Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Resumo

Este protocolo descreve um ensaio de invasão vertical invertida que poderia ser usado para quantificar os recursos de migração e invasão de células em uma configuração tridimensional, preservando o microambiente celular. Este ensaio é adequado para células raras e/ou sensíveis.

Resumo

Embora a invasão 3D ensaios têm sido desenvolvidos, persiste o desafio de estudar células sem afetar a integridade do seu microambiente. Ensaios de 3D tradicionais tais como a câmara de Boyden exigem que as células são deslocadas do local cultura original e mudou-se para um novo ambiente. Não só faz isso atrapalhar os processos celulares que são intrínsecos para o microambiente, mas muitas vezes resulta em uma perda de células. Estes problemas são especialmente desafiadoras quando se lida com as células que são raros ou extremamente sensível ao seu microambiente. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um ensaio de invasão 3D que evita as duas preocupações. Neste ensaio, as células são banhadas dentro de um pequeno bem e uma matriz de ECM contendo um quimiotático é colocada no topo das células. Isto requer nenhum deslocamento de célula e permite que as células invadir para cima dentro da matrix. Neste ensaio, invasão da célula, bem como a morfologia da célula pode ser avaliada dentro do gel de colágeno. Usando este teste, podemos caracterizar a capacidade invasiva das células de raras e sensíveis; as células híbridas resultantes da fusão entre células de câncer de mama MCF7 e mesenquimais/multipotentes haste/estroma células (MSCs).

Introdução

Motilidade celular é um processo fisiológico e de desenvolvimento normal das células. No entanto, as mudanças no padrão e a capacidade das células para migrar e invadir estão associadas com condições patológicas, incluindo doenças inflamatórias e câncer metástase^1,2,3. Metástase é, sem dúvida, o aspecto mais mal compreendido em câncer. Para metástase, as células cancerosas deve degradar a matriz extracelular (ECM), invadir o tecido local e intravasate. Uma vez em circulação, as células cancerosas vão divulgar o site distante, extravasate e formar tumores secundários. Portanto, a capacidade das células para degradar o ECM, para migrar e invadir está relacionada ao seu potencial metastático. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidos para analisar e quantificar os recursos de migração e invasão de células. As abordagens mais utilizadas incluem a ferida cura ensaio, microscopia de lapso de tempo e o ensaio de câmara Boyden. A ferida cura ensaio⁴ e tempo lapso microscopia são ensaios simples e convenientes que dariam preliminar insight sobre migração celular. No entanto, ambos são ensaios 2D que não refletem o ambiente 3D, no qual existem células em vivo. Estudos têm mostrado que as células respondem de forma diferente para um ambiente 3D em comparação com um 2D^5,6. Além disso, ensaios de cura ferida são difíceis de reproduzir e produzir resultados quantitativos^7,8,9. O ensaio da zona de exclusão de célula, que é uma modificação 3D da ferida do ensaio de cura, é um ensaio mais fisiologicamente relevante, mas não é apropriado para células baixas no número como células híbridas resultantes de célula fusão eventos^10,11 .

O ensaio de câmara Boyden é um ensaio 3-dimensional que fornece o microambiente relevantes para estudos celulares. No entanto, requer células para ser removido de seu microambiente original e depositados na câmara superior do sistema de ensaio de Boyden, migrar e invadir para baixo em direção a médio contendo quimiotático. Esta abordagem 3D não é apropriada ao analisar a capacidade de migração e invasão de células vulneráveis ao seu microambiente e/ou limitada em número de^11,de^10,12. É uma abordagem mais recente para analisar a invasão e a migração celular gradiente câmara microfluidic ensaio¹³. Embora adequados e fiáveis em estudos de migração e invasão, este ensaio é mais caro e pode ser tecnicamente desafiador para um laboratório típico. Descrevemos aqui um ensaio de invasão vertical invertida simples que é compatível com muitos tipos de células, incluindo células sensíveis ao seu microambiente e/ou limitados em número. Este ensaio foi adaptado a partir do protocolo proposto pela Hooper et al ¹⁴. neste ensaio, as células permanecem na sua original microambiente e sua migração e invasão é monitorado como eles se movem para cima no gel de colágeno contendo um quimiotático¹¹. Este ensaio é reprodutível e foi otimizado e validado no prato 35mm cultura. Isso pode ser adaptado às condições de ensaio diferentes incluindo tamanhos de cultura de células diferentes, diferentes matrizes ou força de adesão e diferentes quimioatraentes. Este ensaio poderia servir como uma plataforma em vitro para triagem inicial no processo de descoberta de drogas.

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Protocolo

Nota: Este protocolo é descrito no McArdle et al . ¹¹. um cronograma é fornecido na Figura 1.

1. preparação da placa de cultura

1. Lave o prato de 35mm cultura contendo um vidro de 10 mm-fundo bem com 1 mL de ácido clorídrico de 1 M (HCl) por 15 min abaixar a hidrofobicidade do vidro-fundo.
2. Lave a placa de cultura duas vezes com 1 mL de solução salina tampão de fosfato (PBS) para se livrar de todo o HCl.
3. Lave a placa de cultura duas vezes com 1 mL de etanol a 70%.
4. Lave a placa de cultura com 1 mL de meio de cultura celular específica (aqui, uso α-MEM suplementado com 10% de calor inativada FBS e 1% não aminoácidos essenciais).
   Nota: A placa de cultura tratada contendo meio de cultura pode ser armazenada a incubadora de CO₂ com um humidificador a 37 ° C até o dia seguinte.
5. Crescem as células (MSCs e cultura co MCF-7) em vidro-fundo tratado bem do prato 35mm cultura a confluência de 100%. Co cultura 35.000 células MSC e 75.000 de células MCF7 por 24 h.

