Umfassenden Workflow zur genomweiten Identifizierung und Ausdruck Meta-Analyse von der ATL E3 Ubiquitin Ligase Genfamilie in Grapevine

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt das Verfahren für die Identifizierung und Charakterisierung einer Genfamilie in Grapevine, die zur Familie der Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 Ubiquitin Ligases angewendet.

Zusammenfassung

Klassifizierung und Nomenklatur der Gene in einer Familie können erheblich zur Beschreibung von der Vielfalt der kodierten Proteine und die Vorhersage von Familienfeiern basierend auf einige Features, wie beispielsweise das Vorhandensein von Sequenzmotive oder bestimmten beitragen Standorte für Post-translationale Modifikation und das Expressionsprofil Familienmitglieder unter verschiedenen Bedingungen. Diese Arbeit beschreibt ein detailliertes Protokoll für gen-Familie-Charakterisierung. Hier wird das Verfahren bis hin zur Charakterisierung der Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 Ubiquitin Ligase Familie in Grapevine angewendet. Die Methoden umfassen die genomweite Identifizierung von Familienangehörigen, die Charakterisierung des Gens Lokalisation, Struktur und Vervielfältigung, die Analyse der erhaltenen Protein Motive, die Vorhersage von Protein-Lokalisierung und Phosphorylierung-Sites sowie gen Expression profiling innerhalb der Familie in verschiedenen Datensätzen. Solches Verfahren, die zu weiteren Analysen je nach experimentellen Zwecken verlängert werden konnten, angewandt werden, für jede Genfamilie in alle Pflanzenarten für die genomische Daten verfügbar sind, und es liefert wertvolle Informationen um interessante Kandidaten zu identifizieren für funktionelle Studien geben Einblicke in die molekularen Mechanismen der Pflanze Anpassung an ihre Umwelt.

Einleitung

In den letzten zehn Jahren wurde viel Forschung in Grapevine Genomics durchgeführt. Weinrebe ist eine anerkannte wirtschaftlich relevanten Ernte, die ein Modell für die Forschung auf Fruchtentwicklung und die Reaktionen von Gehölzen auf biotischen und abiotischen Stress geworden ist. In diesem Zusammenhang die Freilassung von Vitis Vinifera CV PN40024 Genom in 2007¹ und seine aktualisierte Version in 2011² führte zu einer schnellen Ansammlung von "Omics" angelegte Daten und einen Ausbruch von Hochdurchsatz-Studien. Basierend auf die publizierten Sequenzdaten, die umfassende Analyse einer bestimmten gen-Familie (in der Regel bestehend aus Proteinen Austausch konservierte Motive, strukturelle und funktionelle Gemeinsamkeiten und evolutionären Beziehungen), kann jetzt durchgeführt werden, um zu entdecken sein molekulare Funktionen, Evolution und gen Expressionsprofile. Diese Analysen können tragen zum Verständnis, wie Genfamilien physiologische Prozesse auf eine genomweite Ebene steuern.

Ubiquitin vermittelten Abbau von wichtigen Proteinen, erfordern einen fein abgestimmte Umsatz um regelmäßige zelluläre Prozesse zu gewährleisten, sind viele Aspekte des Lebenszyklus der Anlage geregelt. Wichtige Bestandteile des Ubiquitin-vermittelten Abbauprozess E3 Ubiquitin Ligases, die für die Flexibilität des Systems, durch die Rekrutierung von Einzelzielen³verantwortlich sind. Dementsprechend stellen diese Enzyme eine riesige Genfamilie mit rund 1.400 E3 Ligase-Kodierung Gene in Arabidopsis Thaliana Genom⁴, jedes E3-Ubiquitin-Ligase handeln für Ubiquitination von zielgruppenspezifischen Proteinen vorhergesagt. Trotz der Bedeutung der Substrat-spezifische Ubiquitination in zellulären Verordnung in Pflanzen ist wenig bekannt über wie Ubiquitination-Signalweg reguliert wird und Zielproteine wurden nur in wenigen Fällen identifiziert. Die Entschlüsselung dieser Spezifität und Verordnung Mechanismen stützt sich zunächst auf die Identifizierung und Charakterisierung der verschiedenen Komponenten des Systems, insbesondere E3 Ligases. Unter Ubiquitin Ligases ist ATL Unterfamilie geprägt von 91 Mitglieder in A. Thaliana anzeigen eine RING-H2 Finger Domäne^5,6, einige von ihnen spielt eine Rolle in der Verteidigung und Hormon Antworten⁷identifiziert.

Der erste entscheidende Schritt zu definieren, die Mitglieder einer neuen gen-Familie ist die genaue Definition der Family-Features, z. B. Konsens Motive Schlüsselbereichen und Protein-Sequenz-Eigenschaften. In der Tat erfordert das zuverlässige Abrufen aller gen Familienmitglieder BLAST Analyse einige obligatorische Sequenz Merkmale in bestimmten Proteins Domänen verantwortlich für Protein-Funktion/Tätigkeit, als Protein-Signatur. Dies kann durch vorherige Charakterisierung derselben Genfamilie in anderen Pflanzenarten erleichtert oder erreicht durch die Analyse verschiedener Gene, die vermeintlich aus der gleichen Familie in verschiedenen Pflanzenarten, allgemeine Sequenzen zu isolieren. Die Familienmitglieder können dann individuell benannt werden, nach gemeinsamen Regeln, die von internationalen Konsortien für einen bestimmten Pflanzenarten besiedelt. Weinrebe zum Beispiel solche Verfahren auf die Empfehlungen des Ausschusses Super-Nomenklatur für Traube gen Annotation (sNCGGa), über den Bau einer phylogenetischen Baum einschließlich V. Vinifera und A. Thaliana unterliegt gen Familienmitglieder gen Anmerkung erlauben ausgehend von Nukleotid-Sequenzen⁸.

