Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen umgekehrte vertikale Invasion-Assay, der verwendet werden könnten, um die Migration und Invasion Funktionen von Zellen in einer dreidimensionalen Umgebung unter Beibehaltung der Zelle Mikroumgebung zu quantifizieren. Dieser Test eignet sich für seltene und/oder empfindliche Zellen.

Zusammenfassung

Obwohl 3D Invasion Assays entwickelt worden sind, bleibt die Herausforderung, um Zellen zu untersuchen, ohne die Integrität ihrer Mikroumgebung. Traditionelle 3D Tests wie der Boyden Kammer erfordern, dass Zellen verdrängt vom ursprünglichen Speicherort, Kultur und zog in eine neue Umgebung. Nicht nur stört dies die zelluläre Prozesse, die untrennbar mit der Mikroumgebung sind, aber es führt oft zu einem Verlust von Zellen. Diese Probleme sind eine besondere Herausforderung im Umgang mit Zellen, die entweder selten oder extrem empfindlich auf ihrer Mikroumgebung. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines 3D Invasion-Assays, die beide Probleme vermeidet. In diesem Assay Zellen sind in einem kleinen gut beschichtet und eine ECM-Matrix mit einer Lockstoffgradient auf die Zellen gelegt. Dies erfordert keine Verschiebung der Zelle und ermöglicht es die Zellen, nach oben in die Matrix zu erobern. In diesem Test kann innerhalb der Kollagen-Gel Zellinvasion sowie Zellmorphologie beurteilt werden. Mit Hilfe dieser Assay, kennzeichnen wir die invasive Kapazität der seltene und empfindliche Zellen; die Hybridzellen infolge Fusion von Brustkrebs-Zellen MCF7 und mesenchymalen/multipotenten Zellen Stammzellen/Stroma (MSCs).

Einleitung

Zelle Motilität ist ein normaler Entwicklungs- und physiologischen Prozess der Zellen. Allerdings sind Änderungen in der Struktur und die Fähigkeit der Zellen zur Migration und Invasion mit pathologischen Zuständen, einschließlich der entzündlichen Erkrankungen und Krebs Metastasen^1,2,3verbunden. Metastasierung ist wohl der am wenigsten verstandenen Aspekt in der Krebstherapie. Um zu metastasieren, müssen Krebszellen zersetzen die extra-zellulären Matrix (ECM), erobern die lokalen Gewebe und Intravasate. Einmal im Umlauf werden die Krebszellen in den entfernten Standort verbreiten, Leber und sekundäre Tumore bilden. Daher die Fähigkeit der Zellen, die ECM zu vermindern, zu migrieren und zu erobern bezieht sich auf ihr metastatische Potential. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um zu analysieren und die Migration und Invasion Funktionen von Zellen zu quantifizieren. Die am häufigsten verwendeten Ansätze umfassen die Wundheilung Assay, Time-Lapse-Mikroskopie und Boyden Kammer Assay. Die Wunde heilende Assay⁴ und Zeit verfallen Mikroskopie sind einfache und bequeme Assays, die ersten Einblick in die Zellwanderung geben würde. Jedoch sind beide 2D Assays, die nicht die 3D-Umgebung widerspiegeln, die wie Zellen in Vivoexistieren. Studien haben gezeigt, dass Zellen in einer 3D Umgebung im Vergleich zu einem 2D eine^5,6unterschiedlich reagieren. Darüber hinaus sind heilende Wunde Assays schwer zu reproduzieren und zu quantitativen Ergebnissen^7,8,9ergeben. Die Zelle Sperrzone Assay, die eine 3D Modifikation der Wundheilung Assay ist, ist ein mehr physiologisch relevanten Assay aber es ist nicht geeignet für niedrige Zahl wie z. B. Hybridzellen aus Zelle Fusion Veranstaltungen^{10,11 Zellen} .

