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Resumo

Este protocolo fornece etapas experimentais e informações sobre os reagentes, equipamentos e ferramentas de análise para pesquisadores interessados na realização de análise de hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) do genoma inteiro das variações números de cópia em plantas.

Resumo

Os mutantes são inestimáveis recursos genéticos para estudos de função do gene. Para gerar conjuntos de mutante, três tipos de agentes mutagénicos podem ser utilizados, incluindo biológicos tais como o T-DNA ou transposon, produto químico como Metanossulfonato de etila (EMS), ou físico, como a radiação de ionização. O tipo de mutação observada varia de acordo com o mutagênico utilizado. Para ionização radiação induzida por mutantes, mutações incluem a exclusão, a duplicação ou rearranjo. Enquanto T-DNA ou mutagénese transposon-baseado é limitado a espécies que são suscetíveis a transformação, mutagênese química ou física pode ser aplicado a uma ampla gama de espécies. No entanto, a caracterização das mutações derivadas de mutagênese química ou física tradicionalmente baseia-se numa abordagem de clonagem baseados no mapa, que é a mão de obra intensiva e demorado. Aqui, nós mostramos que uma plataforma de hibridação genômica comparativa baseada em array (protocolo) do genoma de alta densidade pode ser aplicada para eficientemente detectar e caracterizar cópia números variações (CNVs) em mutantes derivados de mutagênese de bombardeio (FNB) de neutrões rápidos em Medicago truncatula, uma espécie de vegetal. Análise de sequências do genoma inteiro mostra que existem mais de 50.000 genes ou modelos de gene em M. truncatula. No presentes, induzida pelo FNB mutantes em M. truncatula são derivadas de mais de 150.000 linhas M1, representando inestimáveis recursos genéticos para estudos funcionais de genes no genoma. A plataforma de protocolo descrita aqui é uma ferramenta eficiente para caracterizar os mutantes FNB-induzida em M. truncatula.

Introdução

Leguminosas (Fabaceae) são a terceira maior família de plantas, com muitas espécies economicamente importantes, tais como a soja (Glycine max) e alfafa (Medicago sativa). Os legumes podem interagir com bactérias fixadoras de nitrogênio solo, geralmente chamado de Rhizobia desenvolver nódulos de raiz no qual o dinitrogênio atmosférico é reduzido a amônia para uso pela planta hospedeira. Como tal, o cultivo de culturas de vegetal requer pouca entrada de fertilizantes nitrogenados e, portanto, contribui para uma agricultura sustentável. Culturas de vegetal produzem folhas e sementes com conteúdo de alta proteína, servindo como forragem excelente e colheitas de grão. No entanto, a espécie vegetal cultivada geralmente têm estruturas complexas do genoma, fazendo estudos funcionais de genes que desempenham papéis-chave em processos específicos de vegetal pesados. Medicago truncatula foi adotado extensamente como uma espécie de modelo para estudos de vegetal principalmente porque (1) ele possui um genoma diploide com um tamanho relativamente pequeno genoma haploide (~ 550 Mbp); (2) plantas estàvel transformam-se para estudos funcionais do gene; e (3) que está intimamente relacionado com alfafa (M. sativa), a rainha das forragens e muitas outras culturas economicamente importantes para estudos de translação. Recentemente, a sequência do genoma de M. truncatula cv Jemalong A17 tem sido lançado1,2. Anotação do genoma mostra que existem mais de 50.000 genes previstos ou modelos de gene no genoma. Para determinar a função da maioria dos genes do M. truncatula genoma é uma tarefa desafiadora. Para facilitar estudos funcionais de genes, uma coleção abrangente de mutantes no intervalo de mais de 150.000 M1 linhas foi gerada usando o mutagenesis de bombardeio (FNB) nêutrons rápidos em M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Nêutron rápido, um agente mutagénico ionização de alta energia, tem sido usado na geração de mutantes em muitas espécies de plantas, incluindo Arabidopsis5,6, arroz (Oryza sativa)7, tomate (Solanum lycopersicum), soja (Glycine soja; G. máx)8,9, cevada (Hordeum vulgare) e Lotus japonicus10. Uma grande parte das mutações derivadas de mutagénese FNB são devido a exclusões de DNA que variam em tamanho de alguns pares de bases a mega pares de base9,11. Muitos genes associados fenótipo foram com êxito identificado e caracterizado4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. anteriormente, clonagem molecular dos genes subjacentes de mutantes FNB baseou-se em uma abordagem baseada em mapa, que é demorado e limita o número de mutantes para ser caracterizada a nível molecular. Recentemente, várias abordagens complementares, incluindo métodos baseados em transcrição, genoma telhar hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) para detecção de variação número do DNA cópia e sequenciamento do genoma inteiro, têm sido empregada para facilitar o caracterização de mutantes de exclusão em diversos organismos, incluindo animais e plantas20,21,22,23,24,25, 26,,27,28,29,30,31.

