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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet experimentelle Schritte und Informationen über Reagenzien, Ausrüstung und Analyse-Tools für Forscher, die gesamte Genom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) Analyse der Kopie Zahl Variationen in interessieren Pflanzen.

Zusammenfassung

Mutanten sind wertvolle genetische Ressourcen für Funktionsstudien gen. Um mutierte Sammlungen zu generieren, können drei Arten von mutagenen genutzt werden, einschließlich biologischer wie T-DNA oder Transposon, chemische wie Ethyl Methanesulfonate (EMS) oder physische wie Ionisation Strahlung. Die Art der Mutation beobachtet variiert je nach der Mutagen verwendet. Ionisation Strahlung induzierten Mutanten sind Mutationen löschen, duplizieren oder Neuordnung. Während T-DNA oder Transposon-basierte Mutagenese, auf Arten, die zur Transformation unterliegen beschränkt, kann chemische oder physikalische Mutagenese auf verschiedenste Arten angewendet werden. Allerdings stützt sich die Charakterisierung der Mutationen abgeleitet von chemischen oder physikalischen Mutagenese traditionell auf eine kartenbasierte Klonen Ansatz, ist arbeitsintensiv und zeitaufwendig. Hier zeigen wir, dass eine High-Density-Genom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (aCGH) Plattform angewendet werden kann, um effizient zu erkennen und zu charakterisieren, Kopie Nummer Variationen (CNV) in Mutanten abgeleitet von schnellen Neutronen Bombardement (FNB) Mutagenese in Medicago Truncatula, ein Leguminosenarten. Gesamte Genom-Sequenzanalyse zeigt, dass es mehr als 50.000 Gene oder gen Modelle in M. Truncatula. Im vorliegenden, FNB-induzierten Mutanten in M. Truncatula stammen aus mehr als 150.000 Linien, M1, die wertvolle genetische Ressourcen für funktionelle Studien der Gene im Genom darstellen. Die hier beschriebenen aCGH-Plattform ist ein effizientes Werkzeug zur Charakterisierung von FNB-induzierten Mutanten in M. Truncatula.

Einleitung

Hülsenfrüchte (Fabaceae) sind die drittgrößte Familie der Blütenpflanzen, mit vielen wirtschaftlich wichtige Arten wie Soja (Glycine Max) und Alfalfa (Medicago Sativa). Hülsenfrucht Pflanzen können interagieren mit Stickstoff-fixierenden Bodenbakterien, im allgemeinen genannt Rhizobien Wurzelknöllchen zu entwickeln, in denen die atmosphärische Distickstoff auf Ammoniak für den Einsatz von der Wirtspflanze reduziert wird. Als solche Anbau von Leguminosen Pflanzen erfordert wenig Input von Stickstoffdüngemitteln und trägt somit zu einer nachhaltigen Landwirtschaft. Hülsenfrucht Getreide produzieren Blätter und Samen mit hohem Proteingehalt, dient als ausgezeichnete Futter und Getreide. Kultivierte Leguminosenarten haben jedoch in der Regel komplexe Genom Strukturen, wodurch funktionelle Studien von Genen, die Schlüsselrollen in Leguminosen-spezifische Prozesse umständlich zu spielen. Medicago Truncatula wurde weit als eine Art Modell für Hülsenfrucht Studien angenommen worden, vor allem, weil (1) es hat eine diploide Genom mit einer relativ kleinen haploiden Genomgröße (~ 550 Mbp); (2) Pflanzen können stabil für funktionelle Studien gen umgewandelt werden; und (3) Es ist eng verwandt mit Luzerne (M. Sativa), die Königin der Futterpflanzen und viele andere wirtschaftlich bedeutenden Kulturen für Translationale Studien. Vor kurzem, die Genomsequenz des M. Truncatula cv Jemalong A17 wurde freigegeben1,2. Anmerkung des Genoms zeigt, dass mehr als 50.000 vorhergesagten Genen oder gen-Modelle im Genom vorhanden sind. Um festzustellen, die Funktion der meisten Gene in die M. Truncatula ist Genom eine anspruchsvolle Aufgabe. Um funktionelle Studien von Genen zu erleichtern, eine umfassende Sammlung von Mutanten in den Bereich von mehr als 150.000 M1 Zeilen generiert wurde mit schnellen Neutronen Bombardement (FNB) Mutagenese in M. Truncatula cv Jemalong A173 ,4. Schnellen Neutronen, einer hochenergetischen Ionisation Mutagen, worden ist bei der Schaffung von Mutanten in vielen Pflanzenarten, darunter Arabidopsis5,6, Reis (Oryza Sativa)7, Tomate (Solanum verwendet Lycopersicum), Sojaöl (Glycine Soja; G. max)8,9, Gerste (Hordeum Vulgare) und Lotus Japonicus10. Ein Großteil der Mutationen von FNB Mutagenese abgeleitet sind aufgrund von DNA-Löschungen, liegen in der Größenordnung von ein paar Basenpaare an Mega Basenpaare9,11. Viele Phänotyp-Assoziierte Gene wurden erfolgreich identifiziert und charakterisiert,4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. zuvor molekularen Klonen der zugrunde liegenden Gene von FNB Mutanten stützte sich auf eine Karte-basierte Ansatz, der ist zeitaufwendig und begrenzt die Anzahl der Mutanten auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Vor kurzem mehrere kostenlose Ansätze einschließlich Protokoll-basierte Methoden, Genom Fliesen Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) für DNA-Kopie Nummer Variation Erkennung und kompletten Genoms eingesetzt zur Erleichterung der Charakterisierung der Löschung Mutanten in verschiedenen Organismen, einschließlich der Tiere und Pflanzen20,21,22,23,24,25, 26,27,28,29,30,31.