Chromosom Lokalisierung von Familienmitgliedern und gen Doppelarbeit Umfrage ermöglichen das Vorhandensein von Vollständiggenom oder Tandem duplizierten Genen Hervorhebung. Solche Informationen erscheint sinnvoll, vermeintliche Genfunktionen zu lüften, da es vielleicht funktionelle Redundanz zeigen oder unterschiedliche Situationen, d. h., nicht-Funktionalisierung, Neo-Funktionalisierung oder Sub-Funktionalisierung^{9 zeigen}. Beiden Neo - und sub - functionalization sind wichtige Ereignisse, die genetischen Neuheit, Pflanze Anpassung an sich verändernde Umgebungen¹⁰neue zelluläre Komponenten zur erstellen. Insbesondere Vervielfältigungen von ancestral Genen und Produktion neuer Gene wurden sehr häufig während der Evolution des Genoms Weinrebe und neugeformten Gene aus proximalen und Tandem Duplikationen in Grapevine waren wahrscheinlicher, produzieren neue Funktionen¹¹.

Ein weiterer wichtiger Faktor bei der Entschlüsselung Familie Genfunktion ist das transkriptomischen-Profil. Die Verfügbarkeit von öffentlichen Datenbanken den Zugriff auf eine riesige Menge an transkriptomischen Daten kann so ausgenutzt werden, um gen Familienmitglieder mit groß angelegten in Silico Expressionsanalysen mutmaßliche Funktionen zuweisen. In der Tat der eigentümliche Ausdruck einiger Gene in bestimmten Pflanzenorganen oder als Reaktion auf bestimmte Belastungen geben einige Hinweise auf die vermeintlichen Rollen der entsprechenden Proteine unter definierten Bedingungen und Hypothesen über mögliche Unterstützung zukommen Sub-Funktionalisierung von duplizierten Genen, verschiedene Herausforderungen zu reagieren. Zu diesem Zweck ist es wichtig, mehrere Datasets zu berücksichtigen: Diese können bereits vorhandene gen Ausdruck Matrizen, wie z. B. die genomweite transkriptomischen Atlas der Weinrebe Organe und Entwicklungsstadien¹², oder ad-hoc durch gebaut werden können Abrufen von transkriptomischen Datensätzen für die bestimmten Pflanzenarten definierten Belastungen ausgesetzt. Darüber hinaus können ein einfacher Ansatz mit zwei Matrizen, eines mit paarweisen Ähnlichkeit Daten und eines mit paarweisen Co Ausdruck Koeffizienten angewendet werden um die Beziehungen zwischen Reihenfolge Ähnlichkeit und Ausdruck Muster innerhalb einer Genfamilie zu bewerten.

Diese Arbeit soll einen globalen Ansatz, Definition der Genstruktur, konserviertes Protein Motive, chromosomalen Position, gen Duplikationen und Expressionsmuster, als auch die Vorhersage von Protein Lokalisierung und Phosphorylierung Websites erreichen eine vollständige Charakterisierung einer Genfamilie in Pflanzen. Ein umfassender Ansatz wird hier auf die Charakterisierung der ATL E3 Ubiquitin Ligase Familie in Grapevine angewendet. Entsprechend der neuen Rolle des ATL Unterfamilie Mitglieder bei der Regulierung der wichtige zelluläre Prozesse⁷, diese Arbeit gut helfen die Identifizierung der starke Kandidaten für funktionelle Studien, und schließlich die molekularen Mechanismen zu entwirren der Anpassung von diesem wichtigen Kulturpflanzen auf seine Umgebung.

Protokoll

1. Identifizierung des vermeintlichen ATL Genfamilie Mitglied(er)

1. PSI-BLAST-Web-version
   1. Öffnen Sie BLAST Webseite¹³ , und klicken Sie auf Abschnitt Protein BLAST.
   2. Geben Sie im Feld "Enter Abfrage Sequence" die Aminosäure-Sequenz des Proteins (hier VIT_05s0077g01970), der als Sonde verwendet wird, um die anderen Familienmitglieder zu identifizieren.
      Hinweis: Ein guter Vertreter Protein sollte sein (ein Protein zeigt alle wichtigen Features, die die Familie charakterisieren) verwendet.
   3. Wählen Sie im Feld "Wählen Sie Suchgruppe" der "Referenz-Protein" Datenbank (Refseq_protein) und den Organismus von Interesse (V. Vinifera - Taxid:29760).
   4. Wählen Sie in das Feld "Programmauswahl" PSI-BLAST-Algorithmus aus und klicken Sie auf die Schaltfläche "BLAST", um die Analyse zu starten.
      Hinweis: Durch Klicken auf die "Algorithmusparameter" ist es möglich, einige erweiterte Parameter (Max Zielsequenzen, Scoring Matrix, PSI-BLAST-Schwelle, etc.).
   5. Die erste Explosion Runde ruft alle Sequenzen, die relevanten Treffer mit der Abfrage anzeigen (e-Wert über dem ausgewählten Schwellenwert - standardmäßig 0,005; 0,001 in diesem Experiment). Deaktivieren Sie alle Einträge, die eindeutig nicht gehören zur Familie Prüfung durch einen Klick auf das Häkchen in der Spalte "Select für PSI-BLAST" und die zweite PSI-BLAST-Iteration durch Klicken auf die Schaltfläche "BLAST", wie in Schritt 1.1.4 laufen.
   6. Neu identifizierte Sequenzen sind gelb markiert. Deaktivieren Sie der eindeutig falsch abgerufen am Hits und entdecken Sie weitere Iterationen wie in Schritt 1.1.5 beschrieben.
   7. Fahren Sie mit Iterationen, bis der Algorithmus keine Eintragung findet oder Konvergenz (es werden keine neuen Einträge gefunden) erreicht. Laden Sie die Liste der vermeintlichen gen Familienmitglieder für weitere Analysen. Überprüfen Sie die abgerufenen Hits in jeder Iteration, die Anwesenheit der Fehlalarme zu vermeiden.
2. PSI-BLAST-Standalone-version
   1. Download der Standalone-Version von BLAST durch Anklicken des Buttons "download BLAST" auf der BLAST-Startseite-¹³.
      Hinweis: Die Standalone-BLAST-Software ist eine Kommandozeilen-Version des Web-Interfaces beschrieben vor. Es ermöglicht die PSI-BLAST-Suche anhand einer benutzerdefinierten Datenbank lokal oder remote ausführen. Darüber hinaus erlaubt es, mit einer vordefinierten Position bestimmte Punktzahl Matrix (PSSM) suchen.

