Flusso di lavoro globale per l'identificazione del genoma e la Meta-analisi di espressione della famiglia genica ATL E3 ubiquitina ligasi a Grapevine

Riepilogo

Questo articolo descrive la procedura per l'identificazione e la caratterizzazione di una famiglia di geni a grapevine applicato alla famiglia di Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitina ligasi.

Abstract

Classificazione e nomenclatura dei geni in una famiglia può contribuire significativamente alla descrizione della diversità delle proteine codificate e alla previsione delle funzioni di famiglia basato su diverse funzionalità, come la presenza di motivi di sequenza o di particolare siti per modificazione post-traduzionale e il profilo di espressione dei membri della famiglia in condizioni diverse. Questo lavoro descrive un protocollo dettagliato per la caratterizzazione dei geni familiari. Qui, la procedura viene applicata per la caratterizzazione della famiglia Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitina ligasi a grapevine. I metodi includono l'identificazione del genoma di membri della famiglia, la caratterizzazione del gene localizzazione, struttura e duplicazione, l'analisi dei motivi della proteina conservata, la previsione dei siti di localizzazione e la fosforilazione delle proteine, nonché espressione genica in tutta la famiglia in diversi set di dati. Tale procedura, che potrebbe essere esteso a ulteriori analisi a seconda gli scopi sperimentali, potrebbe essere applicato a qualsiasi famiglia genica in qualsiasi specie di piante per i quali sono disponibili dati genomici e fornisce informazioni utili per identificare i candidati interessanti per gli studi funzionali, dando comprensioni nei meccanismi molecolari dell'adattamento della pianta al loro ambiente.

Introduzione

Durante l'ultimo decennio, molta ricerca è stata effettuata in grapevine genomica. Vigna è una coltura economicamente rilevante riconosciuta, che è diventato un modello per la ricerca sullo sviluppo di frutta e sulle risposte delle piante legnose agli stress biotici e abiotici. In questo contesto, il rilascio del genoma di Vitis vinifera c.v. PN40024 nel 2007¹ e la sua versione aggiornata nel 2011² ha portato a un rapido accumulo di dati "Omics"-scala e a una raffica di studi di alto-rendimento. Base ai dati pubblicati sequenza, l'analisi completa di una famiglia di dato gene (generalmente composta da proteine condividono motivi conservati, somiglianze strutturali e/o funzionali e rapporti evolutivi), possono ora essere eseguite per scoprire la funzioni molecolari, evoluzione e profili di espressione genica. Queste analisi possono contribuire alla comprensione di come le famiglie geniche controllano processi fisiologici a livello del genoma.

Molti aspetti del ciclo di vita della pianta sono regolati dalla degradazione ubiquitina-mediata di proteine chiave, che richiedono un fatturato fine-tuned per garantire regolari processi cellulari. Importanti componenti del processo di degradazione ubiquitina-dipendente sono la ligasi di ubiquitin E3, che sono responsabili della flessibilità del sistema, grazie all'assunzione di specifici obiettivi³. Di conseguenza, questi enzimi rappresentano una famiglia di geni enorme, con circa 1.400 E3 ligasi-codifica geni preveduti in Arabidopsis thaliana genoma⁴, ogni E3 ubiquitina ligasi che agiscono per l'ubiquitinazione delle proteine target specifici. Nonostante l'importanza del substrato specifico ubiquitinazione nella regolazione cellulare nelle piante, piccolo è conosciuto circa come è regolato il pathway di ubiquitinazione e solo in pochi casi sono state identificate proteine bersaglio. La decifrazione di tali meccanismi di specificità e regolamento si basa innanzitutto sull'identificazione e la caratterizzazione delle diverse componenti del sistema, in particolare la ligasi E3. Tra ubiquitin-ligasi, sottofamiglia ATL è caratterizzata da 91 membri identificati in a. thaliana visualizzati un anello-H2 dito dominio^5,6, alcuni di loro un ruolo in difesa e ormone risposte⁷.

Il primo passo cruciale per definire i membri di una nuova famiglia genica è la definizione precisa delle caratteristiche familiari, quali motivi di consenso, settori chiave e le caratteristiche di sequenza della proteina. Infatti, il recupero affidabile di tutti i membri della famiglia genica basato su analisi BLAST richiede alcune caratteristiche di sequenza obbligatoria, nei domini di particolare proteina responsabile di funzione/attività della proteina, che funge da firma di proteina. Questo può essere facilitato dalla caratterizzazione precedente della famiglia del gene stesso in altre specie vegetali o ottenuto analizzando diversi geni putativamente appartenendo alla stessa famiglia in specie di piante diverse, per isolare sequenze comuni. I membri della famiglia possono singolarmente denominati seguendo regole comuni che si stabilì di consorzi internazionali per una determinata specie. A grapevine, per esempio, tale procedura è sottoposta alle raccomandazioni del Comitato Super-nomenclatura per l'annotazione del Gene dell'uva (sNCGGa), che stabilisce la costruzione di un albero filogenetico tra cui V. vinifera e a. thaliana membri della famiglia genica per consentire l'annotazione del gene basato su sequenze di nucleotidi⁸.

