Na Vivo Monitoramento de expressão de Gene relógio circadiano no núcleo supraquiasmático do Mouse usando a repórteres de fluorescência

Resumo

Esta tecnologia baseada em fluorescência recém-desenvolvido permite a monitoração a longo prazo da transcrição de genes do relógio circadiano no núcleo supraquiasmático (SCN) de movimentando-se livremente os ratos em tempo real e em uma alta resolução temporal.

Resumo

Esta técnica combina fibra óptica mediada por gravações de fluorescência com a entrega precisa de repórteres de gene recombinante vírus adeno-associado à base. Este novo e fácil de usar na vivo fluorescência sistema de vigilância foi desenvolvido para gravar o ritmo transcricional do gene do relógio, Cry1, no núcleo supraquiasmático (SCN) de ratos movimentando-se livremente. Para fazer isso, um repórter de fluorescência de transcrição Cry1 foi projetado e empacotado em vírus Adeno-associado. Vírus purificado, concentrado foi injetado o SCN seguido pela inserção de uma fibra óptica, que fixou-se então para a superfície do cérebro do rato. Os animais foram voltou para suas casa gaiolas e permitidos um período de recuperação pós-operatória de 1 mês para assegurar suficiente expressão de repórter. Fluorescência foi então gravada em movimentando-se livremente os ratos através de um na vivo monitoramento sistema que foi construído em nossa instituição. Para o na vivo sistema de gravação, um laser de 488 nm foi acoplado com um 1 × 4-divisor de feixe que divide a luz em quatro saídas de excitação do laser do poder igual. Esta configuração permitiu gravar a partir de quatro animais simultaneamente. Cada um dos sinais de fluorescência emitida foi coletado através de um tubo fotomultiplicador e uma placa de aquisição de dados. Em contraste à anterior bioluminescência na vivo gravação relógio circadiano técnica, esta fluorescência na vivo gravação sistema permitiu a gravação de expressão de gene relógio circadiano durante o ciclo de luz.

Introdução

Nos mamíferos, o núcleo supraquiasmático (SCN) rege o ritmo circadiano do todo o corpo para coordenar a resposta do indivíduo a mudanças ambientais exógenos (por exemplo, luz, temperatura, estresse, etc.)¹. Componentes principais do relógio consistem de Per1-3, Cry1-2, relógioe Bmal1e desempenham um papel central na regulação do relógio circadiano de cada célula. O SCN cada célula contém o ativador transcricional, relógio/BMAL1, que atua como um heterodímero para induzir a expressão do PER e chorar. O PER / complexo de chorar então inibe a função de relógio/BMAL1 para formar um laço de realimentação de transcrição-tradução que leva cerca de 24 h para completo^2,3.

Estudos anteriores sobre o SCN principalmente têm empregado a ex vivo SCN fatia cultura método^4,5,6 , e, enquanto esta abordagem forneceu informações valiosas, suas limitações têm inibido a nossa capacidade de obter dados sobre a influência de outros núcleos do cérebro sobre o SCN, bem como o efeito de estímulos exógenos (por exemplo, luz) em células que residem nesta região crítica. Em 2001, o grupo de Hitoshi Okamura foi o primeiro a usar o sistema de bioluminescência da expressão gênica em vivo monitor relógio circadiano no SCN em ratos⁷movimentando-se livremente. Grupo do Ken-ichi Honma passou os últimos anos desenvolver a bioluminescência na vivo sistema de gravação no SCN^8,9,10. Juntos, esses estudos forneceram os pesquisadores com a capacidade de monitorar o relógio circadiano na escuridão constante ou após um pulso de luz. No entanto, como bioluminescência é muito fraca para permitir a monitorização contínua durante o ciclo luz/escuridão, juntamente com o fato de que a luz é o sinal predominante necessário para o arrastamento de SCN-mediada de pulsos de disparo circadian¹¹, há crescente demanda para o desenvolvimento de métodos experimentais que superar as limitações associadas com gravação de bioluminescência. O presente relatório descreve um sistema baseado em fluorescência, que foi construído para monitorar o relógio circadiano do SCN na vivo em ratos movimentando-se livremente. Este método fácil de usar permite a monitorização contínua durante o ciclo claro/escuro e permite a observação a longo prazo da transcrição de genes do relógio circadiano no SCN em tempo real e em alta resolução temporal.

Protocolo

Todos os procedimentos neste protocolo foram realizados com a aprovação do cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) do Instituto Nacional de ciências biológicas, Beijing, em conformidade com os regulamentos governamentais da China.