2. preparação do gel de colágeno

1. Armazene as pontas de micropipeta usadas para pipetar o gel de colágeno no congelador para evitar a polimerização do colágeno em cima do contato.
   Nota: Este é o passo mais crítico.
2. Determinar um volume de colágeno de cauda de rato eu deve ser usado com base na concentração do estoque de colágeno. Prepare-se 100 µ l de gel de colágeno para este ensaio.
   Nota: Alta concentração de colágeno de cauda de rato que armazeno funciona melhor. Determine o volume de 10 x meio modificado águia de Dulbecco a ser usado para diluir o colágeno em conformidade.
3. Combine, colágeno de cauda de rato gelo I (3.8 µ g/mL caldo), médio modificado águia de 10 x Dulbecco e 1 x celular cultura suplementado com 2% de soro fetal bovino e o apropriado quimiotático para uma concentração final de colágeno de 2,4 mg/mL.
4. Adicione à mistura 4.5% da solução de bicarbonato de sódio para neutralizar o gel de colágeno.
   Nota: O volume de solução de bicarbonato de sódio adicionado pode variar de acordo com o pH exato dos outros reagentes. É melhor para testar a mistura com tiras de pH para garantir solução neutra, ou usar um indicador de pH do meio de cultura.
5. Disponha as células dentro do vidro-fundo bem do prato cultura 80 µ l da mistura de colágeno.
6. Permitir que o gel de colágeno polimerizar durante 30 min numa incubadora de CO₂ com um humidificador a 37 ° C.
7. Cubra o gel de colágeno com 2 mL de meio de celular com soro reduzido (2%) e incube as celulas a 37 ° C, uma incubadora de CO₂ com um umidificador para 24, 48 ou 72 h.
   Atenção: A placa deve ser manipulada com cuidado para evitar que o gel de colágeno desanexação da parte inferior do vidro.

3. exemplo de preparação de colágeno gel usando um estoque de colágeno de cauda de rato de 3.8 µ g /mL

1. No gelo, combine 114.5 µ l de colágeno de cauda de rato, 16,6 µ l de 10 x DMEM e 33,1 µ l de meio de cultura contendo o quimiotático.
2. Neutralize a mistura de colágeno com 14,0 µ l de bicarbonato de sódio.
3. Continue como na etapa 2.5.

4. imagem latente das células

1. Remova cuidadosamente a mídia do prato.
2. Lave suavemente o gel com 1 mL de PBS.
3. Fixe as células com 1 mL de paraformaldeído 4% por 15 min.
4. Lave as células duas vezes com 1 mL de PBS.
5. Manche as células com solução DAPI (100 ng/mL) por 20 min em temperatura ambiente.
6. As células usando um microscópio confocal em locais diferentes e tomar 400 µm z-pilha imagens de cada local em 16 µm passos da imagem. O microscópio usado tem um disco de unidade que permite que a imagem latente confocal usando uma luz branca, fonte de excitação do arco de digitalização. Use um 20 X lente utilizada com abertura numérica de 0,75.
7. Imagens de reconstituir.
   1. Abrir imagens para um determinado gel (aproximadamente 25 imagens) e criar uma pilha de imagem clicando em imagem → pilhas → imagens de pilha. A primeira imagem que correspondia à parte inferior do gel (z = 0 µm), a segunda imagem correspondeu à primeira etapa na direção z (z = 16 µm), a terceira imagem correspondia à segunda etapa na direção z (z = 32 µm). Avaliar cada núcleo em cada profundidade de imagem e designar a profundidade na qual o núcleo foi em foco mais nítido como a profundidade de invasão para essa célula específica.

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Resultados

Nós usamos um prato de cultura 35mm com um vidro inferior e rato cauda de colágeno para desenvolver e otimizar uma invasão 3D em vitro ensaio protocolo. Usando este ensaio, nós mostramos aquele peito de células cancerosas MCF7 e MSC células poderiam invadir para o gel de colágeno a uma distância média de 0,04 ± 1,8 µm e 41,3 ± 76.0 µm respectivamente, após 48 h quando IGF1 (18.6 ng/mL) foi usado como quimiotático (Figura 2). Mais impor...

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Discussão

Aqui, descrevemos um ensaio simples invasão vertical invertida que é conveniente para uma variedade de tipos de células, incluindo células que são raras e/ou dependente seu microambiente. Neste ensaio 3D invasão, as células permanecem em seu microambiente original em são cobertas pelo gel de colágeno contendo um quimiotático. As células então migram e invadem em colágeno. Neste ensaio, as células podem ser manchadas e facilmente monitoradas dentro do gel. A simplicidade e a reprodutibilidade deste teste o t...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MatTek P35G-1.5-10C	MatTek Corporation, Ashland, MA	P35G-1.5-10-C	mattek glass bottom dishes
Rat tail collagen I	Corning, Corning, NY, USA	354236	Collagen gel
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	H1758	HCl
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	10010023	PBS
10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	D2429	10X DMEM
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	S5761	NaHCO3
Confocal Fluorescent microscope	Olympus America, Center Valley, PA, USA	Olympus IX81	Confocal  microscope
Defined Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA	SH30070.03	FBS
Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope	Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA	40x NA 0.8 objective	MPLSM
Imaris software	Bitplane Inc. Zurich, CH	Imaris 7.5.2	Imaris software
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	D9542	DAPI
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	50980487	PFA
α-minimum essential medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	M0894
MDA-MB-231	ATCC; Manassas, VA, USA	HBT-22
MSC	Trivedi and Hematti, 2007
20X lens UPLAPO	Olympus America, Center Valley, PA, USA	36-064	Olympus UPLSAPO 20X Objective