2. manuelle Inspektion der PSI-BLAST-identifiziert Familienmitglieder

1. Mehrfache Ausrichtung
   1. Sammeln Sie die amino sauren Sequenzen, die zuvor in einer FASTA-formatierten Datei identifiziert und laden Sie sie in die MEGA Software¹⁴ mit mehreren Ausrichtung vorzugehen.
   2. Öffnen Sie die MEGA-Software, klicken Sie auf "Align", klicken Sie auf "Edit/Build Ausrichtung", klicken Sie "Erstellen eine neue Ausrichtung", klicken Sie auf "Protein".
   3. Klicken Sie auf "Bearbeiten" aus dem Menü Ausrichtung und "Sequenz aus Datei einfügen". Die FASTA-Datei erstellt, bevor suchen Sie und bestätigen Sie den Upload der untersuchten Sequenzen.
   4. Klicken Sie auf "Ausrichtung" aus dem Menü Ausrichtung und "Ausrichten von Muskel". Default-Parameter zu verwenden, klicken Sie auf "Berechnen" und warten auf die Fertigstellung der mehrfache Ausrichtung.
   5. Überprüfen Sie die mehrfache Ausrichtung nicht falsch vorhergesagte Familienmitglieder auszuschließen. Das kanonische CxxC (13 X) PxCxHxxHxxCxxxW (7 X) CxxCW-Motiv (insbesondere das Vorhandensein von Prolin Rückstände vor der dritten Cystein), ist das Hauptmerkmal verpflichtet, die ATL-Familienmitglieder zu definieren.
2. Analyse der spezifischen LOGO
   1. Legt die definitive Liste der Familienmitglieder (96 Weinrebe Sequenzen erfüllen die Anforderungen gelten ATL) mehrere Em Motiv Erhebung (MEME)¹⁵ , konservierte Motive innerhalb der Familie zu definieren.
   2. Klicken Sie von der MEM-Homepage auf "MEME" und füllen Sie das "Daten Vorlage Formular" mit bestimmten Informationen über die Familie von Interesse.
   3. Verwenden Sie MEME Analyse auf um das Vorhandensein der zwei erwarteten Motive innerhalb der Weinrebe ATL Familienmitglieder, d.h., der RING-H2 und die GLD-Motive zu bestätigen.
3. Alternativ führen Sie Schritte 2.1 und 2.2 gleichzeitig mit Hilfe der Bioinformatik-Software-Suite (siehe Tabelle der Materialien).
   1. FASTA-Datei hochladen (siehe Schritt 2.1.1) in die Suite. Wählen Sie "Datei" aus dem Menü, dann "Importieren" und klicken Sie auf "aus Datei". Durchsuchen Sie die FASTA-Datei und klicken Sie auf "Öffnen".
   2. Wählen Sie die importierte Sequenzen in der Liste und klicken Sie auf "Align/zusammenfügen" Schaltfläche in der Symbolleiste, und klicken Sie dann "Paarweise Multiple Alignment". Wählen Sie "Muskel-Achse" und klicken Sie auf "OK", um die Ausrichtung mit Default-Parametern zu starten.
   3. Um das LOGO der Achse zu visualisieren, klicken Sie auf "Grafiken" → "Optionen" und wählen Sie "Sequenz-Logo".

3. Analyse der physikalischen Parameter Protein und Domains

1. Wie die Definition der verschiedenen physikalischen Parameter der Befragten Familienmitglieder wichtig, eine umfassende Beschreibung der Familie haben, senden Sie die Liste der Familienmitglieder zu spezifischen Web-Tools.
   1. Verwenden Sie zum isoelektrischen Punkt (pI) und Molekulargewicht (kDa) ProtParam Werkzeug¹⁶ auf der Expasy-Website mit Standardparametern.
   2. Verwenden Sie für Protein subzelluläre Lokalisation verschiedene Werkzeuge, eine zuverlässige Vorhersage wie NgLOC v1. 0¹⁷ mit Standardeinstellungen, TargetP v1. 1¹⁸ mit Standardeinstellungen und Protein Prowler subzelluläre Lokalisierung v1. 2^{19 zu erhalten} mit einem Cut-off der Wahrscheinlichkeit von 0,5. Verwenden Sie für Phosphorylierung Websites die MUsite v1. 0 Web Tool²⁰ mit Standardparametern.
2. Zusätzliche Protein Domänen in Familienmitglieder zu untersuchen.
   1. Öffnen Sie Pfam Datenbank Webseite²¹zu, wählen Sie "Sequenz" Suchwerkzeug reichen Sie Proteinsequenzen im Abfragefeld ein und klicken Sie auf "Go", um die Analyse zu starten.
      Hinweis: Jede Proteinreihenfolge ist einzeln analysiert. Ein e-Wert von 1,0 in der Standardeinstellung erlaubt Unterscheidung zwischen wesentlichen und nicht signifikant Hits.
   2. Öffnen Sie die TMHMM Server²² aus dem Zentrum für biologische Sequenz-Analyse auf das Vorhandensein von vermeintlichen transmembranen Regionen zu untersuchen.