Para facilitar a caracterização de mutantes FNB em M. truncatula, uma todo-genoma baseada em array genômica hibridação comparativa (CGH) plataforma foi desenvolvida e validada. Conforme relatado em sistemas de animais, a plataforma CGH baseada em array permite a detecção de variações de número de cópia (CNVs) ao nível do genoma inteiro em mutantes M. truncatula FNB. Além disso, as lesões podem ser confirmadas por PCR e fronteiras de exclusão podem ser identificadas por sequenciamento. Em geral, a plataforma CGH matriz é uma ferramenta eficiente e eficaz na identificação de lesões em mutantes de M. truncatula FNB. Aqui, o procedimento CGH matriz e caracterização de PCR das fronteiras de exclusão em um mutante FNB M. truncatula são ilustrados.

O seguinte protocolo fornece etapas experimentais e informações sobre os reagentes, equipamentos e ferramentas de análise para os investigadores que estão interessados na realização de análise de hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) do genoma inteiro do número de cópia variações nas plantas. Como exemplo, Medicago truncatula FN6191 mutante foi usado para identificar regiões de exclusão e associados com fenótipos mutantes de genes candidatos. M. truncatula FN6191 mutante, originalmente isolada de um neutrão rápido exclusão induzida por bombardeio mutante coleção32 (ver Tabela de materiais), exibiu um fenótipo de hipernodulação após a inoculação com o solo bactéria, tem Sihorhizobium Sm1021, em contraste com as plantas do tipo selvagem.

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Protocolo

Nota: a Figura 1 mostra as cinco etapas para a matriz de protocolo CGH. Eles são: 1) preparação dos materiais de planta; 2) o isolamento de amostras de DNA de alta qualidade; 3) rotulagem e purificação de amostras de ADN; 4) hibridização, lavagem e varredura de matrizes de genoma inteiro; e 5) a análise dos dados CGH. Matrizes de azulejos de genoma inteiro M. truncatula contêm um total de 971.041 prova de oligo exclusivo visando a mais de 50.000 genes ou modelos de gene no genoma (ver tabela de materiais). As sondas originais são espaçadas aproximadamente cada 150 pares de bases (bp) em regiões exônicos e 261 bp em regiões intrônicas do genoma de M. truncatula.

1. preparação de materiais vegetais

  1. Scarify selvagem tipo (WT; M. truncatula cv Jemalong A17) e FN6191 sementes mutantes com ácido sulfúrico concentrado durante 8 min (ver Tabela de materiais). Remova e descarte o ácido sulfúrico para um contentor de resíduos líquido.
  2. Enxaguar as sementes com água destilada esterilizada três vezes.
  3. Superfície de esterilizar as sementes com solução 20% durante 10 min.
  4. Enxaguar as sementes com água destilada esterilizada três vezes.
  5. Sementes de loja a 4 ° C, durante 3 dias. Após a vernalização, transferência e germinar as sementes no solo para uma semana em uma câmara de crescimento com 16 h/8 h ciclo claro/escuro e 150 µE/m 2 /s da intensidade de luz.
  6. Transplante de mudas para potes de 1 galão e cultivá-las em uma estufa com ciclo claro/escuro de 16 h/8 h, 150 µE/m 2 /s intensidade luminosa por três a quatro semanas. Recolher amostras de folha jovem de plantas para isolamento do DNA.