1. construção do repórter fluorescência Cry1

Nota: Estudos anteriores circadianos, usando o sistema de bioluminescência^2,12,13 fusível um promotor circadiano com um desestabilizado luciferase (dLuc) para induzir a expressão rítmica dLuc . Para desenvolver um repórter de fluorescência, desestabilizado luciferase foi substituído com proteína de fluorescência desestabilizado (dVenus) para induzir a expressão rítmica dVenus . A geração do p (Cry1)-dVenus repórter é descrita a seguir, o conceito de que atualmente está sendo enviado para Addgene e estará disponível em breve para uso acadêmico.

1. Amplifica o promotor de Cry1 funcional do rato (+328 a região de-1208 bp do gene Cry1 , local de início de transcrição designada como '-1 '). Usar a enzima PCR (KOD Plus Neo), as primeiras demão F1 e R1 (ver quadro 2), rato do genoma como um modelo e PCR do fabricante do protocolo para amplificar o fragmento de DNA de promotor Cry1 .
2. Amplifica intrão 336 do gene Cry1 , que é importante para a função de relógio circadiano do Cry1¹⁴. Use a enzima PCR, cartilhas de F2 e R2, genoma do rato como um modelo e protocolo PCR do fabricante para amplificar o fragmento de DNA intrão 336.
3. Amplifica a Vênus. Use a enzima PCR, primeiras demão F3 e R3, pVENUS-N1 plasmídeo como um modelo e protocolo PCR do fabricante para amplificar o fragmento de DNA de Venus .
4. Amplifica o fragmento de DNA de NLS-D2. Use a enzima PCR, primeiras demão F4 e R4, pcDNA3.3-d2eGFP do plasmídeo como um modelo e protocolo PCR do fabricante para amplificar o fragmento de DNA de NLS-D2.
5. Sintetiza o fragmento de DNA 1 como exon 1.
6. Sintetiza o fragmento de DNA 2 como o vinculador entre intrão 336 e o fragmento de DNA de Venus .
7. Cortar o duplo pAAV-EF1a floxed-hChR2 (H134R) - mCherry - WPRE-plasmídeo vetor de HGHpA com as enzimas MluI e EcoRI. Use o Kit de extração do Gel para purificar o maior fragmento de DNA. Use o protocolo do fabricante.
8. Usando uma mistura de montagem Gibson e seu protocolo padrão, reúna todos os fragmentos de DNA para produzir o repórter-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA pAAV-P (Cry1). Use o protocolo do fabricante.

2. produção de vírus Adeno-associado¹⁵

1. Preparar o plasmídeo seguinte estoques de DNA: 31,25 µ g de pRV1, 31,25 µ g de pH21, 125 µ g de pFdelta6 e 62,5 µ g do pAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS - D2-WPRE-HGHpA.
2. Prepare cinco pratos de 15 cm de 293T células e esperar até que as células se tornam confluente de 90%.
3. Transfect os plasmídeos dentro das células 297T seguindo o protocolo de reagente de transfeccao. Para cada prato, use 6,25 µ g de pRV1, 6,25 µ g de pH21, 25 µ g de pFdelta6, 12,5 µ g do pAAV-P (Cry1)-intron336-Venus-NLS-D2-WPRE-HGHpA e 120 µ l de reagente de transfeccao.
4. 72 h após a transfeccao, separar as células de cada prato usando uma arma de pipeta; Colha as células em dois tubos de 50 mL.
5. As células a 800 x g por 10 min de pelotas e descartar o sobrenadante. Lavar as células, colocando-se 20 mL de tampão fosfato salino (PBS) para cada tubo; as células a 800 x g por 10 min de pelotas e descartar o sobrenadante.
6. Resuspenda pelotas em 150 mM NaCl e 20 mM Tris solução, pH 8.0; Use 25 mL de solução/tubo. Adicione 1,25 mL de acabadas Deoxycholate do sódio de 10% (em dH₂O) para cada tubo. Adicione benzonase nuclease para uma concentração final de 50 unidades / mL e misture bem. Incube a 37 ° C, durante 1 h.
7. Remova restos celulares por centrifugação a 3000 x g, durante 15 min. Assegurar que todos os detritos foi removido, empurrando a mistura através de um filtro de seringa de 0,45 μm; Esta etapa irá ajudar a evitar o bloqueio das colunas de heparina.
8. Configurar as colunas de heparina usando uma bomba peristáltica; Defina a taxa de fluxo de 1 mL/min, garantindo que não há bolhas de ar são introduzidas as colunas.
9. Equilibrar as colunas com 10 mL, uma de 150 mM de NaCl, solução de Tris, pH 8.0 de 20 mM. Adicione a solução contendo o vírus para cada coluna. Lave as colunas com 20 mL de uma 100 mM NaCl, solução de Tris, pH 8.0 de 20 mM. Em seguida, usando uma seringa de 5 mL, lave as colunas com 1 mL de 200 mM NaCl e o 20 mM Tris solução pH 8.0, seguidas por 1 mL de 300 mM NaCl e solução de Tris de 20 mM, pH 8.0.
10. Use uma seringa de 5 mL para Eluir o vírus com 3 mL de 400 mM NaCl, solução de Tris de 20 mM, pH 8.0, seguido de 4 mL de 450 mM NaCl, solução de Tris de 20 mM, pH 8.0 e finalmente por um 3 mL de um 500 mM NaCl , solução de Tris de 20 mM, pH 8.0. Colete os materiais extraídos.
11. Para a concentração de vírus adeno-associado recombinante (rAAV), carrega os materiais extraídos, 4 mL de cada vez, em unidades de filtro centrífugo com um peso molecular 100.000 corte. Cada amostra de 4 mL a 2000 x g por 5 min à temperatura ambiente, descartando o fluxo através do centrifugador.
12. Quando todos os materiais extraídos foram executados através das unidades de filtro centrífugo, adicione 4 mL de PBS e centrifugar a mistura em aproximadamente 250 μL. Remover rAAVs (título viral deve ser aproximadamente 2-8 x 10¹² partículas virais por mililitro) de unidades de filtro centrífugo, alíquota e loja a-80 ° C até o uso. Nesta fase, o vírus pode ser armazenado por vários meses.