Fügen Sie alle Proteinsequenzen gleichzeitig im Abfragefeld (oder alternativ eine Text-Datei, einschließlich alle Proteinsequenzen im FASTA-Format hochladen) und klicken Sie auf "Absenden", um die Analyse zu starten.

Analysieren Sie Proteine fehlen vorhergesagte transmembrane Domänen, nach TMHMM (Schritt 3.2.2), mit ProtScale Werkzeug, vermeintliche hydrophobe Regionen zu identifizieren. Öffnen Sie ProtScale Seite²³. Fügen Sie jede Proteinsequenz im Abfragefeld ein und wählen Sie "Hphob. / Kyte & Doolittle "als Aminosäure-Skala. Klicken Sie auf "Absenden", um die Analyse zu starten.

(4) chromosomale Verteilung, Duplikationen und Exon-Intron-Organisation

1. Ordnen Sie die ATL-Familienmitglieder auf den Chromosomen, die anhand der Informationen aus der Weinrebe Genom CRIBI Biotech Center Website²⁴abgerufen werden.
   1. Durchsuchen Sie die PhenoGram Website Homepage²⁵. Schreiben Sie "Input File" als tabulatorgetrennte Textdatei mit den Besonderheiten der Gene auf den Chromosomen nach der erschöpfenden Richtlinien und Beispiele über die Zusammenstellung der zur Verfügung gestellten Datei folgt man dem Weg zugeordnet werden "Phenogram" → " Dokumentation"→"Options"→"Input File".
   2. Der "Titel" des Werkes zu schreiben. Wählen Sie das Genom gezeichnet werden. Wählen Sie für Genome nicht implementiert in der Software, wie z. B. die Weinrebe Genom "Sonstiges" in der Drop-Down-Menü. Schreiben Sie die Genom-Datei nach den Richtlinien und Beispiele zur Verfügung gestellt, folgt man dem Weg "Phenogram" → "Dokumentation" → "Options" → "Genom" und laden Sie sie.
   3. Verwenden Sie Standard-Parameter "Phänotyp Abstand", "Phänotyp", "Bildformat", oder wählen Sie Alternativen in den jeweiligen Menüs, und klicken Sie auf "Plot", um die Visualisierung der Gene auf den Chromosomen zu erhalten.
2. Definieren Sie den Stand der Vervielfältigung der Familienmitglieder mit der MCScanX Software²⁶.
   1. Herunterladen Sie und entpacken Sie eine Kopie des MCscanX auf einem lokalen Computer ausführen Befehl Linien 1 (ergänzende Datei 1). Geben Sie den MCscanX-Ordner und erstellen Sie die erforderlichen Executables Befehlszeilen 2 (ergänzende Datei 1) ausgeführt.
      Hinweis: Installation von MCscanX ist bekannt, auf einigen Linux 64-Bit-Computern durch ein Problem im Zusammenhang mit der Funktion Chdir scheitern. Wenn eine Fehlermeldung im Zusammenhang mit dieser Funktion auf das Make zurückgegeben wird Befehlsausführung, die Befehlszeilen 3 (ergänzende Datei 1) ausgeführt werden soll und der Befehl "Make" sollte danach versucht werden.
   2. Download V. Vinifera -Proteine und die Anmerkungsdatei Befehlszeilen 4 (ergänzende Datei 1) ausgeführt.
      Hinweis: Die Weinrebe Annotation Datei muss entpackt werden und die einzelnen Chromosomen Informationen Katze in einer einzigen Datei durch Ausführen von Befehl Linien 5 (ergänzende Datei 1).
   3. Ausführen einer "alle gegen alle" Blastp mit V. Vinifera -Protein-Datei als die Abfrage und das Thema suchen.
   4. Erstellen Sie eine durchsuchbare Blast-Datenbank mithilfe der V. Vinifera Protein-Datei ausführen Befehl Linien 6 (ergänzende Datei 1). Führen Sie die Blastp-Suche mit dem V. Vinifera Proteine Datei als eine Abfrage gegen die Datenbank zuvor durch Ausführen von Befehlszeilen 7 (ergänzende Datei 1) erstellt.
   5. Konvertieren Sie die Annotation-Datei in ein geeignetes Format für MCScanX. Führen Sie Befehl Linien 8 (ergänzende Datei 1) benutzerdefinierte Perl Skript parseMSCanXgff.pl herunterladen. Führen Sie die Analyse Befehlszeilen 9 (ergänzende Datei 1) ausgeführt.
      Hinweis: Eine Datei vitis.gff wird generiert, die gen-Koordinaten im folgenden Format enthält:
      SP # gen Ausgangsposition Endposition
      wo "sp" ist ein zwei-Buchstaben-Code für die Spezies (Vv für Weinrebe), während "#" der Name des Gerüstes ist. Beachten Sie, dass die bereitgestellten benutzerdefinierten Perl-Skript für die meisten Konvertierung geeignet ist, obwohl einige Code-Änderungen in einigen spezifischen Fällen aufgrund der Vielfalt der Informationen in den verfügbaren Anmerkungsdatei erforderlich sein kann.
   6. Starten Sie MCScanX Befehl Linien 10 (ergänzende Datei 1) ausgeführt.
      Hinweis: Die "Vitis" ist das Präfix für die Anmerkung und die Explosion-Ausgabedatei. Dies ist eine zwingende Voraussetzung für die Ausführung der Software.
   7. MCScanX Ergebnisse zu analysieren. MCScanX erzeugt eine Textdatei "vitis.collinearity", die kollinearen Blöcke enthält. Eine solche Datei kann mit jedem Texteditor kontrolliert werden (siehe Beispiel Ausgabe 1 ergänzende Datei 1).
      Hinweis: Ein Verzeichnis "mcscaxOutput.html" wird generiert, die HTML-Dateien mit mehrere Ausrichtungen der kollinearen Blöcke gegen jedes Chromosom Verweis enthält. Diese Dateien können über einen Webbrowser eingesehen werden.
   8. Klassifizieren Sie paralogous Gene auf der Grundlage ihrer relativen Positionen in den Chromosomen Befehlszeilen 11 (ergänzende Datei 1) ausgeführt.
      Hinweis: Paralogous gen Klassifikation beschreibt Zusätzliche Tabelle II. Die generierte Ausgabedatei "vitis.gene_type" enthält alle Herkunftslandinformationen mit einem einfachen Registerkarte getrennt-Format.
   9. Analysieren der Bereicherung zu beurteilen, ob die Genfamilie hauptsächlich durch einen speziellen Mechanismus läuft Befehlszeilen 12 (ergänzende Datei 1) entstanden ist.
      Hinweis: Datei "vitis.gene_type" wird bei Schritt 4.2.8, generiert, während Datei "Gene_family_file" eine Textdatei zeilenweise darstellt, in der die Locus-Namen für alle die Gene, die aus der Familie der Name der Familie (z.B.ATL_genes) gefolgt getrennt durch einen Tabulator. Der angewandten statistischen Test für die Anreicherung ist ein exakter Test von Fisher und die p-Werte unterschiedlicher Herkunft sind in der Datei "outputFile.txt" gespeichert.
3. Visualisieren der Exon-Intron-Organisation der Gene mit interaktiven Baum des Lebens (iTOL)²⁷, ein Online-Tool für die Anzeige, Annotation und Verwaltung von Stammbäumen.
   1. Laden Sie einen phylogenetischen Stammbaum im Abschnitt "Upload" der Website iTOL. Der Baum ist nach Abschnitt 5 unten gebaut. Rufen Sie für jedes Familienmitglied gen gen Struktur Vorhersage von V1 Anmerkung des Genoms Weinrebe (CRIBI Webseite zitierten ab). Berechnen Sie die Länge (in bp) des vermeintlichen Exons und Introns unübersetzte Regionen (wo).
   2. Verwenden Sie das "Protein Domänen" Dataset zur grafischen Visualisierung der Exon-Intron-Muster.