2. Isolamento de amostras de DNA de qualidade alta

  1. tomar 1G de tecido de folha jovem de uma planta e congelá-lo imediatamente em azoto líquido.
  2. Tecido de folha congelada em nitrogênio líquido com um almofariz e um pilão de pó fino de moer.
  3. Isolar o DNA genômico com um isolamento de DNA kit (veja a Tabela de materiais).
  4. Ressuspender purificado amostras de DNA em 50 µ l de autoclave duplo desionizada H 2 O (ddH 2 O) ou tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.0) 1x.
  5. Concentrações de DNA de medida com um espectrofotômetro (ver Tabela de materiais).
  6. Avaliar 260 nm/280 nm e 260 nm/230 rácios de nm de amostras de DNA.
    Nota: As amostras de DNA de alta qualidade devem ter uma relação de nm nm 260/280 ≥ 1.8 e um rácio de nm nm/260 230 ≥ 2.0.
  7. Mais avaliar amostras de DNA, executando-as em 1% gel de agarose.
    Nota: Amostras de DNA de alta qualidade devem ter alto peso molecular e não devem ser contaminadas por RNA. Idealmente, a concentração final de amostras de DNA deve ser ~ 150 ng / µ l.

3. Rotulagem de DNA e purificação

  1. diluir 1 µ g de DNA genômico de amostras com DDQ 2 O até um volume final de 20 µ l em um tubo de centrífuga de 500 µ l.
  2. Adicionar 5 µ l de um primer aleatório (ver Tabela de materiais) para o tubo.
  3. Vortex o tubo momentaneamente e colocá-lo em um thermocycler para incubar e desnaturar o DNA a 98 ° C por 10 min.
  4. Pegue o tubo fora do thermocycler e colocá-lo imediatamente em água gelada para esfriar por 5 min.
  5. Misturas de preparar dois rotulagem conforme mostrado na tabela 1.
  6. Tubos de adicionar 25 µ l de rotulagem misturas 1 e 2 a referência DNA e DNA da amostra, respectivamente.
  7. Misture a mistura de rotulagem e DNA pipetando três vezes e girar os tubos brevemente.
  8. Colocar os tubos em um thermocycler para incubar a 37 ° C por 2 h e em seguida a 65 ° C por 20 min inativar a enzima Klenow-exo (ver Tabela de materiais).
  9. Adicionar 430 µ l de tampão TE a cada tubo 1x.
  10. Misturar o conteúdo e girar os tubos brevemente.
  11. Transferência da solução no tubo em uma coluna de purificação com uma coleção de 2 mL do tubo (ver Tabela de materiais).
  12. Centrífuga da coluna de purificação a 14.000 x g durante 10 min.
  13. Descartar o passar solução.
  14. Adicionar 480 µ l 1 x buffer de TE para cada coluna.
  15. Centrifugar a coluna novamente a 14.000 x g, durante 10 min.
  16. Eliminar a solução passagem.
  17. Transferir a amostra de DNA etiquetada que permanece na parte inferior da coluna para um novo tubo de centrifuga.
  18. Medir o volume da amostra do DNA rotulado com uma pipeta e trazer o volume final de 80 µ l com tampão TE 1x.
  19. Medir a concentração da amostra do DNA etiquetada usando um espectrofotômetro (ver Tabela de materiais).
  20. Misturar uma quantidade igual de rotuladas amostra de DNA e DNA de referência e trazer o volume final a 160 µ l de tampão TE 1x com o.
  21. Adicionar 256 µ l de 2x do tampão de hibridização, 50 µ l de DNA humano berço-1 e 50 µ l de 10 × agente bloqueio de protocolo (ver Tabela de materiais) e misturá-los bem pipetando por três vezes.
  22. Gire os tubos brevemente e colocá-los em um thermocycler para incubar a 98 ° C por 10 min.
  23. Incubar os tubos a 37 ° C por 20 min.