Localizzazione del cromosoma dei membri della famiglia e indagine di duplicazione genica consentire evidenziando la presenza di geni duplicati intero genoma o tandem. Tali informazioni appaiono utile per svelare le funzioni del gene presunto, poiché esso potrebbe mostrare ridondanza funzionale o rivelare situazioni differenti, cioè, non-funzionalizzazione, neo-funzionalizzazione o Sub-funzionalizzazione⁹. Entrambi neo - e sub - functionalization sono eventi importanti che creano novità genetica, fornendo nuove componenti cellulari per adattamento della pianta alle mutevoli ambienti¹⁰. In particolare, le duplicazioni dei geni ancestrali e produzione di nuovi geni erano molto frequenti nel corso dell'evoluzione del genoma della vite e neonate geni provenienti dalle duplicazioni prossimali e tandem a grapevine erano più probabili produrre nuovo funzioni¹¹.

Un altro fattore chiave nel decifrare la funzione della famiglia genica è il profilo di trascrittomica. La disponibilità di banche dati pubbliche, dando accesso a un'enorme quantità di dati di trascrittomica può essere così sfruttata per assegnare funzioni putative ai membri della famiglia genica utilizzando su larga scala in silico analisi di espressione. Infatti, la peculiare espressione di alcuni geni negli organi vegetali specifiche o in risposta a determinate sollecitazioni possa dare alcuni suggerimenti per quanto riguarda i presunti ruoli delle proteine corrispondenti in condizioni definite e dare sostegno alle ipotesi sulle possibili Sub-funzionalizzazione dei geni duplicati per rispondere alle diverse sfide. A tale scopo, è importante prendere in considerazione diversi set di dati: questi possono essere già disponibili gene matrici di espressione, come l'Atlante di trascrittomica genoma della vite organi e fasi di sviluppo¹², o possono essere costruiti ad hoc di recupero di trascrittomica DataSet per la specie di pianta particolare definito sollecitato. Inoltre, un approccio semplice utilizzando due matrici, una con dati pairwise somiglianza e l'altra con coefficienti pairwise co-espressione può essere applicati per valutare le relazioni tra modelli di somiglianza ed espressione di sequenza all'interno di una famiglia di geni.

Lo scopo di questo lavoro è quello di fornire un approccio globale, definizione di struttura del gene, conservato proteina motivi, posizione cromosomica, duplicazioni del gene e modelli di espressione, come anche la previsione di siti di localizzazione e fosforilazione di proteine, per raggiungere un esauriente caratterizzazione di una famiglia di geni in piante. Un tale approccio globale viene applicato qui alla caratterizzazione della famiglia ATL E3 ubiquitina ligasi a grapevine. Secondo il ruolo emergente dei membri sottofamiglia ATL nella regolazione dei processi cellulari chiave⁷, questo lavoro può anche aiutare l'identificazione dei forti candidati per studi funzionali e finalmente svelare i meccanismi molecolari che regolano la adattamento di questa coltura importante al suo ambiente.

Protocollo

1. identificazione dei membri di famiglia di geni putativi ATL

1. Versione web di PSI-BLAST
   1. Aprire la pagina web BLAST¹³ e clicca sulla sezione BLAST della proteina.
   2. Nel campo "Enter Query sequence", immettere la sequenza aminoacidica della proteina (qui VIT_05s0077g01970) che verrà utilizzata come la sonda per identificare altri membri della famiglia.
      Nota: Una buona proteina rappresentativa deve essere utilizzato (una proteina visualizzati tutte le caratteristiche importanti che caratterizzano la famiglia).
   3. Nel campo "Scegli set di ricerca", selezionare il database "Della proteina di riferimento" (refseq_protein) e l'organismo di interesse (V. vinifera - taxid:29760).
   4. Nel campo "programma selezione", selezionare l'algoritmo di PSI-BLAST e fare clic sul pulsante BLAST per eseguire l'analisi.
      Nota: Cliccando su "i parametri dell'algoritmo" è possibile regolare alcuni parametri avanzati (Max sequenze bersaglio, Scoring matrix, soglia PSI-BLAST, ecc.).
   5. La prima esplosione rotonda recupera tutte le sequenze di visualizzare corrispondenze pertinenti con le query (e-valore superiore alla soglia selezionata - per impostazione predefinita 0,005; 0.001 in questo esperimento). Deseleziona tutte le voci, che chiaramente non appartengono alla famiglia sotto esame facendo clic sul segno di spunta nella colonna "select per PSI-BLAST" ed eseguire la seconda iterazione di PSI-BLAST facendo clic sul pulsante BLAST come descritto al punto 1.1.4.
   6. Recentemente identificate sequenze sono evidenziati in giallo. Deseleziona i successi chiaramente sbagliati estratto e scoprire ulteriori iterazioni come descritto al punto 1.1.5.
   7. Continuare con le iterazioni fino a quando l'algoritmo non trova alcuna voce pertinente o raggiunge convergenza (nessun nuove voci si trovano). Scarica l'elenco dei membri della famiglia gene presunto per ulteriori analisi. Ispezionare visivamente i colpi Estratto in ogni iterazione per evitare la presenza di falsi positivi.
2. Versione standalone PSI-BLAST
   1. Scarica la versione standalone di BLAST facendo clic sul pulsante "Scarica BLAST" il BLAST home pagina¹³.
      Nota: Il software BLAST standalone è una versione a riga di comando dell'interfaccia web descritto prima. Esso consente di eseguire la ricerca di PSI-BLAST contro un database locale o remoto personalizzato. Inoltre, esso consente la ricerca con un pre-definito posizione specifico punteggio Matrix (PSSM).