Boyden Kammer Assay ist ein 3-dimensionales Assay, der zelluläre Studien relevanten Mikroumgebungen vorsieht. Es erfordert jedoch Zellen aus ihrer ursprünglichen Mikroumgebung entfernt werden und in der oberen Kammer des Boyden-Testsystem zu migrieren und dringen nach unten in Richtung der Lockstoffgradient enthaltenden Medium hinterlegt werden. Diese 3D Methode eignet sich nicht bei der Analyse der Migration und Invasion Fähigkeit der Zellen, die anfällig für ihre Mikroumgebung und/oder in begrenzter Anzahl^10,11,12. Ein neuer Ansatz zur Zelle Migration und Invasion zu analysieren ist der mikrofluidischen gradient Kammer Assay¹³. Obwohl geeignet und zuverlässig in der Migration und Invasion Studien, dieser Test ist teurer und für ein typisches Labor technisch schwierig sein könnte. Wir beschreiben hier einen einfache umgekehrte vertikale Invasion-Assay, der kompatibel mit vielen Zelltypen, einschließlich der Zellen empfindlich auf ihrer Mikroumgebung und/oder beschränkter Zahl ist. Dieser Test wurde von dem Protokoll vorgeschlagen von Hooper Et al. ¹⁴. in diesem Test die Zellen bleiben in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung und ihrer Migration und Invasion wird überwacht, da sie nach oben in das Kollagen-Gel mit einem Lockstoffgradient¹¹bewegen. Dieser Assay ist reproduzierbar und optimiert und validiert in der Kulturschale von 35 mm. Es könnte verschiedene Assay-Bedingungen, einschließlich der verschiedenen Zellgrößen Kultur, verschiedenen Matrizen oder Stärke der Adhäsion und verschiedenen Chemoattractants angepasst werden. Dieser Test könnte als in-vitro- Plattform für die erste Sichtung in der Arzneimittelforschung dienen.

Protokoll

Hinweis: Dieses Protokoll ist im McArdle Et Al. beschrieben. ¹¹. eine Zeitleiste finden Sie in Abbildung 1.

1. Vorbereitung der Kultur-Platte

1. Waschen Sie die 35-mm-Kulturschale mit einem 10-mm-Glasboden mit 1 mL 1 M Salzsäure (HCl) für 15 min, Hydrophobie der Glasboden zu senken.
2. Waschen Sie die Kultur-Platte zweimal mit 1 mL der Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (PBS) get rid of der HCl.
3. Waschen Sie die Platte Kultur zweimal mit 1 mL 70 % igem Ethanol.
4. Spülen Sie die Kultur-Platte mit 1 mL der spezifischen Zellkulturmedium (hier Gebrauch α-MEM ergänzt mit 10 % Hitze inaktiviert FBS und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren).
   Hinweis: Die behandelten Kultur-Platte mit dem Kulturmedium kann erst am nächsten Tag in der CO₂ Inkubator mit einem Luftbefeuchter bei 37 ° C gespeichert werden.
5. Wachsen Sie die Zellen (MSCs und MCF-7 Co Kultur) zu 100 % Konfluenz in den behandelten Glasboden gut von der 35-mm-Kulturschale. Gemeinsam Kultur 35.000 MSC Zellen und 75.000 MCF7 Zellen für 24 h.

2. Vorbereitung der Kollagen-Gel

1. Die Mikropipette Tipps für pipettieren die Kollagen-Gel in den Gefrierschrank verwendet, um zu verhindern, dass die Polymerisation des Kollagens bei Kontakt zu speichern.
   Hinweis: Dies ist der wichtigste Schritt.
2. Bestimmen Sie ein Volumen von Ratte Schweif Kollagen ich verwendet werden basierend auf die Konzentration von Kollagen-Lager. Dieser Assay 100 µL Kollagen Gel vorbereiten.
   Hinweis: Hoher Konzentration von Ratte Schweif Kollagen, die ich auf Lager funktioniert besser. Bestimmen Sie die Lautstärke von 10 x Dulbeccos geändert Eagle Medium verwendet werden, um das Kollagen entsprechend zu verdünnen.
3. Kombinieren Sie auf Eis Ratte Schweif Kollagen I (3,8 µg/mL Brühe), 10 X Dulbecco geändert Eagle Medium und 1 X Zellkulturmedium ergänzt um 2 % fötalen Rinderserum und die entsprechenden Lockstoffgradient auf eine Endkonzentration von Kollagen von 2,4 mg/mL.
4. Hinzu kommt die Mischung 4,5 % Natriumbikarbonat-Lösung, die Kollagen-Gel zu neutralisieren.
   Hinweis: Das Volumen der Natriumbicarbonat-Lösung hinzugefügt variieren basierend auf der genauen pH-Wert der anderen Reagenzien. Es empfiehlt sich, die Mischung mit pH-Streifen, neutrale Lösung zu gewährleisten, oder verwenden Sie einen pH-Indikator in das Kulturmedium zu testen.
5. Legen Sie über die Zellen innerhalb der Glasboden gut von der Kulturschale 80 µL der Kollagen-Mischung.
6. Lassen Sie das Kollagen-Gel zu polymerisieren für 30 min in einem CO₂ Inkubator mit einem Luftbefeuchter bei 37 ° C.
7. Decken Sie das Kollagen-Gel mit 2 mL Zelle Medium mit reduzierten Serum (2 %) und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einem CO₂ Inkubator mit einem Luftbefeuchter für 24, 48 oder 72 h.
   Vorsicht: Die Platte sollte mit Sorgfalt zu verhindern, dass das Kollagen-Gel aus der Glasboden behandelt werden.

