In Vivo Überwachung der circadianen Uhr Genexpression in der Maus Suprachiasmatischen Kern mit Fluoreszenz-Reporter

Zusammenfassung

Diese neu entwickelte Fluoreszenz basierende Technologie ermöglicht Langzeit-monitoring der Transkription der circadianen uhrengene im Suprachiasmatic Nucleus (SCN) Mäuse in Echtzeit und mit einer hohen zeitlichen Auflösung frei zu bewegen.

Zusammenfassung

Diese Technik verbindet optische Faser vermittelt Fluoreszenz Aufnahmen mit der präzise Lieferung von recombinant Adeno-assoziierten Virus basierte gen Reporter. Dieses neue und einfach zu bedienen in Vivo Fluoreszenz monitoring-System wurde entwickelt, um die transkriptionelle Rhythmus des Gens Uhr Cry1, im suprachiasmatischen Kern (SCN) frei beweglichen Mäuse aufzeichnen. Hierzu wurde ein Cry1 Transkription Fluoreszenz Reporter entworfen und verpackt in Adeno-assoziierten Virus. Gereinigtes, konzentrierter Virus injiziert wurde, in die Maus SCN, gefolgt durch die Einfügung einer Glasfaser, die dann auf die Oberfläche des Gehirns behoben wurde. Die Tiere waren kehrte in ihre Heimat Käfige und erlaubt eine 1 Monat postoperativen Erholungsphase ausreichend Reporter Ausdruck sicherzustellen. Fluoreszenz verzeichnete dann frei beweglichen Mäuse über einen in-Vivo monitoring-System, das in unserer Einrichtung erstellt wurde. Für die in Vivo recording-System wurde 488 nm Laser mit einem Strahlteiler 1 × 4 gekoppelt, die das Licht in vier Erregung Laserleistungen gleicher Leistung unterteilt. Diese Einrichtung konnten wir aus vier Tiere gleichzeitig aufnehmen. Jedes der emittierte Fluoreszenz Signale wurde über einen Photomultiplier Röhre und einer Datenkarte Erwerb gesammelt. Im Gegensatz dazu erlaubt, die früheren Biolumineszenz in Vivo circadianen Uhr Aufnahmetechnik, diese Fluoreszenz in Vivo recording-System die Aufzeichnung der circadianen Uhr gen-Expression in den Licht-Zyklus.

Einleitung

Bei Säugetieren regelt der suprachiasmatischen Kern (SCN) den ganzen Körper zirkadianen Rhythmus um eine individuelle Reaktion auf exogene Veränderungen der Umwelt (z.B., Licht, Temperatur, Druck usw.)¹zu koordinieren. Uhr Kernkomponenten bestehen aus Per1-3, Cry1-2, Uhrund Bmal1und spielen eine zentrale Rolle bei der Regulierung der circadianen Uhr jeder Zelle. Jede Zelle in der SCN enthält den transcriptional Aktivator, CLOCK/BMAL1, fungiert als ein Heterodimer induzieren die Expression von v. und Weinen. Das KGV / Schrei-Komplex hemmt dann die Funktion der Uhr/BMAL1, eine Transkription-Übersetzung-Feedback-Schleife zu bilden, das dauert etwa 24 h komplett^2,3.

Frühere Studien über die SCN haben vor allem die ex Vivo SCN Stück Kultur Methode^4,5,6 eingesetzt und während dieser Ansatz wertvolle Informationen zur Verfügung gestellt hat, haben seine Grenzen unserer Fähigkeit, gehemmt Daten über den Einfluss der anderen Gehirn-Kerne auf der SCN sowie die Wirkung von exogenen Reize (z.B.Licht) auf Zellen, die ihren Wohnsitz in diesem kritischen Bereich zu erhalten. Im Jahr 2001 erstmals Hitoshi Okamuras Gruppe der Biolumineszenz-System zur in-Vivo Genexpression Monitor circadianen Uhr im SCN in frei beweglichen Mäuse⁷verwenden. Ken-Ichi Honma Gruppe verbrachte die letzten Jahren Weiterentwicklung der Biolumineszenz in Vivo recording-System in der SCN^8,9,10. Zusammen haben diese Studien Forscher mit der Fähigkeit der circadiane Uhr in ständiger Dunkelheit oder nach einem Lichtimpuls zu überwachen zur Verfügung gestellt. Jedoch da Biolumineszenz zu schwach ist für kontinuierliche Überwachung während des Hell-Dunkel-Zyklus, gepaart mit der Tatsache, dass Licht das vorherrschende Signal für die SCN-vermittelten Entrainment ZIRKADIANE Uhren¹¹erforderlich ist es gibt steigende Nachfrage für die Entwicklung von experimentellen Methoden, die Überwindung der Grenzen Biolumineszenz Aufnahme zugeordnet. Der vorliegende Bericht beschreibt ein Fluoreszenz-basiertes System, das errichtet wurde, um die innere Uhr des SCN in Vivo in Mäusen frei beweglich zu überwachen. Diese einfach zu bedienende Methode ermöglicht kontinuierliche Überwachung während des Hell-Dunkel-Zyklus und ermöglicht die langfristige Beobachtung der Transkription von Genen der circadianen Uhr im SCN in Echtzeit und in hoher zeitlicher Auflösung.