2. manuale ispezione dei membri della famiglia PSI-BLAST-identificati

1. Allineamento multiplo
   1. Raccogliere le sequenze di acide amminici precedentemente identificate in un file di formato FASTA e caricarlo in MEGA software¹⁴ al procedere con l'allineamento multiplo.
   2. Aprire il software MEGA, fare clic sul pulsante "Allinea", fare clic su "Modifica/Build allineamento", clicca su "Crea un nuovo allineamento", fare clic su "Proteine".
   3. Fare clic su "Modifica" dal menu di allineamento e "Inserisci sequenza da File". Cercare il file FASTA creato prima e confermare il caricamento di tutte le sequenze di intervistati.
   4. Fare clic su "Allineamento" dal menu di allineamento e "Allineare di muscolo". Utilizzare i parametri predefiniti, fare clic sul pulsante "Calcola" e attendere il completamento dell'allineamento multiple.
   5. Ispezionare visivamente l'allineamento multiplo per escludere i membri della famiglia in modo non corretto previsti. Il canonico CxxC (13x) PxCxHxxHxxCxxxW (7x) CxxCW motivo, (in particolare la presenza di residui di prolina prima la terza cisteina), è la caratteristica chiave necessaria per definire i membri della famiglia ATL.
2. Analisi di specifico LOGO
   1. Inviare l'elenco definitivo dei membri della famiglia (96 sequenze di grapevine soddisfano i requisiti per essere considerato ATL) al Em multipli per Motif elicitazione (MEME)¹⁵ per definire motivi conservati in tutta la famiglia.
   2. Dalla home page di MEME, fare clic sul pulsante "MEME" e compilare il "dati invio modulo" con informazioni particolari per quanto riguarda la famiglia di interesse.
   3. Utilizzare l'analisi MEME per confermare la presenza dei due motivi previsti all'interno i membri della famiglia ATL grapevine, cioè, l'anello-H2 e i motivi GLD.
3. In alternativa, eseguire i passaggi 2.1 e 2.2 contemporaneamente utilizzando la suite di software di bioinformatica (Vedi Tabella materiali).
   1. Caricare file FASTA (Vedi punto 2.1.1) nella suite. Selezionare "File" dal menu, poi "Importa" e fai clic su "da file". Individuare il file. FASTA e fare clic su "Apri".
   2. Selezionare tutte le sequenze di importati nell'elenco e fare clic sul pulsante "Allinea/assemblare" nella barra degli strumenti, quindi fare clic su "Pairwise allineamento multiplo". Selezionare "Allineamento muscolo" e fare clic su "OK" per avviare l'allineamento utilizzando i parametri predefiniti.
   3. Per visualizzare il LOGO dell'allineamento, fare clic su "Grafici" → "Opzioni" e selezionare "Sequenza Logo".

3. analisi dei parametri fisici della proteina e domini

1. Come la definizione dei diversi parametri fisici dei membri della famiglia intervistati è importante avere una descrizione completa della famiglia, presentare l'elenco dei membri della famiglia di strumenti web specifico.
   1. Per punto isoelettrico (pI) e peso molecolare (kDa), è possibile utilizzare il ProtParam strumento¹⁶ sul sito Expasy con parametri predefiniti.
   2. Per localizzazione sottocellulare della proteina, utilizzare diversi strumenti per ottenere una stima più affidabile come ngLOC v 1.0¹⁷ con le impostazioni predefinite, targetP v 1.1¹⁸ con impostazioni predefinite e proteina prowler localizzazione subcellulare v 1.2¹⁹ con un cut-off di probabilità pari a 0.5. Per siti di fosforilazione, è possibile utilizzare il MUsite v 1.0 web strumento²⁰ con i parametri predefiniti.
2. Indagare su domini supplementari della proteina nei membri di famiglia.
   1. Aprire la pagina Web di database Pfam²¹, selezionare strumento di "Ricerca di sequenza", presentare sequenze proteiche nella finestra query e fare clic su "Go" per eseguire l'analisi.
      Nota: Ogni sequenza della proteina è analizzata individualmente. Un e-valore di 1.0 nell'impostazione predefinita permette di discriminare tra colpi significativi e non significativi.
   2. Aprire il Server TMHMM²² dal centro per l'analisi di sequenza biologica indagare la presenza di putative transmembrane regioni.