Um die Charakterisierung der FNB Mutanten in M. Truncatula, ein Vollständiggenom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) zu erleichtern hat die Plattform entwickelt und validiert. Wie berichtet in tierischen Systeme kann die Array-CGH Plattform Kopie Nummer Variationen (CNV) auf der Ebene der gesamten Genoms in M. Truncatula FNB Mutanten. Darüber hinaus Läsionen können mittels PCR bestätigt werden und Löschung Grenzen durch Sequenzierung identifiziert werden können. Insgesamt ist der Array-CGH-Plattform ein effizientes und effektives Werkzeug bei der Identifizierung von Läsionen in M. Truncatula FNB Mutanten. Hier werden die Array-CGH-Verfahren und PCR Charakterisierung der Löschung Grenzen in einem M. Truncatula FNB Mutant illustriert.

Das folgende Protokoll bietet experimentelle Schritte und Informationen über Reagenzien, Ausrüstung und Analyse-Tools für Forscher, die gesamte Genom Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) Analyse der Kopienzahl interessieren Variationen in Pflanzen. Als Beispiel diente Medicago Truncatula FN6191 Mutant Löschung Regionen und Kandidatengene zugeordnete mutierten Phänotypen zu identifizieren. M. Truncatula FN6191 Mutant, ursprünglich von einem schnellen Neutronen Bombardierung verursachten Löschung mutierten Sammlung32 isoliert (siehe Tabelle der Materialien), stellte einen hyper-Nodulation Phänotyp nach Inokulation mit dem Boden Bakterium, Sihorhizobium Meliloti Sm1021, im Gegensatz zu Wildtyp-Pflanzen.

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Protokoll

Hinweis: Abbildung 1 zeigt die fünf Schritte für das Array CGH-Protokoll. Sie sind: 1) Vorbereitung der pflanzlichen Stoffen; (2) Isolierung von DNA-Proben von hoher Qualität; (3) Kennzeichnung und Reinigung von DNA-Proben; (4) Hybridisierung, waschen und das Scannen des gesamten Genoms Arrays; und 5) CGH Datenanalyse. M. Truncatula gesamte Genom Tiling Arrays enthalten insgesamt 971.041 einzigartige Oligo-Sonden, die Ausrichtung auf mehr als 50.000 Gene oder gen-Modelle in das Genom (siehe Tabelle der Materialien). Die einzigartige Sonden Abstand ca. alle 150 Basenpaare (bp) in exonic Regionen und 261 bp in intronischen Regionen des Genoms M. Truncatula.