Protokoll

Alle Verfahren in diesem Protokoll wurden mit Zustimmung der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des National Institute of Biological Sciences, Peking, im Einklang mit der staatlichen Regelungen des China durchgeführt.

1. Bau der Cry1 -Fluoreszenz-Reporter

Hinweis: Frühere circadiane Studien mit Biolumineszenz System^2,12,13 Sicherung circadiane Förderer mit einer destabilisierten Luciferase (dLuc), rhythmische dLuc Ausdruck zu induzieren. Um ein Fluoreszenz-Reporter zu entwickeln, wurde destabilisiert Luciferase mit destabilisiert Fluoreszenz Protein (dVenus) induzieren rhythmische dVenus Ausdruck ersetzt. Die Generation der P (Cry1)-dVenus Reporter ist weiter unten beschrieben, das Konstrukt ist derzeit Addgene übermittelt und werden bald für den akademischen Gebrauch zur Verfügung stehen.

1. Den funktionale Maus Cry1 Projektträger (+328-1208 bp Region des Gens Cry1 , Transkription Startsite als '' -1 '' bezeichnet) zu verstärken. Verwenden Sie die PCR-Enzym (KOD Plus Neo), Primer F1 und R1 (siehe Tabelle 2), Maus Genom als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll, um das Cry1 Förderer DNA-Fragment zu verstärken.
2. Intron 336 des Cry1 -Gens, die wichtig für die Funktion der circadianen Uhr Cry1¹⁴zu verstärken. Verwenden Sie das Enzym PCR Primer F2 und R2, Maus Genom als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll, das Intron 336 DNA-Fragment zu verstärken.
3. Venuszu verstärken. Verwenden Sie das Enzym PCR Primer F3 und R3, pVENUS-N1 Plasmid als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll um die Venus DNA-Fragment zu verstärken.
4. Das NLS-D2 DNA-Fragment zu verstärken. Verwenden Sie das Enzym PCR Primer F4 und R4, pcDNA3.3-d2eGFP-Plasmid als Vorlage und des Herstellers PCR-Protokoll um die NLS-D2 DNA-Fragment zu verstärken.
5. Synthetisieren Sie DNA-Fragment 1 als Exon 1.
6. DNA-Fragment 2 als Linker zwischen Intron 336 und die Venus -DNA-Fragment zu synthetisieren.
7. Schneiden Sie die pAAV-EF1a-Doppel-Floxed-hChR2 (H134R) - mCherry - WPRE-HGHpA-Vektor-Plasmid mit den Enzymen, MluI und EcoRI. Verwenden Sie das Gel Extraction Kit, um das größere DNA-Fragment zu reinigen. Protokoll des Herstellers zu verwenden.
8. Mit einem Gibson-Montage-Mix und seine standard-Protokoll, montieren Sie alle DNA-Fragmente zusammen, um die pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA Reporter zu produzieren. Protokoll des Herstellers zu verwenden.