Incollare tutte le sequenze proteiche simultaneamente nella finestra query (o in alternativa caricare un file di testo tra cui tutte le sequenze proteiche in formato FASTA) e fare clic su "Invia" per eseguire l'analisi.

Analizzare le proteine carente predetti domini transmembrana, secondo TMHMM (punto 3.2.2), con ProtScale strumento per identificare regioni idrofobiche putative. Aprire la pagina Web di ProtScale²³. Incollare ogni sequenza proteica nella finestra query e selezionare "Hphob. / Kyte & Doolittle "come scala dell'amminoacido. Fare clic su "Invia" per eseguire l'analisi.

4. cromosomica distribuzione, duplicazioni e organizzazione dell'esone-introne

1. Mappa i membri della famiglia ATL sui cromosomi basati sulle informazioni recuperate dal sito Grapevine Genome CRIBI Biotech Center²⁴.
   1. Sfoglia il PhenoGram sito Web Home Page²⁵. Scrivere il "File di Input" come file di testo delimitato da tabulazioni con le caratteristiche specifiche dei geni essere mappati sui cromosomi, secondo le linee guida esaustive ed esempi per quanto riguarda la compilazione del file fornito seguendo il percorso "Phenogram" → " Documentazione"→"Opzioni"→"Input file".
   2. Scrivere il "titolo" del lavoro. Selezionare il genoma deve essere disegnato. Per genomi non implementati nel software, come il genoma della vite, selezionare "altro" nel menu a discesa. Scrivere il file di genoma secondo le linee guida e gli esempi forniti, seguendo il percorso "Phenogram" → "Documentazione" → "Opzioni" → "Genoma" e caricarlo.
   3. Utilizzare i parametri predefiniti di "Spaziatura fenotipo", "Fenotipo colore", "Formato immagine" o selezionare alternative nei rispettivi menu e scegliere "Complotto" per ottenere la visualizzazione dei geni sui cromosomi.
2. Definire lo stato di duplicazione dei membri della famiglia utilizzando il software MCScanX²⁶.
   1. Scaricare e decomprimere una copia del MCscanX su una macchina locale con righe di comando 1 (complementare File 1). Entrare nella cartella MCscanX e creare i necessari file eseguibili in esecuzione di righe di comando 2 (complementare File 1).
      Nota: Installazione di MCscanX è conosciuto per avere esito negativo su alcune macchine di Linux a 64 bit a causa di un problema per quanto riguarda la funzione chdir. Se viene restituito un messaggio di errore correlato a questa funzione al momento la rendono l'esecuzione del comando, le righe di comando 3 (complementare File 1) deve essere eseguite e il comando "make" dovrebbe essere tentato in seguito.
   2. Scarica le proteine di V. vinifera e il file di annotazione in esecuzione di righe di comando 4 (complementare File 1).
      Nota: La vite annotazione del file deve essere decompresso e il gatto di informazioni di singoli cromosomi in un unico file eseguendo il comando linee 5 (complementare File 1).
   3. Esegui un "tutti contro tutti" blastp ricerca utilizzando il file di proteina di V. vinifera come la query e il soggetto.
   4. Creare un database ricercabile blast utilizzando il file V. vinifera proteina in esecuzione comando linee 6 (complementare File 1). Eseguire la ricerca di blastp utilizzando il file di proteine V. vinifera come una query sul database creato in precedenza tramite l'esecuzione di righe di comando 7 (complementare File 1).
   5. Convertire il file di annotazione in un formato adatto per MCScanX. Eseguire righe di comando 8 (complementare File 1) per scaricare il parseMSCanXgff.pl di script perl personalizzati. Eseguire l'analisi in esecuzione di righe di comando 9 (complementare File 1).
      Nota: Un file vitis.gff viene generato che contiene il gene coordinate nel formato seguente:
      SP # gene posizione ending posizione iniziale
      dove "sp" è un codice di due lettere per la specie (Vv su grapevine) mentre "#" è il nome dell'impalcatura. Si noti che lo script perl personalizzato fornito è adatto per la conversione la maggior parte, anche se alcune modifiche di codice può essere richiesto in alcuni casi specifici a causa della diversità delle informazioni fornite nel file di annotazione disponibili.
   6. Lancio MCScanX in esecuzione comando linee 10 (complementare File 1).
      Nota: Il "vitis" è il prefisso di annotazione e il file di output di blast. Questo rappresenta un requisito obbligatorio per il software per l'esecuzione.
   7. Analizzare i risultati MCScanX. MCScanX produce un file di testo "vitis.collinearity", che contiene blocchi collineari. Tale file può essere controllato da qualsiasi editor di testo (vedere esempio uscita 1 supplementare File 1).
      Nota: Una directory "mcscaxOutput.html" viene generata che contiene i file html con allineamenti multipli di collineari blocchi contro ogni cromosoma di riferimento. Questi file possono essere controllati attraverso un browser web.
   8. Classificare i geni paraloghi basati sulle loro posizioni relative in cromosomi in esecuzione comando linee 11 (complementare File 1).
      Nota: Classificazione di Paralogous gene è descritto nel Supplementare tabella II. Il file di output generato "vitis.gene_type" contiene tutte le informazioni di origine con un formato di semplice delimitato da tabulazioni.
   9. Eseguire analisi di arricchimento per valutare se la famiglia genica prevalentemente ha provenuto da un meccanismo specifico in esecuzione comando linee 12 (complementare File 1).
      Nota: File "vitis.gene_type" viene generato al passaggio 4.2.8, considerando che il file "gene_family_file" rappresenta un file di testo di una riga in cui il nome della famiglia (ad esempio, ATL_genes) è seguito dai nomi di luogo per tutti i geni appartenenti alla famiglia separati da una tabulazione. Il test statistico applicato per arricchimento è un test esatto di Fisher e il p-valori delle diverse origini sono memorizzati nel file "txt outputfile. txt".
3. Visualizzare l'organizzazione di esone-introne dei geni utilizzando Interactive Tree Of Life (iTOL)²⁷, uno strumento online per la visualizzazione, annotazione e gestione degli alberi filogenetici.
   1. Caricare un albero filogenetico nella sezione "Upload" del sito Web iTOL. L'albero è costruito secondo sezione 5 qui sotto. Per ogni gene di membro della famiglia, recuperare la previsione della struttura genica da V1 annotazione del genoma grapevine (sito CRIBI citata.). Calcolare la lunghezza (in bp) del presunti esoni, introni e regioni non tradotte (UTR).
   2. Utilizzare il dataset "Domini proteici" per la visualizzazione grafica del modello esone-introne.