Schreiben einer Textdatei, einschließlich der berechneten Längen nach den Angaben nach den Pfad "Helfen" → "Hilfe-Seiten" → "Dataset-Typen" → "Protein-Domains" in der iTOL Webseite²⁷. Mit "Protein Domänen" Dataset, repräsentieren das "Rechteck (RE)" und die "Rechteck Lücke (GP)" Formen das Exon und das wo.

(5) phylogenetische Analyse und Nomenklatur

1. Analysieren Sie die Beziehungen zwischen den ATL Familienmitglieder durch den Bau eines hochwertigen phylogenetischen Baumes und die Definition von Familie Nomenklatur.
   1. Folgen Sie für eine Weinrebe Genfamilie die Weinrebe Super Nomenklatur Ausschuss⁸festgelegten Regeln.
   2. Abrufen von A. Thaliana ATL-Sequenzen, die als Referenz für die Weinrebe gen Nomenklatur⁸, von der UniProt Datenbank²⁸ erforderlich.
   3. Schreiben einer FASTA-Datei einschließlich aller Nukleotidsequenzen der Weinrebe und A. Thaliana gen Familienmitglieder in der phylogenetischen Analyse aufgenommen werden. Die Nukleotidsequenzen ermöglichen die maximale Variabilität innerhalb der Familie (im Vergleich zu Proteinsequenzen).
2. Phylogenetischer Baum
   Hinweis: Die Verwendung der Phylogeny.fr- ²⁹ -Pipeline ist empfehlenswert, eine qualitativ hochwertige phylogenetischen Stammbaum erhalten, jedoch nicht verpflichtend.
   1. Durchsuchen Sie die Phylogeny.fr Homepage²⁹, und wählen Sie die "Phylogenie Analyse" Pipeline.
      Hinweis: "One Click" eignet sich in den meisten Fällen, aber wenn es nötig ist möglich, bestimmte erweiterte Einstellungen ("Advanced") oder sogar eine individuelle Analyse auszuwählen ("a la Carte"; siehe Schritt 5.2.5).
   2. Schreiben der "Name der Analyse", laden Sie die FASTA-Datei zuvor erstellte (Schritt 5.2.1, und klicken Sie auf "Absenden", um die Analyse zu starten.
   3. Alternativ, wenn das Verfahren beschrieben (Schritte 5.2.1, 5.2.2) führt zu einer Fehlermeldung schließen Sie jeden Schritt der Phylogenie Suite Pipeline einzeln, wie folgt.
      1. Der Muskel Software Homepage³⁰Upload der FASTA-Datei in "Schritt 1", wählen Sie "Pearson/FASTA" als "Ausgabeformat" in "Schritt 2", und klicken Sie auf "Absenden" in "Schritt 3" Abfrage Sequenzen ausrichten.
      2. Klicken Sie auf "Ausrichtung Datei herunterladen" und speichern Sie als FASTA-Datei für weitere Schritte.
      3. Prozess der Ausrichtung FASTA-Datei, schlecht zu beseitigen ausgerichtet mit Gblocks Server Tool³¹Positionen. Die Ausrichtung FASTA-Datei hochladen, wählen Sie "DNA" als "Typ der Sequenz" und wählen Sie die Option(en) Stringenz, die am besten mit der Analyse (z.B.Weinrebe ATL gen Familie wählen Sie für alle drei Optionen für "weniger strenge Auswahl" vorgeschlagen, weil der hohe Sequenz Divergenz). Klicken Sie auf "Blöcke" führen Sie die Analyse.
      4. Klicken Sie auf "Resultierende Achse" am unteren Rand der Seite "Output" und speichern Sie die Ergebnisse als eine neue FASTA-Datei.
      5. Die Phylogeny.fr Homepage²⁹wählen Sie "A La Carte" als "Phylogenie Analyse" Pipeline. Deaktivieren Sie "Multiple Alignment" und "Ausrichtung Kuration". Klicken Sie "Workflow erstellen", hochladen Sie Gblocks kuratiert FASTA (Schritt 5.2.5.4), wählen Sie "Replikationsverwaltungs Verfahren" mit Default-Parameter in "Einstellungen" und klicken Sie auf "Absenden", um die Analyse zu starten.