2. Herstellung von Adeno-assoziierten Virus¹⁵

1. Vorbereitung der folgenden Plasmid DNA-Aktien: 31,25 µg von pRV1, 31,25 µg pH21 und 125 µg pFdelta6 62,5 µg pAAV-p (Cry1) - intron336 - Venus-NLS - D2-WPRE-HGHpA.
2. Bereiten Sie fünf 15 cm Gerichte der 293T Zellen und warten Sie, bis die Zellen 90 % Zusammenfluss werden.
3. Transfizieren Sie Plasmide in den 297T Zellen nach der Transfektion Reagenz-Protokolls. Für jedes Gericht verwenden, 6,25 µg von pRV1, 6,25 µg pH21, 25 µg pFdelta6, 12,5 µg pAAV-p (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA und 120 µL Transfection Reagens.
4. 72 h nach Transfektion, lösen die Zellen von jeder Platte mit einer Pipette Waffe; Ernten Sie die Zellen in zwei 50 mL Röhrchen.
5. Pellet-Zellen bei 800 X g für 10 min und den überstand verwerfen. Waschen Sie die Zellen, indem man 20 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in jedes Rohr; Pellet-Zellen bei 800 X g für 10 min, und den überstand verwerfen.
6. Aufschwemmen Sie Pellets in 150 mM NaCl und 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0; Verwenden Sie 25 mL der Lösung/Schlauch. Jedes Rohr 1,25 mL frisch zubereitete 10 % Natrium-Deoxycholate (in dH₂O) hinzufügen. Eine Endkonzentration von 50 Einheiten pro mL Benzonase Nuklease hinzufügen und gut durchmischen. Inkubation bei 37 ° C für 1 h.
7. Zelltrümmer durch Zentrifugieren bei 3000 X g für 15 min entfernt. Weiter zu gewährleisten, dass alle Verschmutzungen entfernt worden ist, indem man die Mischung durch einen 0,45-μm-Spritze-Filter; Dieser Schritt hilft Heparin Spalten verhindert.
8. Einrichten von Heparin Spalten mithilfe einer peristaltischen Pumpe; Einstellen der Durchflussmenge bis 1 mL/min, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen in die Spalten eingeführt werden.
9. Equilibrate der Spalten mit 10 mL eines 150 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0. Fügen Sie die Lösung mit dem Virus zu jeder Spalte hinzu. Waschen Sie die Spalten mit 20 mL einer 100 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0. Dann, mit einer 5 mL Spritze, die Spalten mit 1 mL einer 200 mm NaCl und 20 mM Tris-Lösung pH 8.0, gefolgt von 1 mL einer 300 mm NaCl und 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0 waschen.
10. Eine 5 mL Spritze um das Virus mit 3 mL eines 400 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0, gefolgt von 4 mL 450 mm NaCl, 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0, eluieren verwenden und schließlich durch eine 3 mL eines 500 mm NaCl , 20 mM Tris-Lösung, pH 8.0. Die extrahierten Materialien zu sammeln.
11. Laden Sie für rekombinantes Adeno-assoziierte Virus (rAAV) Konzentration des geförderten Materials, 4 mL in einer Zeit, in zentrifugale Filtereinheiten mit einem 100.000 Molekulargewicht cutoff. Zentrifugieren Sie jede 4-mL-Probe bei 2000 X g für 5 min bei Raumtemperatur, verwerfen die Durchströmung.
12. Wenn alle geförderten Materials durch die zentrifugale Filtereinheiten ausgeführt wurden, fügen Sie 4 mL PBS und Zentrifugieren Sie die Mischung in rund 250 μL. RAAVs zu entfernen (virale Titer sollte über 2-8 x 10¹² Viruspartikel pro mL) im zentrifugalen Filtereinheiten, aliquoten und Store bei-80 ° C bis zur Verwendung. In diesem Stadium kann das Virus für mehrere Monate gespeichert werden.