1. Vorbereitung der pflanzlichen Rohstoffen

  1. Scarify Wildtyp (WT; M. Truncatula cv Jemalong A17) und die FN6191 mutierten Samen mit konzentrierter Schwefelsäure für 8 min (siehe Tabelle der Materialien). Entfernen und entsorgen von Schwefelsäure zu einem flüssigen Abfallbehälter.
  2. Samen mit autoklaviert deionisiertes Wasser dreimal spülen.
  3. Oberfläche zu sterilisieren Samen mit 20 % Bleichmittel-Lösung für 10 min.
  4. Samen mit autoklaviert deionisiertes Wasser dreimal spülen.
  5. Store Samen bei 4 ° C für 3 Tage. Nach Vernalisation, transfer und Keimen der Samen im Boden für eine Woche in einer Wachstums-Kammer mit 16 h/8 h hell/dunkel-Zyklus und 150 µE/m 2/s Intensität Licht.
  6. Transplantation Sämlinge zu 1 Gallone Töpfe und wachsen sie in einem Gewächshaus mit 16 h/8 h hell/dunkel-Zyklus, 150 µE/m 2/s Lichtintensität für drei bis vier Wochen. Junges Blattproben aus den Werken für die DNA-Isolierung sammeln.

2. Isolierung von hoher Qualität DNA-Proben

  1. 1 g junge Blattgewebe aus einer einzigen Pflanze nehmen und Einfrieren in flüssigem Stickstoff sofort.
  2. Eingefrorene Blattgewebe in flüssigem Stickstoff mit einem Mörser und Stößel zu feinen Pulver mahlen.
  3. Isolierung genomischen DNA mit einer DNA-Isolation kit (siehe Tabelle der Werkstoffe).
  4. Aufschwemmen gereinigte DNA-Proben in 50 µL autoklaviert Doppel entionisiertem H 2 O (DdH 2 O) oder 1 x TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,0).
  5. Maßnahme DNA-Konzentrationen mit einem Spektrophotometer (siehe Tabelle der Werkstoffe).
  6. Bewerten 260 nm/280 nm und 260 nm/230 nm Verhältnisse von DNA-Proben.
    Hinweis: Sollten qualitativ hochwertige DNA-Proben haben 260 nm/280 nm Verhältnis ≥ 1,8 und 260 nm/230 nm Verhältnis ≥ 2.0.
  7. Weitere bewerten DNA-Proben von läuft sie in 1 % Agarose-Gele.
    Hinweis: Qualitativ hochwertige DNA-Proben sollten hohes Molekulargewicht und sollte nicht durch RNA kontaminiert werden. Im Idealfall sollte die Endkonzentration von DNA-Proben ~ 150 ng/µL.