Scrivere un file di testo tra cui lunghezze calcolate secondo le specifiche fornite seguendo il percorso "Aiutare" → "pagine della Guida" → "Tipi di Dataset" → "Domini proteici" nell'iTOL sito²⁷. Utilizzando dataset "Domini proteici", il "rettangolo (RE)" e le forme di "divario di rettangolo (GP)" rappresentano l'esone e UTR, rispettivamente.

5. nomenclatura e analisi filogenetica

1. Analizzare le relazioni tra i membri della famiglia ATL attraverso la costruzione di un albero filogenetico di alta qualità e la definizione di una nomenclatura familiare.
   1. Per una famiglia di geni di grapevine, seguire le regole stabilite dal Comitato della nomenclatura di Grapevine Super⁸.
   2. Recuperare le sequenze di a. thaliana ATL, necessarie come riferimento per vite gene nomenclatura⁸, dal database UniProt²⁸ .
   3. Scrivere un file FASTA compreso tutte le sequenze del nucleotide della vite e membri della famiglia genica a. thaliana per essere inclusi nell'analisi filogenetica. Le sequenze nucleotidiche consentono il massimo della variabilità tra membri della famiglia (rispetto alle sequenze proteiche).
2. Albero filogenetico
   Nota: L'utilizzo della pipeline ²⁹ Phylogeny.fr è consigliato per ottenere un albero filogenetico di alta qualità, ma non obbligatorio.
   1. Esplora la homepage di Phylogeny.fr²⁹e selezionare la pipeline "Analisi Phylogeny".
      Nota: "One Click" è adatto nella maggior parte dei casi, ma se necessario è possibile selezionare Impostazioni avanzate specifiche ("Advanced") o anche un'analisi completamente personalizzata ("alla Carte"; Vedi punto 5.2.5).
   2. Scrivere il "nome dell'analisi", caricare il file FASTA creato in precedenza (punto 5.2.1 e fare clic su "Invia" per eseguire l'analisi.
   3. In alternativa, se la procedura descritta sopra (punti 5.2.1, 5.2.2) risultati in un messaggio di errore, completare ogni passaggio della pipeline Phylogeny suite singolarmente, come segue.
      1. Dal muscolo software homepage³⁰, caricare il file FASTA in "STEP 1", selezionare "Pearson/FASTA" come "Formato di uscita" in "STEP 2" e fare clic su "Invia" in "STEP 3" per allineare sequenze di query.
      2. Fare clic su "Scarica file di allineamento" e salvare come file FASTA per ulteriori passi.
      3. Processo il file FASTA di allineamento per eliminare mal allineato posizioni utilizzando Gblocks Server strumento³¹. Caricare il file FASTA di allineamento, selezionare "DNA" come "Tipo di sequenza" e ha scelto le opzioni di rigore che meglio si accorda con l'analisi (ad es., per vite ATL gene famiglia selezionare tutte le tre opzioni proposte per "meno rigorosa selezione" perché di divergenza di sequenza alta). Fare clic su "blocchi" per eseguire l'analisi.
      4. Fare clic su "Allineamento risultante" nella parte inferiore della pagina output e salvare i risultati come un nuovo file FASTA.
      5. La homepage di Phylogeny.fr²⁹, selezionare "A la Carte" come pipeline "Analisi Phylogeny". Quindi, deseleziona "Allineamento multiplo" e "Allineamento curation". Fare clic su "Creare il flusso di lavoro", caricare il file FASTA a cura di Gblocks (passo 5.2.5.4), selezionare "Bootstrapping procedura" con i parametri predefiniti in "Impostazioni" e clicca su "Invia" per eseguire l'analisi.