(3) rAAV Injektion und optische Faser Einlegen in der Erwachsenen Maus SCN

1. Injektion von zirkadianen Fluoreszenz Reporter-tragenden rAAVs in der SCN
   1. 5 µL rAAV zu laden (der Virustiter geht es um 2 bis 8 x 10¹² Viruspartikel pro mL) in eine Mikro-Spritze.
   2. Betäuben Sie Erwachsenen Mäuse (2, 5-Monate alten, C57BL/6 Hintergrund) mit Nembutal (80 mg/kg), über intraperitoneale Injektion. Suchen Sie nach ausreichender Tiefe der Narkose durch das Fehlen einer Zehe-Prise Antwort.
   3. Mit einer Schere den Kopf der Maus Fell entfernen und montieren Sie dann die Maus in einer stereotaktischen Apparat. Bieten Sie eine Wärmequelle zu betäubten Tiere über einer zirkulierenden Warmwasser Decke oder ein anderes Heizgerät.
      Hinweis: Verwenden Sie alternativ enthaarende Creme oder elektrischen Haarschneidemaschinen, um das Fell zu entfernen.
   4. Reinigen Sie der Operationsstelle mit geeigneten Desinfektionsmitteln. Beispielsweise könnte dies gehören sterilem Wasser oder Alkohol und Jod, Betadine oder Chlorhexidin in wechselnden Peelings zu verdünnen. Wiederholen Sie mindestens 3 Mal. Drapieren Sie der Operationsstelle.
   5. Verwenden Sie die Schere, machen einen Schnitt in der Kopfhaut und setzen den Schädel.
   6. Einstellen Sie das stereotaktischen Gerät so, dass Bregma und Lambda in der gleichen horizontalen Ebene sind; machen Sie zwei symmetrische Punkte von Bregma, in der gleichen horizontalen Ebene.
   7. Verwendung eines sterilen Wattetupfer getränkt in 4 % H₂O2/h₂O, um das Gehirn Periost korrodieren. Dann verwenden Sie ein sauberes, steriles Wattestäbchen und trocknen Sie die Oberfläche des Schädels.
   8. Mit einem Mikro Bohrer, machen Sie ein Loch von ca. 1 mm im Durchmesser posterior 0,46 mm und 0,25 mm seitliche, Bregma.
   9. _fi Verwenden Sie einen sauberen sterilen Wattestäbchen mit physiologischer Kochsalzlösung, um Knochenfragmente von der sichtbaren Oberfläche des Gehirns zu löschen.
   10. Legen Sie eine Mikro-Spritze in das Gehirn, um sicherzustellen, dass die Spitze der Mikro-Spritze 0,46 mm posterior ist und 0,25 mm seitliche Bregma und 5,7 mm tief von der Oberfläche des Schädels.
   11. Injizieren 500 nL rAAV (50 nL min^-1) in der SCN, verlassen die Mikro-Spritze in Ort für 10 min nach der Injektion um komplette Diffusion von rAAV sicherzustellen.
   12. Ziehen Sie langsam die Mikro-Spritze.
2. Legen Sie die optische Faser in den SCN-Bereich.
   1. Schneiden Sie mit einem Glasfaser-Messer eine Faser 17-mm in der Länge, um sicherzustellen, dass jede Seite der optischen Faser glatt ist.
   2. Die Glasfaser in die Keramik Ferrule und befestigen Sie der Glasfaser, Keramik Ferrule mit Methyl-Ethyl-Keton-Peroxid (AB Kleber), um sicherzustellen, dass die Oberflächen der Glasfaser und Keramik Ferrule bündig sind.
   3. Reinigen Sie die Faser mit einer kalten sterilisiermittel Lösung oder Ethylen oxid.
   4. Nach rAAV Injektion (Schritt 3.1.11) einfügen der Keramik Ferrule-haltigen Glasfaser in der SCN.
   5. Befestigen Sie den Keramik-Ferrule und optische Faser auf den Schädel mit dental Harz und trocknen lassen.
   6. Schmieren Sie die Oberfläche des zahnärztlichen Harzes mit hinteren Nagellack. Wiederholen Sie die Schritte in 3.1.2, 3.2.5, weglassen der eigentlichen Injektion von rAAV zur Steuerung beschrieben.
3. Postoperative Pflege
   1. Subkutan, postoperative Schmerzmittel wie Buprenorphin 2 mg/kg Körpergewicht, Mäuse bieten zweimal am Tag.
   2. Platzieren Sie Mäuse in einem Recovery-Käfig, während sie aus der Narkose kommen.
   3. Hausmäuse individuell unter einer 12 h hell/dunkel-Bedingung (Lichtintensität ~ 100 Lux an der Unterseite des Käfigs) mit Essen/Wasser verfügbar Ad Libitum. Acht Tage sollen vor weiter experimentieren, um genügend Erholungszeit zu ermöglichen und um optimale Fluoreszenz Reporter Ausdruck entfallen.