   4. Zusammenbruch schlecht unterstützt Zweige (d.h., bootstrap Werte < 70 %) durch Klicken auf "Collapse Zweige" im Abschnitt "Select and Action" und laden Sie die endgültigen Ergebnisse in Newick Format auf weitere Analysen.
3. Weisen Sie einen gen-Namen anhand der Phylogenie.
   1. Überprüfen Sie den phylogenetischen Baum um die Zuverlässigkeit der Baumstruktur zu bewerten, hochladen, in die iTOL Suite zitierten (Abschnitt 4.3).
   2. Weisen Sie manuell einen gen Namen jedes Familienmitglied zu. Bei eins zu eins Orthologe zuweisen der Arabidopsis-wie der Name (z.B.AtATL3 → VviATL3). Weinrebe-Gene (zwei oder mehr) ableiten von einem einzigen Arabidopsis Homolog mit dem gleichen phylogenetischen Entfernung mit Zahlen oder Buchstaben mit einer Zahl endet das Arabidopsis-gen zu unterscheiden (z.B., AtATL23 → VviATL23a, VviATL23b).
   3. Bei 1: n oder n-Orthologe benennen neue gen bestehend aus Arabidopsis-wie Namen (in diesem Fall "ATL") gepaart mit eine Zahl höher als die höchste Zahl, die bereits für V. Vinifera und Arabidopsis genutzt (zB., VviATL83).
   4. Vervollständigen Sie die Nomenklatur der neu definierten Familie absteigend von oben nach unten von der phylogenetischen Stammbaum.

(6) Grapevine Orgel und Bühne Expression Profiling

1. Generieren Sie Daten Matrix enthaltende Ausdruck Arbeitsdaten für die Familienmitglieder.
   1. Laden Sie die V. Vinifera CV Corvina gen Ausdruck Atlas Datamatrix über den Link auf die ResearchGate Plattform³²verteilt. Diese Datei enthält die RMA normalisiert Ausdruckswerte in folgenden Schritten verwendet werden.
   2. Die Atlas-Datamatrix Ausdruckswerte für jede Familie gen entziehen und schreiben ein "Working Datamatrix", enthält die gleiche Kopfzeile als Atlas Datamatrix. Speichern Sie die "Arbeitsgruppe Datamatrix" als tabulatorgetrennte Textdatei.
2. Führen Sie die hierarchische Bi-Cluster-Analyse mit Multi-Experiment-Viewer (MeV) Software.
   1. Downloaden Sie und installieren Sie MeV Software³³.
   2. "Arbeiten Datamatrix" hochladen (Schritt 6.1.2) folgt man dem Weg "Datei" → "Daten laden" → "Durchsuchen" und wählen Sie die Textdatei. Wählen Sie "einfarbige Array" und entfernen Sie das Häkchen von "Last Annotation", wenn eine automatische Annotation nicht vorgesehen ist. Wählen Sie den oberen linken Ausdruckswert der Ausdruck Tabelle Vorschau, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Laden".
   3. Stellen Sie die Daten, die Anwendung von Log2 Umwandlung ("Daten anpassen" → "Log Transformationen" → "Log2 Transform") und Gene/Zeile Normalisierung ("Daten anpassen" → "Gen/Zeile Einstellungen" → "Median Center gen/Row"). Legen Sie den richtigen Maßstab Grenzwert ("Anzeigen" → "Set Farbe Skalierungsgrenzen").
   4. Berechnen Sie die hierarchische Clustering folgt man dem Weg "Analyse" → "Clustering" → "HCL".

Wählen Sie "Optimieren gen Blatt Order" und "Optimieren Blatt Beispielauftrag" "Bestellung Optimierung Wiese", "Pearson Korrelation" in die "Ferne Matrix Auswahlfeld" und "Durchschnittliche Linkage clustering" im Feld "Verknüpfung Methode Selection". Klicken Sie auf "OK", um die Analyse zu starten.