   4. Rami di collasso scarsamente supportato (cioè, i valori di bootstrap < 70%) facendo clic su "Comprimere i rami" nella sezione "Selezionare e azione" e scaricare i risultati finali nel formato Newick per ulteriori analisi.
3. Assegnare un nome del gene basato sulla filogenesi.
   1. Esaminare l'albero filogenetico per valutare l'affidabilità della struttura dell'albero caricandolo nella suite iTOL citata sopra (vedere paragrafo 4.3).
   2. Assegnare manualmente un nome del gene a ogni membro della famiglia. Nel caso di uno a uno ortologhi, assegnare l' Arabidopsis-come il nome (ad es., AtATL3 → VviATL3). Differenziare i geni grapevine (due o più) derivante da un singolo Arabidopsis omologo con la stessa distanza filogenetica utilizzando numeri o lettere se il gene di Arabidopsis termina con un numero (ad es., AtATL23 → VviATL23a, VviATL23b).
   3. Nel caso di uno-a-molti o molti-a-molti ortologhi, assegnare un nuovo nome di gene composto di Arabidopsis-come nome (qui, "ATL") accoppiato con un numero superiore al numero più alto già utilizzato per V. vinifera e Arabidopsis (ad es., VviATL83).
   4. Completare la nomenclatura della famiglia appena definita decrescente dall'alto verso il basso dell'albero filogenetico.

6. grapevine organo e fase delineamento di espressione

1. Generare i dati di espressione contenenti lavoro dati matrice per i membri della famiglia.
   1. Scarica la V. vinifera c.v. Corvina gene expression Atlas datamatrix dal link distribuiti su piattaforma ResearchGate³². Questo file contiene i valori di espressione RMA normalizzato per essere utilizzato nei seguenti passaggi.
   2. Estrarre i valori di espressione per ogni gene di famiglia dal datamatrix Atlas e scrivere un "lavoro datamatrix" contenente la stessa riga di intestazione come il datamatrix Atlas. Salvare il datamatrix"lavoro" come un file di testo delimitato da tabulazioni.
2. Eseguire l'analisi di bi-cluster gerarchica utilizzando software Multi esperimento Viewer (MeV).
   1. Scaricare e installare software di MeV³³.
   2. Caricare il datamatrix"lavoro" (punto 6.1.2) seguendo il percorso "File" → "Caricamento dati" → "Sfoglia" e selezionare il file di testo. Selezionare "colore singolo Array" e togliere la spunta da "Annotazione di carico" quando un'annotazione automatica non è disponibile. Selezionare il valore dell'espressione superiore sinistra dell'Anteprima tabella espressione e fare clic sul pulsante "Load".
   3. Regolare i dati applicando la trasformazione Log2 ("Dati di regolare" → "Log trasformazioni" → "Log2 trasformare") e la normalizzazione di Gene/riga ("Dati regolare" → "Gene/riga regolazioni" → "Median centro Gene/Row"). Impostare il limite di scala adeguata ("Display" → "impostare colore scala limiti").
   4. Calcolare il Clustering gerarchico seguendo il percorso "Analisi" → "Clustering" → "HCL".

Selezionare "Ottimizzare Gene foglia ordine" e "Ottimizzare ordine foglia del campione" nel campo di ottimizzazione di ordinazione del"", "Correlazione di Pearson" nel campo "Distanza Matrix selezione" e "Media sollevatore clustering" nel campo "Selezione del metodo di collegamento". Quindi, fare clic su "OK" per eseguire l'analisi.

Visualizzare i risultati nel menu di "HCL" → "I risultati dell'analisi" sul pannello di sinistra della finestra. Esportare la mappa termica facendo clic su "Salva immagine" nel menu "File".