3. Beispiel der Herstellung von Kollagen gel mit einer Ratte Kollagen Reitstock von 3,8 µg /mL

1. Kombinieren Sie auf dem Eis 114,5 µL Ratte Schweif Kollagen, 16,6 µL 10 x DMEM und 33,1 µL Kulturmedium, enthält die Lockstoffgradient.
2. Neutralisieren Sie die Kollagen-Mischung mit 14,0 µL Natriumbicarbonat.
3. Weiter wie in Schritt 2.5.

4. Bildgebung der Zellen

1. Entfernen Sie vorsichtig die Medien aus der Schale.
2. Sanft spülen Sie das Gel mit 1 mL PBS.
3. Befestigen Sie die Zellen mit 1 mL 4 % Paraformaldehyd für 15 Minuten.
4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 mL PBS.
5. Färben Sie die Zellen mit DAPI-Lösung (100 ng/mL) für 20 min bei Raumtemperatur.
6. Bild der Zellen unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops an verschiedenen Standorten und 400 µm Z-Stapel Bilder von jedem Standort in 16 µm Schritten. Das Mikroskop verwendet hat eine Festplatte, die Scan-Einheit, die konfokale Bildgebung mit einem weißen Licht, Bogen Anregungsquelle ermöglicht. Verwenden Sie ein 20 X Objektiv mit numerischer Apertur von 0,75 genutzt.
7. Bilder zu rekonstruieren.
   1. Öffnen Sie Bilder für ein bestimmtes Gel (ca. 25 Bilder) und erstellen Sie einem Bildstapel zu, indem Sie auf Bild → Stapel → Bilder stapeln. Das erste Bild entsprach der Unterseite des Gels (Z = 0 µm), das zweite Bild entsprach der erste Schritt in Z-Richtung (Z = 16 µm), das dritte Bild entsprach der zweite Schritt in Z-Richtung (Z = 32 µm). Beurteilen Sie jeder Kern in jedem Bildtiefe zu und benennen Sie die Tiefe, an der die Keimzelle im schärfsten Fokus als die Invasion Tiefe für diese bestimmten Zelle war.

Ergebnisse

Wir haben eine 35-mm-Kulturschale mit einem Glas unten und Ratte Schweif Kollagen verwendet ich entwickeln und optimieren einer in-vitro- 3D Invasion assay Protokoll. Mit diesem Test, wir haben gezeigt, dass Brust Krebszellen MCF7 und MSC Zellen könnte dringen in das Kollagen-Gel in einer mittleren Entfernung von 0,04 ± 1,8 µm und 41,3 ± 76,0 µm bzw. nach 48 h bei IGF1 (18.6 ng/mL) diente als Lockstoffgradient (Abbildung 2). Noch wichtiger ist, ...

Diskussion

Hier beschreiben wir eine einfache umgekehrte vertikale Invasion-Probe, die eignet sich für eine Vielzahl von Zelltypen, einschließlich der Zellen, die seltene und/oder ihrer Mikroumgebung abhängig sind. In diesem 3D Invasion-Assay Zellen bleiben in ihrer ursprünglichen Mikroumgebung und fallen unter das Kollagen-Gel mit einem Lockstoffgradient. Die Zellen dann migrieren und dringen in das Kollagen. In diesem Test werden die Zellen gefärbt und leicht in das Gel überwacht. Die Einfachheit und Reproduzierbarkeit des ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MatTek P35G-1.5-10C	MatTek Corporation, Ashland, MA	P35G-1.5-10-C	mattek glass bottom dishes
Rat tail collagen I	Corning, Corning, NY, USA	354236	Collagen gel
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	H1758	HCl
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	10010023	PBS
10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	D2429	10X DMEM
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	S5761	NaHCO3
Confocal Fluorescent microscope	Olympus America, Center Valley, PA, USA	Olympus IX81	Confocal  microscope
Defined Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA	SH30070.03	FBS
Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope	Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA	40x NA 0.8 objective	MPLSM
Imaris software	Bitplane Inc. Zurich, CH	Imaris 7.5.2	Imaris software
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	D9542	DAPI
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	50980487	PFA
α-minimum essential medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	M0894
MDA-MB-231	ATCC; Manassas, VA, USA	HBT-22
MSC	Trivedi and Hematti, 2007
20X lens UPLAPO	Olympus America, Center Valley, PA, USA	36-064	Olympus UPLSAPO 20X Objective