Die Ergebnisse werden im Menü "Ergebnisse" → "HCL" auf der linken Seite des Fensters angezeigt. Exportieren Sie die Heatmap, indem Sie auf "Bild speichern" im Menü "Datei".

(7) Expression Profiling als Reaktion auf biotischen und abiotischen Stress

1. Wiederholen Sie Schritt 6.1 mit der GSE Beitritt ID aus entsprechenden Publikationen und Studien zur Untersuchung von biotischen und abiotischen Stress auf Reben gewonnen. Beispielsweise können bietet das Transkriptom-Profil der Weinrebe Beeren infiziert mit dem pilzliche Erreger Botrytis Cinerea mit NimbleGen Traube Vollständiggenom Microarray Experimente mit GSE-ID des GSE52586 durchsucht werden. Wiederholen Sie 6.1.1 und 6.1.2.
2. Suchen Sie das NCBI Reihenfolge liest Archiv³⁴ mit der SRA/BioProject-ID (z.B.SRP055458 oder PRJNA275778 für "Weinrebe Blume Schattierung" Experimente) und herunterladen Sie aller damit verbundenen rohen Reihenfolge liest. RNA-Seq-Datasets aus vielen verschiedenen Studien werden mit eine einzelne Rohrleitung für Konsistenz verarbeitet.
   1. Kurz, trim roh Sequenz FASTQ liest (Einzel- und paar-Ende) und Qualität mit Trimmomatic³⁵filtern. Verwenden Sie eine AVGQUAL und MINLEN jeweils von 20 bis 40, Filtern und alle Parameter standardmäßig.
   2. Index der 12 X Weinrebe Bezug Genom¹ mit Bowtie2³⁶. Download der 12 X Weinrebe Bezug Genom (z.B. bowtie2-Build) vor dem bowtie2 Befehl ausführen.
   3. Erhalten Sie Zahlentabellen Matrix mit Htseq-Count³⁷ mit der Weinrebe V1 gen Annotation (GFF/GTF) Modelldatei.
3. Führen Sie differenzielle Genanalyse Ausdruck (Re-) in R³⁸ mit Limma³⁹ für RMA-normalisiert Matrizen und DESeq2⁴⁰ Bibliotheken für Matrix Zahlentabellen Schritte 7.1.1 und 7.2.1, bzw. eingeholt.
   1. Einen standard "zwei-Gruppe" Abgleich (d.h., "Behandlung" / "control"). Sicherstellen Sie, dass die Design-Matrix/Gruppierungen "kontrolliert" und "Behandlung" Bedingungen ordnungsgemäß angegeben sind.
      Hinweis: Ein typisches Design für Microarray differentielle Expressionsanalyse (GSE52586), EL-33 Beeren infiziert mit Botrytis Cinerea gegen Kontrolle (gesunden) Beeren im gleichen Entwicklungsstadium mit Limma Befehlszeilen ausführen zu vergleichen 13 zeigt zusätzliche Datei 1. Ergänzende Datei 1 zeigt ein typisches Design für RNA-Seq differentielle Expressionsanalyse (SRP055458 oder PRJNA275778), Blume (nach 7 Tagen nach GAP-Fall) unter Schatten Behandlung gegen die Kontrolle mit DESeq2 laufen Befehlszeilen 14 vergleichen .
   2. Erhalten Sie die Listen der differentiell exprimierten Genen (DEG) jedes dagegen für Limma, verwenden Sie die Funktionen lmFit(), gefolgt von eBayes(), und dann durch TopTable() Funktionen, während für DESeq2, verwenden Sie die DESeqDataSetFromMatrix(), DESeq()und results() Funktionen. Unter einem typischen Workflow einzuhalten.
      1. Microarray differentielle Expressionsanalyse finden Sie unter Befehlszeilen 15 (ergänzende Datei 1). RNA-Seq differentielle Expressionsanalyse finden Sie unter Befehl Linien 16 (ergänzende Datei 1). Wiederholen Sie die obigen Schritte für alle anderen Kontraste mit verschiedenen passenden Design-Schema (siehe Beispiele im Schritt 7.3.1)
4. Aus den Listen der Grad erzeugt, extrahieren Sie alle Zeilen, die nicht entsprechen den ATL V1 Beitritt, Spalten, in denen die log2 Falten Änderung (Therapiekontrolle) behalten > | 0,5 | und p-Werte (FDR) < 0,05 und verschmelzen Sie entsprechend in eine Matrixtabelle, ob eine Studie fällt in "abiotische" oder "biotische/Erreger-Interaktion" Kompendien.
5. Konstruieren Sie die hierarchische Cluster Heatmaps (abiotische und biotische Kompendien) in R mit den Bibliotheken Gplots.
   Hinweis: Aufruf der heatmap.2 Funktion der Heatmap zusammen mit Zeile Dendrogramme aus den jeweiligen Matrixtabellen erstellt. Zusätzliche Argumente mit Cellnote Funktion hilft, differentiell exprimierten zu unterscheiden (log2FC > 0,5, FDR < 0,05) ATL Gene in jedem Vergleich über eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen durch ein * Symbol. Gelten Sie die typischen Workflow in R Befehlszeilen 17 (ergänzende Datei 1) ausgeführt oder alternativ, wiederholen Sie die Schritte 6.2.2 zu 6.2.5 die Heatmaps mit MeV Software zu konstruieren.