3. rAAV injeção e inserção de fibra óptica para o SCN de rato adulto

1. Injeção de fluorescência circadian repórter de transporte rAAVs para o SCN
   1. Carregar 5 µ l de rAAV (o título do vírus é sobre 2-8 x 10¹² partículas de vírus por mL) em uma microseringa.
   2. Anestesia um rato adulto (2 a 5-meses, C57BL/6 de fundo) com Nembutal (80 mg/kg) através da injeção intraperitoneal. Verifique se há suficiente profundidade da anestesia a falta de uma resposta de dedo-pinch.
   3. Use a tesoura para remover a pele da cabeça do rato e em seguida, montar o mouse em um aparelho estereotáxica. Fornece uma fonte de calor para animais anestesiados via um cobertor de água quente circulante ou outro dispositivo de aquecimento.
      Nota: Como alternativa, use máquina de cortar cabelo elétrica ou creme depilatório para remover as peles.
   4. Limpe o local cirúrgico com os agentes de desinfecção apropriados. Por exemplo, isso poderia incluir água estéril ou álcool e iodo, betadine, ou diluir clorexidina alternando esfrega. Repita pelo menos 3 vezes. Cubra o local cirúrgico.
   5. Use a tesoura para fazer uma incisão no couro cabeludo e expor o crânio.
   6. Ajustar o aparelho estereotáxica para que bregma e o lambda são no mesmo plano horizontal; Faça dois pontos simétricos de bregma no mesmo plano horizontal.
   7. Uso um cotonete estéril embebido em 4% H₂O2/h₂O para corroer o periósteo do cérebro. Em seguida, use um cotonete de algodão limpas e esterilizadas para limpar e secar a superfície do crânio.
   8. Usando uma broca de micro, fazer um buraco de cerca de 1 mm em diâmetro posterior 0,46 mm e 0,25 mm lateral para bregma.
   9. _Fi Use um limpo com cotonete estéril com soro fisiológico para limpar fragmentos ósseos da superfície exposta do cérebro.
   10. Insira uma microseringa no cérebro, garantindo que a ponta da microseringa é 0,46 mm posterior e lateral de 0,25 mm de bregma e 5,7 mm de profundidade da superfície do crânio.
   11. Injetar 500 nL de rAAV (50 nL min^-1) para o SCN, deixando a microseringa no lugar por 10 minutos após a injeção para assegurar a divulgação completa de rAAV.
   12. Retire lentamente a microseringa.
2. Insira a fibra óptica para a área SCN.
   1. Usando uma faca de fibra óptica, cortar uma fibra 17 mm de comprimento, certificando-se que cada lado da fibra óptica é suave.
   2. Insira a fibra óptica a virola cerâmica e corrigir a fibra óptica para uma virola cerâmica com peróxido de metil etil cetona (colagem de AB), garantindo que as superfícies da fibra óptica e virola cerâmica estão alinhadas.
   3. Limpe a fibra com um óxido de etileno ou solução esterilizante frio.
   4. Após a injeção de rAAV (etapa 3.1.11), insira a fibra óptica cerâmica virola-contendo o SCN.
   5. Corrigir a virola cerâmica e fibra óptica para o crânio usando resina dentária e deixe para secar.
   6. Manche a superfície da resina dental com costas unha polonês. Repita os procedimentos descritos na 3.1.2 para 3.2.5, omitindo a injeção real de rAAV para controle.
3. Cuidados pós-cirúrgicos
   1. Fornecer os ratos com analgésicos no pós-operatório, tais como a buprenorfina 2 mg/kg de peso corporal, por via subcutânea, duas vezes por dia.
   2. Coloque os ratos em uma gaiola de recuperação enquanto eles vêm da anestesia.
   3. Ratos de casa individualmente sob uma condição de claro/escuro de 12 h (intensidade da luz ~ 100 lux no fundo da gaiola) com comida/água disponível ad libitum. Antes de mais experimentação para permitir tempo de recuperação suficiente e para garantir a expressão de repórter de fluorescência ideal deve ser atribuídos a oito dias.