4. in Vivo Fluoreszenz Signalüberwachung und Datenerhebung

1. Acht Tage nach der Operation, die Faser auf den Maus-Kopf mit der Fluoreszenz-Signal-Monitor verbinden (zB., Gene Observer). Überprüfen Sie das Fluoreszenzsignal im SCN der Kontroll-Mäusen, das Hintergrundsignal zu etablieren. Führen Sie die Beobachtung und Messung dieses Signals mit Fluoreszenz-Signal-Monitor.
2. Bewerten Sie das Fluoreszenzsignal experimentelle Maus mit dem gleichen Betrieb der Maus Steuerung. Schließen Sie Mäuse die viralen Vektoren erhalten haben, aber die Anzeige nur das Hintergrundsignal aus Analyse, aus, da dies bedeutet wahrscheinlich, dass die Spitze der optischen Faser die SCN verpasst hat. Nach diesen ersten Maßnahmen zurück Mäuse in ihrer Heimat Käfige für weitere 3 Wochen erlauben das Fluoreszenzsignal zu stabilisieren.
3. Verbinden Sie nach 3 Wochen die Mäuse mit der Fluoreszenz-Signal-Monitor. Messung die Fluoreszenz für 15 s alle 10 Minuten, bei einer Frequenz von 100 Hz. Während diese Messungen sind die Mäuse frei beweglichen in ihren Käfigen mit Essen/Wasser verfügbar Ad Libitum. Verwenden Sie eine Lichtintensität auf dem Boden des Käfigs von ~ 100 Lux, und eine Leistung des Lasers an der Spitze der Glasfaser zwischen 15-20 µW.
4. Perfundieren Sie nach der Fertigstellung aller Aufnahmen Mäuse mit 4 % Paraformaldehyd und entfernen Sie und in Scheiben schneiden Sie die Gehirne um Platzierung der optischen Faser zu überprüfen. Schließen Sie Mäuse aus Analyse, wenn die Glasfaser-Tipp nicht richtig im SCN implantiert wird.

(5) Datenanalyse und Präsentation

1. Maßnahme-Fluoreszenz-signal alle 10 min für 15 s, bei einer Frequenz von 100 Hz bis 1500 Datenpunkte ergeben. Der Durchschnitt dieser 1500 Punkte entspricht das Fluoreszenzsignal zu jedem gegebenen Zeitpunkt. Plotten mehrere Durchschnitte im Laufe der Zeit produziert eine Signal-Zeit-Kurve entspricht die transkriptionelle Rhythmus der Cry1 unter einer leichten Kontrollbedingung im SCN Mäusen frei zu bewegen.

Ergebnisse

Fluoreszenz-Reporter-Design der Cry1 war Show in Figur 1A. Mit dem Ansatz über 500 detaillierte nL rAAV-p (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 wurde erfolgreich in der SCN Erwachsener Mäuse injiziert und robuste Venus Ausdruck (Abbildung 1 b, 1 C) ausgestellt. Fluoreszenz-Signale aufgezeichnet unter 12h / 12h hell/dunkel (LD) und dunkel/dunkel (DD) Bedingungen (Abbildung 2

Diskussion

Im Gegensatz zu ex-Vivo -Methoden, z. B. Slice Kultur^4,5, RT-PCR¹⁶und in Situ Hybridisierung¹⁷, die erfordern, dass Tiere getötet werden, kann das in Vivo Aufnahme Methode Ermittler, circadiane Genexpression in ein lebendes Tier zu studieren. Als solche bietet diese Technologie die Möglichkeit, die Wirkung der verschiedenen körperlichen Störungen (z.B., Schlafentzug, Stress, E...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD Plus Neo	TOYOBO	KOD-401	Reagent
pVENUS-N1	addgene	#61854	Plasmid
pcDNA3.3_d2eGFP	addgene	#26821	Plasmid
pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA	addgene	#20297	Plasmid
MluI	Thermo Scientific	FD0564	Reagent
EcoRI	Thermo Scientific	FD0274	Reagent
Gibson Assembly Mix	NEB	E2611s	Reagent
Lipofectamine 2000	Thermo Scientific	12566014	Reagent
Syringe Filter	EMD Millipore	SLHV033RS	0.45 µm
HiTrap heparin columns	gelifesciences	17-0406-01	1 mL
Amicon ultra-4 centrifugal filter	EMD Millipore	UFC810024	100,000 MWCO
Benzonase nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	Reagent
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D5670	Make fresh solution for each batch
mouse stereotaxic apparatus	B&E TEKSYSTEMS LTD	#SR-5M/6M	Equipment
pentobarbital	SigmaAldrich	#1507002	Reagent
mouse stereotaxic apparatus	B&E TEKSYSTEMS LTD	#SR-5M/6M	Equipment
Hydrogen peroxide solution	SigmaAldrich	#216763	Reagent
Optical Fiber	Thorlabs	FT200EMT	0.39 NA, Ø200 µm
microsyringe pump	Nanoliter 2000 Injector, WPI		Equipment
ceramic ferrule	Shanghai Fiblaser		230 μm I.D., 2.5 mm O.D.
Gene Observer	BiolinkOptics		Equipment