8. Analyse der Beziehungen zwischen Paralogous Sequenz Divergenz und Co Genexpression

1. Die Matrix mit paarweisen Ähnlichkeit zu konstruieren. Die Elemente der Ähnlichkeitsmatrix sind den Werten der Sequenzähnlichkeit aus paarweise Protein Achsen berechnet.
   1. Verwenden Sie EMBOSS Nadel Web Server⁴¹ mit Standardeinstellungen paarweisen Reihenfolge Ausrichtungen und als Textdatei speichern. Öffnen Sie die Ausgabe-Text-Datei zu und entfernen Sie alle Kommentarzeilen, zusammen mit Spalten- und Namen eine Datei namens "similarityTable.txt" zu erzeugen.
      Hinweis: Diese Tabelle verfügt über eine Zeile für jedes ATL-gen Berichterstattung die Ähnlichkeit Werte in jedem der paarweisen Achse berechnet. Die Reihenfolge der Loci in Zeilen und Spalten ist dasselbe, so dass eine symmetrische Matrix mit Bezug auf die Diagonale Werte erzeugt wird.
2. Konstruieren Sie die Matrix mit Co-Daten durch die Berechnung der Pearson-Korrelationskoeffizient. Die folgende Prozedur erfordert R und die Perl-Modul PDL.
   1. Laden Sie die Ausdruckswerte für die 96 ATL-Gene Befehlszeilen 18 (ergänzende Datei 1) innerhalb eines Terminals ausgeführt. Führen Sie ein Co Expressionsanalyse mithilfe einer benutzerdefinierten Perl-Skripts, die heruntergeladen werden kann, indem Sie ausführen Befehl Zeilen 19 (ergänzende Datei 1 aus). Solches Skript berechnet der Pearson-Korrelationskoeffizient zwischen Paaren von ATL Loci wie bereits früher berichtet.
   2. Starten Sie das Skript ausführen Befehl Linien 20 (ergänzende Datei 1) und befolgen Sie die Ausgabe.

Das Skript erzeugt eine Ausgabedatei (nämlich "coexpressionTable.txt"), enthält eine Co-Matrix mit den gleichen Locus Namen Ordnung der Matrix im Schritt 8.1 (diese Reihenfolge ist wichtig, den Mantel Testlauf, siehe unten) erhalten.

Führen Sie einen Mantel-Test zwischen der Daten-Matrizen in Schritten 8.1 und 8.2 erhalten. Nach dem Betreten der R-Umgebung (Befehl "R" in einem Terminal ausgeführt), laden Sie die ade4-Bibliothek mit dem folgenden Befehl: library(ade4)

1. Führen Sie den Mantel-Test, indem Sie laden die beiden Daten-Matrizen und die Statistiken laufen Befehlszeilen 21 (ergänzende Datei 1), mit "Nrep", die Anzahl der Permutationen darstellt. Der Test besteht aus Berechnung der Korrelation zwischen den Elementen dieser Matrizen, Permutation Matrizen und dann berechnen die gleichen Teststatistik wieder.
   Anmerkung: Die erhaltenen Werte des statistischen Tests dienen eine Referenzverteilung des statistischen Tests zu bauen, die verwendet wird, um ein pberechnen-Wert, um Bedeutung zu testen. Die Anzahl der Permutationen definiert die Präzision, mit denen der p-Wert erzielt werden.

Ergebnisse

Das VIT_05s0077g01970-gen, als am ähnlichsten A. Thaliana ATL2 (At3g16720) durch eine BLASTp Suche, diente als Sonde um die ATL Familienmitglieder in das Genom der Weinrebe Umfrage identifiziert (V. Vinifera cv Pinot Noir PN40024). Die PSI-BLAST-Analyse kamen nach ein paar Zyklen zeigt eine Liste der vermeintlichen Gene aus der Weinrebe ATL Genfamilie (Abbildung 1A). Das Vorhandensein der kanonischen RING-H2-Domäne für jeden Kandidaten wu...

Diskussion

In der genomischen Ära wurden viele Genfamilien tief in mehreren Pflanzenarten charakterisiert. Diese Informationen sind Voraussetzung für funktionelle Studien und bieten einen Rahmen, um die Rolle der verschiedenen Mitglieder in einer Familie weiter zu untersuchen. In diesem Zusammenhang ist auch eine Notwendigkeit für eine Nomenklatur-System ermöglicht zur eindeutigen Identifizierung jedes Mitglied in einer Familie, Vermeidung von Redundanz und Verwirrungen, die entstehen können, wenn Namen von verschiedenen Forsc...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Personal computer
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)			https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA)			http://www.megasoftware.net/
Motif-based sequence analysis tools (MEME)			http://meme-suite.org/
Geneious	Biomatters Limited		http://www.geneious.com/
ProtParam Tool			http://web.expasy.org/protparam/
ngLOC			http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html
TargetP v1.1 Server			http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/
Protein Prowler			http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/
MUsite			http://musite.sourceforge.net/
Pfam			http://pfam.xfam.org/
TMHMM Server v. 2.0			http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
ProtScale			http://web.expasy.org/protscale/
Grape Genome Database (CRIBI)			http://genomes.cribi.unipd.it/grape/
PhenoGram			http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot
MCScanX			http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/
Interactive Tree Of Life (iTOL)			http://itol.embl.de/
UniProt			http://www.uniprot.org/
Phylogeny.fr			http://www.phylogeny.fr/index.cgi
MUSCLE			http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/
Gblocks Server			http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html
Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas datamatrix			https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_ datamatrix_geneIDs_Fasoli2012
Multi Experiment Viewer (MeV)			http://mev.tm4.org/#/welcome
Sequence Read Archive (SRA)			https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra
R			https://www.r-project.org/
EMBOSS Needle (EMBL-EBI)			http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/