7. espressione genica in risposta a stress biotici e abiotici

1. Ripetere il passaggio 6.1 con l'ID di adesione GSE ottenuto dalle rispettive pubblicazioni e studi che studiano lo stress biotico e abiotico sulla vigna. Per esempio, esperimenti fornendo il profilo del trascrittoma di bacche di vite infettati con l'agente patogeno fungoso Botrytis cinerea usando il microarray NimbleGen uva intero genoma possono essere sfogliati con GSE ID di GSE52586. Ripeti punti 6.1.1 e 6.1.2.
2. Cercare il NCBI sequenza legge archivio³⁴ con la SRA/BioProject ID (ad esempio, SRP055458 o PRJNA275778 per gli esperimenti "ombreggiatura fiore di vigna") e scaricare tutti i prime sequenze letture. RNA-seq DataSet da diversi studi sono trattati con una singola pipeline per coerenza.
   1. Brevemente, trim letture di prime sequenze FASTQ (single - e coppia-end) e filtro di qualità con Trimmomatic³⁵. Utilizzare che un AVGQUAL e MINLEN filtro rispettivamente di 20 e 40 e tutti i parametri default.
   2. Indice i 12 X vite riferimento genoma¹ utilizzando Bowtie2³⁶. Scarica il genoma di riferimento (ad es., bowtie2-build) al vite X 12 prima di eseguire il comando bowtie2 .
   3. Ottenere il conteggio matrice tabelle con htseq-conteggio³⁷ utilizzando il file di annotazione (GFF/GTF) modello di vite V1 gene.
3. Eseguire analisi di espressione (ri-) genica differenziale in R³⁸ con limma³⁹ librerie per matrici RMA-normalizzati e DESeq2⁴⁰ librerie per le tabelle di matrice totali ottenute da passaggi 7.1.1 e 7.2.1, rispettivamente.
   1. Eseguire un confronto "due-gruppo" standard (cioè, "trattamento" / "controllo"). Garantire che il progettazione matrice/raggruppamenti delle condizioni "controlla" e "trattamento" siano specificati correttamente.
      Nota: Un design tipico per l'analisi di espressione differenziale di microarray (GSE52586) per confrontare le bacche di EL-33 infettate da Botrytis cinerea contro bacche (sano) controllo nella stessa fase di sviluppo con limma in esecuzione di righe di comando 13 è mostrato in 1 File supplementari. Un design tipico per l'analisi di espressione differenziale di RNA-seq (SRP055458 o PRJNA275778) per confrontare il fiore (a 7 giorni dopo PAC-caduta) nell'ambito del trattamento di ombra contro il controllo con DESeq2 in esecuzione di righe di comando 14 è mostrato in supplementari File 1 .
   2. Ottenere gli elenchi dei geni differenzialmente espressi (DEG) in ogni contrasto, per limma, utilizzare le funzioni lmFit(), seguita da eBayes()e quindi da topTable() funzioni, mentre per DESeq2, utilizzare il DESeqDataSetFromMatrix(), DESeq()e funzioni di results . Di seguito, un tipico flusso di lavoro da seguire.
      1. Per analisi di espressione differenziale di microarray, vedere righe di comando 15 (complementare File 1). Per l'analisi di espressione differenziale di RNA-seq vedere righe di comando 16 (complementare File 1). Ripetere i passaggi precedenti per tutti gli altri contrasti con schema di progettazione appropriati diversi (vedere esempi nel passaggio 7.3.1)
4. Dagli elenchi di DEGs generato, estrarre tutte le righe che non corrispondono a ATL V1 adesione, mantenere le colonne contenenti il cambiamento di piegare log2 (trattamento/controllo) > | 0,5 | e regolato p-valori (FDR) < 0,05 e Unione loro conseguenza in una tabella di matrice, se uno studio cade in "abiotici" o compendi "interazione biotica/patogeno".
5. Costruire il heatmaps cluster gerarchica (compendi abiotici e biotici) in R utilizzando le librerie gplots.
   Nota: Chiamata alla funzione heatmap.2 costruisce l'heatmap insieme a riga dendrogrammi dalle tabelle rispettiva matrice. Argomenti aggiuntivi utilizzando cellnote funzionano contribuisce a differenziare differenzialmente espressi (log2FC > 0,5, FDR < 0.05) geni ATL in ogni confronto attraverso una vasta gamma di condizioni sperimentali di un * simbolo. Applicare il flusso di lavoro tipico in R in esecuzione di righe di comando 17 (1 File complementare) o in alternativa, ripetere i passaggi 6.2.2 6.2.5 per costruire il heatmaps utilizzando software MeV.