4. Hibridização, lavagem e digitalização das matrizes do genoma

  1. pré-aquecer o forno de hibridização a 67 ° C pelo menos 4 h antes do início da hibridação.
  2. Colocar um slide de vedação na base de uma câmara de hibridação.
  3. Carga 490 µ l da solução de hibridação partir 3.23 passo a lâmina junta.
  4. Cobrir o slide junta com um chip de microarray do genoma de Medicago truncatula para formar uma câmara de hibridação.
  5. Colocar as tampas de câmara de hibridação e aperte a câmara firmemente com grampos.
  6. Coloque a câmara de hibridação montado para o forno de hibridização e incubar a 67 ° C por 40-48 h.
  7. Slide preparar três pratos de lavagem: dois com 250 mL de tampão de lavagem mantidos em temperatura, e uma com tampão II de lavagem mantida a 37 ° C.
  8. Slide Prepare dois frascos de lavagem: um com 70 mL acetonitrilo e outro com solução de secagem e estabilização de 70 mL; manter os dois em uma coifa em temperatura ambiente (ver Tabela de materiais).
  9. Retire a câmara de hibridação do forno e remova os grampos da câmara e tampa.
  10. Mover a microplaqueta de microarray e Gaxeta deslize para um prato de lavagem de slide com tampão de lavagem eu e separam o chip no slide de tampa de.
  11. Mover o microarray chip para a lavagem de slide segunda prato com tampão de lavagem eu e circular suavemente a solução com uma barra de agitação em uma placa de agitação magnética em temperatura ambiente por 5 min.
  12. Transferência do microarray do chip para o terceiro slide lavar prato com tampão de lavagem previamente aquecido II e lavá-lo suavemente com uma barra de agitação em uma placa de agitação magnética a 37 ° C por 1 min.
  13. Transferir o chip de microarray para um slide lavar a jarra com acetonitrilo em uma coifa e lavá-lo por 30 s.
  14. Transferir o chip de microarray para um slide jar com estabilização de lavagem e secagem de solução e lave-o por 30 s.
  15. Tire o chip lentamente e secá-lo por 1 min.
  16. Scan o chip de microarray usando um scanner (ver Tabela de materiais) de 2 µm de resolução. Definir parâmetros para salvar várias imagens e todo deslize varreduras. Definir canais 1 e 2 de ganhos de 100% e cancelar o auto ganho.

5. Análise de dados de CGH

  1. extrato da fluorescência Cy3 e Cy5 intensidades para cada sonda na matriz usando o software de digitalização (ver Tabela de materiais).
  2. Análise de segmentação de utilização do software para detectar variações de número de cópia (CNVs) entre a amostra DNA e o DNA de referência. Use um limite dos segmento média de log 2 amostra/referência relação ± 2,5 desvios-padrão para determinar CNVs.
  3. Inspecionar a distribuição das taxas de amostra/referência 2 log através do genoma inteiro usando um software de mapeamento de sinal (ver Tabela de materiais).

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Resultados

A Figura 2 mostra a distribuição da proporção de2 registo normalizado do mutante contra WT sinais em todo o genoma inteiro. A análise dos dados CGH revelou uma aproximada 22 kb exclusão no cromossomo 4 que abrange o inteiro SUNN gene33 e diversas outras anotado genes em mutante FN6191 (Figura 2, Figura 3). A região de candidatos excluídos foi cobert...

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Discussão

Nós desenvolvemos uma plataforma CGH baseada em array para a detecção e caracterização de bombardeamento de neutrões rápidos (FNB)-induzido mutantes em M. truncatula CV Jemalong A17. Para demonstrar o uso da matriz método CGH na detecção de mutações genéticas, realizamos análise de protocolo do mutante FN6191, que exibiu um fenótipo de hipernodulação em contraste com plantas de tipo selvagem, quando inoculados com S. tem Sm1021. Para a análise de segmentação, um segmento foi consider...

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Divulgações

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Agradecimentos

Financiamento deste trabalho é fornecido em parte por uma concessão do NSF planta Genome Research (IOS-1127155).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Medicago truncatula genome array, 1 x 1 MAgilentG4123A
Medicago truncatula FN6191 (mutant)In houseFN6191
Medicago truncatula Jemalong A17 (reference)In houseA17
Sulfuric acidSigma-Aldrich320501
DNeasy Plant Mini KitQiagen69104
Nanodrop SpectrophotometerThermo Scientific1000D
SureTag DNA Labeling KitAgilent5190-3400
Random primerAgilent5190-3399
AcetonitrileSigma-Aldrich271004-1L
ThermocyclerMJ researchPTC-200
CentrifugeLabnet international IncSpectrafuge 24D
Stabilization and Drying SolutionAgilent5185-5979
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization KitAgilent5188-5380
Hybridization Chamber gasket slidesAgilentG2505
Human Cot-1 DNAAgilent5190-3393
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2Agilent5188-5221
Hybridization Chamber, stainlessAgilentG2534A
Hybridization ovenAgilentG2545A
Purification ColumnsAgilent5190-3391
Laser scannerRocheMS200
NimbleScan 2.6Roche Nimblegen5225035001
Signal Map 1.9Roche NimblegenSignalmap1.9

Referências

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