3. DNA-Kennzeichnung und Reinigung

  1. verdünnen 1 µg genomische DNA-Proben mit DdH 2 O zu einem Endvolumen von 20 µL in eine 500 µL Zentrifugenröhrchen.
  2. Hinzufügen 5 µL eine zufällige Grundierung (siehe Tabelle der Materialien) mit dem Schlauch.
  3. Vortex den Schlauch kurz und steckte es in einem Thermocycler inkubieren und denaturieren DNA bei 98 ° C für 10 min.
  4. Nehmen Sie das Rohr aus der Thermocycler und steckte ihn sofort in Eiswasser für 5 min. Chill
  5. Bereiten zwei Kennzeichnung mischt, wie in Tabelle 1 gezeigt.
  6. Fügen Sie 25 µL des Benennens Mixe 1 und 2 auf Referenz-DNA und DNA-Probe Rohre bzw..
  7. Mischen die Kennzeichnung Mischung und die DNA durch Pipettieren dreimal und drehen Sie die Rohre kurz.
  8. Setzen die Röhren in einem Thermocycler, Inkubation bei 37 ° C für 2 h und dann bei 65 ° C für 20 min, das Exo-Klenow-Enzym zu inaktivieren (siehe Tabelle der Werkstoffe).
  9. Hinzufügen 430 µL 1 x TE-Puffer für jede Röhre.
  10. Mischen Sie den Inhalt und die Rohre kurz schleudern.
  11. Übertragung der Lösung in das Rohr in eine Reinigung-Spalte mit einer Sammlung von 2 mL tube (siehe Tabelle der Werkstoffe).
  12. Zentrifuge der Reinigung Spalte bei 14.000 x g für 10 min.
  13. Der Pass-through Lösung zu verwerfen.
  14. Fügen Sie 480 µL 1 x TE-Puffer für jede Spalte.
  15. Zentrifuge Spalte wieder auf 14.000 x g für 10 min.
  16. Die Pass-Through-Lösung zu verwerfen.
  17. Übertragen die beschriftete DNA-Probe, die am unteren Teil der Spalte, die einen neuen Zentrifugenröhrchen bleibt.
  18. Messen Sie das Volumen der beschrifteten DNA-Probe mit einer Pipette und bringen das Endvolumen zu 80 µL 1 x TE-Puffer.
  19. Messen die Konzentration von beschrifteten DNA-Probe mit einem Spektralphotometer (siehe Tabelle der Werkstoffe).
  20. Mischen eine gleiche Menge von beschrifteten Probe DNA und DNA zu verweisen und bringen das Endvolumen zu 160 µL 1 x TE-Puffer.
  21. Fügen Sie 256 µL 2 x Hybridisierung Puffer, 50 µL der menschlichen DNA Kinderbett-1 und 50 µL 10 × aCGH Blockierungsmittel (siehe Tabelle der Materialien) und mischen sie gut durch dreimal pipettieren.
  22. Drehen Sie die Rohre kurz und setzen Sie sie in einem Thermocycler bei 98 ° C für 10 min inkubieren
  23. Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C für 20 min.

4. Hybridisierung, waschen, und Scannen der Genom-Arrays

  1. Vorwärmen den Hybridisierung Backofen 67 ° C mindestens 4 h vor Beginn der Hybridisierung.
  2. Legen Sie eine Dichtung-Folie auf der Basis einer Hybridisierung Kammer.
  3. Last 490 µL Hybridisierung Lösung von Schritt 3.23 auf der Dichtung Folie.
  4. Decken die Dichtung Folie mit einem Medicago Truncatula Genom-Microarray-Chip zu eine Hybridisierung Kammer bilden.
  5. Setzen auf die Hybridisierung Kammer Abdeckungen und die Kammer mit Klemmen fest anziehen.
  6. Setzen Sie die montierten Hybridisierung Kammer in der Hybridisierung Ofen und inkubieren Sie bei 67 ° C für 40-48 h.
  7. Bereiten drei Folie beim Abwasch: zwei mit 250 mL Waschpuffer ich bei Raumtemperatur aufbewahrt, und eins mit Waschpuffer II gehalten bei 37 ° c
  8. Bereiten zwei Folie Gläser waschen: eins mit 70 mL Acetonitril und eins mit 70 mL Stabilisierung und Trockenlösung, halten Sie beide in einer Dampfhaube bei Raumtemperatur (siehe Tabelle der Werkstoffe).
  9. Die Hybridisierung Kammer aus dem Ofen nehmen und die Kammer Klemmen und abnehmen.
  10. Bewegen sich die Microarray-Chip und die Dichtung schieben Sie auf eine Folie waschen Schale mit Waschpuffer ich und trennen den Chip aus dem Titeldia.
  11. Umzug der Microarray-chip auf der zweiten Folie waschen mit Waschpuffer ich Gericht und sanft zirkulieren die Lösung mit einer Stir Bar auf einem Teller magnetische Rühren bei Raumtemperatur für 5 min.
  12. Übertragen der Microarray-chip der dritten Folie waschen Schale mit vorgewärmten waschen Puffer II und waschen Sie es sanft mit Stir Bar auf einem magnetischen rühren Teller bei 37 ° C für 1 min.
  13. Übertragen den Microarray-Chip auf einer Folie Glas mit Acetonitril in einer Dampfhaube waschen und waschen Sie es für 30 s.
  14. Übertragen den Microarray-Chip auf einer Folie Glas mit Stabilisierung waschen und trocknen Lösung und waschen Sie es für 30 s.
  15. Langsam den Chip herausnehmen und trocknen Sie es für 1 min.
  16. Scannen den Microarray-Chip mit Hilfe eines Scanners (siehe Tabelle der Materialien) unter 2 µm Auflösung. Eingestellten Parameter, mehrere Bilder und ganze Dia-Scans zu speichern. Kanäle 1 und 2 Gewinne auf 100 % eingestellt und den Auto-Gewinn zu stornieren.