8. analisi dei rapporti tra sequenza paraloghi divergenza e co-espressione genica

1. Costruire la matrice contenente pairwise somiglianza. Gli elementi della matrice di similarità sono i valori di somiglianza di sequenza calcolata dagli allineamenti della proteina pairwise.
   1. Utilizzare il rilievo dell'ago web server⁴¹ con le impostazioni predefinite per fare allineamenti di sequenza pairwise e salvare come file di testo. Aprire il file di testo di output e rimuovere tutte le righe di commento, insieme ai nomi di colonna e riga per generare un file chiamato "similarityTable.txt".
      Nota: Tale tabella dispone di una linea per ogni gene ATL segnalazione i valori di somiglianza calcolati in ognuna dell'allineamento al paio. L'ordine dei loci in righe e colonne è lo stesso modo che una matrice simmetrica è generata con il rispetto dei valori di diagonale.
2. Costruire la matrice con i dati di co-espressione calcolando il coefficiente di correlazione di Pearson. La procedura seguente richiede il modulo perl PDL e R.
   1. Scaricare i valori di espressione per i 96 geni ATL in esecuzione comando linee 18 (complementare File 1) all'interno di un terminale. Eseguire un'analisi di co-espressione utilizzando uno script perl personalizzati che possa essere scaricato tramite l'esecuzione di righe di comando 19 (complementare File 1). Tale script calcola il coefficiente di correlazione di Pearson tra coppie di loci ATL come precedentemente segnalati.
   2. Lanciare lo script in esecuzione di righe di comando 20 (1 File supplementari) e seguire le istruzioni di uscita.

Lo script genererà un file di output (vale a dire "coexpressionTable.txt") contenente una matrice di co-espressione con lo stesso ordine di nomi di luogo di matrice ottenuta nel passaggio 8.1 (questo ordinamento è essenziale per eseguire il test di Mantel, vedi sotto).

Eseguire un test di Mantel tra le matrici di dati ottenuti ai punti 8.1 e 8.2. Dopo aver inserito l'ambiente R (eseguita il comando "R" all'interno di un terminale), caricare la libreria di ade4 utilizzando il seguente comando: library(ade4)

1. Eseguire il test di Mantel le matrici di due dati di caricamento ed eseguendo le statistiche in esecuzione comando linee 21 (1 File supplementari), con "nrep" che rappresenta il numero di permutazioni. Il test è costituito da calcolare la correlazione tra gli elementi di queste matrici, permutando le matrici e quindi calcolando la stessa statistica test nuovamente.
   Nota: Tutti i valori ottenuti della prova statistica vengono utilizzati per costruire una distribuzione di riferimento della prova di statistica, che verrà utilizzata per calcolare un p-valore da testare per il significato. Il numero delle permutazioni definisce la precisione con cui il p-valore può essere ottenuto.

Risultati

Il gene VIT_05s0077g01970, identificato come il più simile a a. thaliana ATL2 (At3g16720) attraverso una ricerca di BLASTp, fu usato come sonda per rilevare i membri della famiglia ATL del genoma della vite (V. vinifera cv Pinot Noir PN40024). L'analisi di PSI-BLAST convergenti dopo alcuni cicli rivelando una lista di geni putativi appartenendo alla famiglia del gene ATL grapevine (Figura 1A). La presenza del dominio canonico anello-H2 per ...

Discussione

Nell'era genomica, molte famiglie geniche sono state profondamente caratterizzate in diverse specie di piante. Queste informazioni sono preliminari studi funzionali e forniscono una cornice per studiare ulteriormente il ruolo di diversi membri di una famiglia. In questo contesto, c'è anche un'esigenza di un sistema di nomenclatura che permette di identificare in modo univoco ogni membro di una famiglia, evitando la ridondanza e le confusioni che possono sorgere quando i nomi vengono assegnati in modo indipendente per di...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Personal computer
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)			https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA)			http://www.megasoftware.net/
Motif-based sequence analysis tools (MEME)			http://meme-suite.org/
Geneious	Biomatters Limited		http://www.geneious.com/
ProtParam Tool			http://web.expasy.org/protparam/
ngLOC			http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html
TargetP v1.1 Server			http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/
Protein Prowler			http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/
MUsite			http://musite.sourceforge.net/
Pfam			http://pfam.xfam.org/
TMHMM Server v. 2.0			http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
ProtScale			http://web.expasy.org/protscale/
Grape Genome Database (CRIBI)			http://genomes.cribi.unipd.it/grape/
PhenoGram			http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot
MCScanX			http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/
Interactive Tree Of Life (iTOL)			http://itol.embl.de/
UniProt			http://www.uniprot.org/
Phylogeny.fr			http://www.phylogeny.fr/index.cgi
MUSCLE			http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/
Gblocks Server			http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html
Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas datamatrix			https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_ datamatrix_geneIDs_Fasoli2012
Multi Experiment Viewer (MeV)			http://mev.tm4.org/#/welcome
Sequence Read Archive (SRA)			https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra
R			https://www.r-project.org/
EMBOSS Needle (EMBL-EBI)			http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/