs | Afficher les 4 chiffres significatifs ». Cliquez sur « OK » pour obtenir la valeur de p entre le traitement de la commande et Vc/PD0325901.
  2. Évaluer la signification statistique entre le contrôle et les groupes employant de l’étudiant à deux points et non appariées t-test16.
    Remarque : p < 0,05 désigne la différence possédant une signification statistique. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Résultats

VC/PD0325901 induite en synergie l’effacement global de cellules ES de souris. Dans le sérum, les cellules de souris ES pièce hyperméthylation de l’ADN, tandis que les cellules pluripotentes ICM et PGC montrent l’effacement global de la méthylation de l’ADN et de l’État hypométhylés est étroitement lié à leur pluripotence9,10.

Auparavant, nous et autr...

Discussion

Dans le travail, nous avons démontré une méthode originale de combiner Vc et PD0325901 afin de soutenir des cellules de souris ES à un État indifférencié et hypométhylés, qui a été réalisé par une action synergique favorisant la déméthylation de l’ADN par CR et la suppression de novo de l’ADN méthylation de PD0325901. En outre, souris ES cellules montrent morphologie grande sous le système de culture Vc/PD0325901.

Afin de mieux soutenir l’état de cellules de so...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne divulguer aucun conflit d’intérêt potentiel.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale sciences naturelles de Chine (21435008 et 21327006 à H.W.) et le programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des Sciences (XDB14030200 à H.W.).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
fetal bovine serum Australia sourceCorning35-076-CVComponent of mouse ES cell medium
DMEM/high glucoseHycloneSH30022Component of mouse ES cell medium
LIFMilliporeESG1107Component of mouse ES cell medium
non-essential amino acids (NEAA)Gibco11140050Component of mouse ES cell medium
sodium pyruvateGibco11360070Component of mouse ES cell medium
L-glutamineGibco25030081Component of mouse ES cell medium
penicillin streptomycin solutionGibco15140122Component of mouse ES cell medium
PBSSigmaP5493Cells rinse
trypsinHycloneSH30042Cell dissociation
gelatinSigma48722Dishes coating
PD0325901Stemolecule04-0006-10small-molecule chemical for cell culture
CHIR99021Stemolecule04-0004small-molecule chemical for cell culture
vitamin CSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd XW00508171small-molecule chemical for cell culture
Ultra Bioscience water purification systemrPurelabUltraUltra water
DMSOSigmaD8418Cell freezing medium
centrifugerEppendorf5427RDNA and protein extraction
protease inhibitor cocktailSigmaP8340Component of RIPA buffer
PMSF Protease InhibitorThermoFisher Scientific36978Component of RIPA buffer
DTTSigma43815Component of RIPA buffer
EGTASigmaE3889Component of RIPA buffer
Genomic DNA Purification Kit PromegaA1125Genomic DNA extraction
NanoDrop 2000ThermoFisher ScientificNanoDrop 2000Determination of DNA concentration
calf intestinal phosphataseNew England BiolabsM0290DNA digestion
DNase INew England BiolabsM0303DNA digestion
snake venom phosphodiesterase ISigmaP4506DNA digestion
Nanosep 3K OmegaPallOD003C35filtration of digested DNA
1290 UHPLC systemAgilent 1290UHPLC separation
G6410B triple quadrupole mass spectrometerAgilent G6410BMS/MS analysis
Zorbax Eclipse Plus C18 columnAgilent Zorbax Eclipse Pluscolume for UHPLC separation
5-methylcytosineSolarbio Life SciencesSM8900 standard 5mC
5-hydroxymethylcytosine (standard)Toronto Research ChemicalsM295900standard 5hmC
Prdm14 antibodybioworldBS7634Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3a antibodybioworldBS6587Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3b antibodyabcamab13604Western blot analysis-primary antibody
Dnmt3l antibodyabcamab3493Western blot analysis-primary antibody
Dnmt1 antibodyabcamab13537Western blot analysis-primary antibody
β-tubulin antibodybioworldBS1482MHWestern blot analysis-primary antibody
goat anti-rabbit IgGabcamab6721Western blot analysis-secondary antibody
goat anti-mouse IgGabcamab6789Western blot analysis-secondary antibody
TrizolInvitrogen15596-026RNA extraction
reverse transcription systemPromegaA3500RNA reverse transcription
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6001RT-PCR
StemTAG alkaline phosphatase staining and activity assay kitCells Biolabs, Inc.CBA-302 alkaline phosphatase staining analysis
mouse ES cells: WT, 129 SvEvProvided by Professor Guoliang Xu (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China)cell strain of mouse ES cells
microscopeZeissLSM510cells observation
GraphPad Prism 5.0GraphPad Prism Software Inc.5.0statistical analysis

Références

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