4. in vivo da fluorescência sinal monitoramento e coleta de dados

1. Oito dias após a cirurgia, conectar-se a fibra na cabeça do rato com o monitor de sinal de fluorescência (EG., Gene Observer). Verificar o sinal de fluorescência no SCN de ratos controle para estabelecer o sinal de fundo. Realize a observação e medição deste sinal usando o monitor do sinal de fluorescência.
2. Avalie o sinal de fluorescência do mouse experimental com a mesma operação do mouse controle. Exclua os ratos que receberam o vetor viral, mas que apenas exibir o sinal de fundo de análise, já que provavelmente indica que a ponta da fibra óptica perdeu o SCN. Após estas medidas iniciais, retorne os ratos de suas gaiolas para casa daqui a 3 semanas permitir que o sinal de fluorescência estabilizar.
3. Após 3 semanas, conecte os ratos com o monitor de sinal de fluorescência. Medir a fluorescência por 15 s cada 10 min, com uma frequência de 100 Hz. Durante as medições, os ratos circulam livremente em suas gaiolas com comida/água disponível ad libitum. Use uma intensidade de luz na parte inferior da gaiola de ~ 100 lux e um a potência do laser na ponta da fibra óptica entre 15-20 µW.
4. Após a conclusão de todas as gravações, perfundir ratos com paraformaldeído 4% e remover e cortar o cérebro para verificar a colocação da fibra óptica. Exclui os ratos análise se a ponta de fibra óptica não é corretamente implantada no SCN.

5. apresentação e análise de dados

1. Sinal de fluorescência medida cada 10min para 15 s, com uma frequência de 100 Hz, para produzir 1500 pontos de dados. A média desses pontos 1500 traduz para o sinal de fluorescência em qualquer ponto do tempo determinado. Plotagem de várias médias ao longo do tempo produz uma curva de sinal-para-tempo que corresponde ao ritmo transcriptional do Cry1 sob uma condição de controle de luz no SCN de ratos movimentando-se livremente.

Resultados

Projeto de repórter de fluorescência do Cry1 foi mostrar na figura 1A. Usando a abordagem detalhados acima, 500 nL de rAAV-P (Cry1) - intron336 - Venus-NLS-D2 com êxito foi injetado o SCN de um rato adulto e exibiu expressão de Venus robusto (figura 1B, 1C). Sinais de fluorescência gravados em condições de escuro/escuro (DD) (Figura 2) e 12h/12h claro/escuro ...

Discussão

Em contraste com o ex vivo métodos, tais como a fatia cultura^4,5, RT-PCR¹⁶e em situ da hibridação¹⁷, que exigem que os animais mortos, o na vivo método de gravação permite investigadores para estudar a expressão gênica circadiano em um animal vivo. Como tal, esta tecnologia fornece a capacidade de avaliar o efeito de perturbações físicas diferentes (por exemplo, privaç...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD Plus Neo	TOYOBO	KOD-401	Reagent
pVENUS-N1	addgene	#61854	Plasmid
pcDNA3.3_d2eGFP	addgene	#26821	Plasmid
pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA	addgene	#20297	Plasmid
MluI	Thermo Scientific	FD0564	Reagent
EcoRI	Thermo Scientific	FD0274	Reagent
Gibson Assembly Mix	NEB	E2611s	Reagent
Lipofectamine 2000	Thermo Scientific	12566014	Reagent
Syringe Filter	EMD Millipore	SLHV033RS	0.45 µm
HiTrap heparin columns	gelifesciences	17-0406-01	1 mL
Amicon ultra-4 centrifugal filter	EMD Millipore	UFC810024	100,000 MWCO
Benzonase nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	Reagent
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D5670	Make fresh solution for each batch
mouse stereotaxic apparatus	B&E TEKSYSTEMS LTD	#SR-5M/6M	Equipment
pentobarbital	SigmaAldrich	#1507002	Reagent
mouse stereotaxic apparatus	B&E TEKSYSTEMS LTD	#SR-5M/6M	Equipment
Hydrogen peroxide solution	SigmaAldrich	#216763	Reagent
Optical Fiber	Thorlabs	FT200EMT	0.39 NA, Ø200 µm
microsyringe pump	Nanoliter 2000 Injector, WPI		Equipment
ceramic ferrule	Shanghai Fiblaser		230 μm I.D., 2.5 mm O.D.
Gene Observer	BiolinkOptics		Equipment