5. CGH Datenanalyse

  1. Extrakt der Cy3 und Cy5 Fluoreszenz Intensitäten für jede Sonde auf dem Array mit Scan-Software (siehe Tabelle der Werkstoffe).
  2. Use Segmentierung Analyse der Software Kopie Nummer Variationen (CNV) zwischen den DNA-Probe und Referenz-DNA zu erkennen. Verwenden Sie eine Schwelle der Segment mittlere Log 2 Probe/Referenz Verhältnis ± 2,5 Standardabweichungen für die Bestimmung der CNV.
  3. Die Verteilung der Log 2 Probe/Referenz Verhältnisse über das gesamte Genom mit einem Signal-Mapping-Software zu überprüfen (siehe Tabelle der Werkstoffe).

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Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt die Verteilung der normalisierten Log2 Verhältnisse der Mutant versus WT Signale über das gesamte Genom. Analyse der CGH Daten ergab eine ungefähre 22 kb Löschung auf Chromosom 4, das umfasst die gesamte SUNN gen33 und mehrere andere kommentiert Gene in FN6191 Mutant (Abbildung 2, Abbildung 3). Die Kandidat gelöschten Region wurde dur...

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Diskussion

Haben wir eine Array-CGH Plattform für die Erkennung und Charakterisierung von schnellen Neutronen Bombardement (FNB)-induzierten Mutanten in M. Truncatula CV Jemalong A17. Um die Verwendung von Array CGH Methode bei der Aufdeckung von Gen-Mutationen zu demonstrieren, führten wir aCGH Analyse des mutierten FN6191, die einen hyper-Nodulation Phänotyp im Gegensatz zu Wildtyp-Pflanzen ausgestellt, wenn mit S. Meliloti Sm1021geimpft. Für die Segmentierung Analyse galt ein Segment erhebliche wenn das Log...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wird teilweise durch einen Zuschuss von NSF Pflanzengenomforschung (IOS-1127155) finanziert.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Medicago truncatula genome array, 1 x 1 MAgilentG4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant)In houseFN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference)In houseA17
Sulfuric acidSigma-Aldrich320501
DNeasy Plant Mini KitQiagen69104
Nanodrop SpectrophotometerThermo Scientific1000D
SureTag DNA Labeling KitAgilent5190-3400
Random primerAgilent5190-3399
AcetonitrileSigma-Aldrich271004-1L
ThermocyclerMJ researchPTC-200
CentrifugeLabnet international IncSpectrafuge 24D
Stabilization and Drying SolutionAgilent5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization KitAgilent5188-5380
Hybridization Chamber gasket slidesAgilentG2505
Human Cot-1 DNAAgilent5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2Agilent5188-5221
Hybridization Chamber, stainlessAgilentG2534A
Hybridization ovenAgilentG2545A
Purification ColumnsAgilent5190-3391
Laser scannerRocheMS200
NimbleScan 2.6Roche Nimblegen5225035001
Signal Map 1.9Roche NimblegenSignalmap1.9

Referenzen

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