Erkennung und Quantifizierung von Plasmodium Falciparum in wässrigen roten Blutkörperchen durch gedämpft totale Reflexion Infrarotspektroskopie und Multivariate Datenanalyse

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von Plasmodium Falciparum infizierten wässrigen roten Blutkörperchen mit einem abgeschwächten Totalreflexion Infrarot-Spektrometer und multivariate Datenanalyse.

Zusammenfassung

Wir zeigen eine Methode zur Quantifizierung und Nachweis von Parasiten in wässrigen roten Blutkörperchen (Erythrozyten) mithilfe einer einfachen Benchtop abgeschwächt totale Reflexion Fourier transformieren (ATR-FTIR) Infrarotspektrometer in Verbindung mit Multivariate Datenanalyse ( MVDA). 3 7 p. Falciparum wurden kultiviert, 10 % Parasitemia Ring Bühne Parasiten und verwendet frische Spender isoliert Erythrozyten erstellen eine Verdünnung Serie zwischen 0 – 1 Spike %. 10 µL jeder Probe wurden aufgestellt, auf die Mitte des Fensters ATR Diamant, das Spektrum zu erwerben. Die Beispieldaten wurde behandelt, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern und den Beitrag des Wassers zu entfernen, und dann die zweite Ableitung wurde angewandt, um die spektrale Eigenschaften zu lösen. Die Daten wurden dann mit zwei Arten von MVDA analysiert: erste Principal Komponente Analysis (PCA), Ausreißer und dann Partial Least Squares Regression (PLS-R) für die Quantifizierung Modellerstellung zu bestimmen.

Einleitung

Malaria zählt zu den verheerendsten Krankheiten unserer Zeit; mehr als die Hälfte die Bevölkerung lebt in endemischen Gebieten gefährdet und es unverhältnismäßig belastet die Armen^1,2,3,4. Ein großer Teil des Problems ist die asymptomatische Träger und frühen Stadium-Patienten, die als Reservoir für Moskito Vektoren⁵, Handeln verursacht Spikes von Infektion während der Regenzeit und in den Gemeinden bestehen bleiben soll, so dass. Malaria wird durch fünf Plasmodium -Parasiten, verursacht die tödlichste von denen p. Falciparum ist die schwerste Form der Krankheit²verursacht.

Derzeit sind Techniken für die Diagnose von Malaria weniger als perfekt. Optische Mikroskopie, der derzeitige Goldstandard erkennt nur 62-88 Parasiten/µL je nach der verwendeten Methode⁶. Darüber hinaus aufgrund der Intensität und hohen Geschick erforderlich, in vielen Regionen Mikroskopie Fehldiagnosen > 50 % der Fälle, vor allem solche mit niedrigem Parasitaemia Ebenen², in dem der Mangel an Ressourcen im Bereich und führt direkt zugeordnet werden können der Missbrauch von Anti-Malaria-Medikamenten. Die anderen 2 wichtigsten diagnostischen Methoden sind Schnelltests (RDTs), die Antikörper für die Erkennung und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Assays, die Diskriminierung und Parasiten von DNA quantifizieren zu nutzen. RDTs können derzeit nur zur Erkennung von p. Falciparum und p. Vivax von mindestens 100 Parasiten/µL Blut was in selteneren Formen der Krankheit nicht behandelt wird. ^{7 , 8} dagegen PCR-Assays diskriminieren und quantifizieren, verschiedene Arten von Plasmodium bei einer Empfindlichkeit von 0,0004-5 Parasiten/µL Blut. Aber es erfordert teure Reagenzien, Ausrüstung und technisches Geschick und so eignet sich nicht für den Feldeinsatz.

Eine höchst sensible, zuverlässige und erschwingliche Technik unbedingt verbessern Diagnose Mal Behandlungsergebnisse zu verbessern, und die Beseitigung der Krankheit ermöglichen. Abgeschwächte totale Reflexion Fourier Transform (ATR-FTIR) Spektroskopie bietet eine mögliche Lösung für dieses Problem. Bisherigen Arbeit hat gezeigt, dass war es möglich zu erkennen und zu quantifizieren, p. Falciparum in Methanol fixiert Blut Filme erreichen die Nachweisgrenzen der < 1 Parasit/µL Blut (< 0,0002 % Parasitemia)⁹, das PCR-Verfahren vergleichbar ist. Neuere Studien haben gezeigt, dass es möglich ist zu erkennen und zu quantifizieren Parasiten in wässrigen Proben und eliminieren die Fixierung Schritt. Allerdings müssen Faktoren wie Wasserdampf, spektrale Rauschen und Datenverarbeitung für optimale Ergebnisse¹⁰berücksichtigt werden.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, neue Benutzer zeigen, wie Sie erwerben FTIR-ATR Spektren und bereiten ein Regressionsmodell für die Erkennung von p. Falciparum von wässrigen Erythrozyten (RBC) Proben¹⁰.

Protokoll

Bitte konsultieren Sie geeignete Material Sicherheit Data Sheets (MSDS) und suchen Sie entsprechenden Biosafety Level 2 (BSL-2) Ausbildung zu. Alle Kultivierung Schritte erfolgen in einem BSL-2 Schrank mit aseptischen Technik, d. h. es gibt ein Risiko einer Exposition gegenüber schädlichen UV-Strahlung von Dekontamination Treppe, Nadel-Stick Verletzungen und möglichen biologischen Exposition und Infektion, wenn die Parasiten-Kultur tritt keine Verletzungen. Darüber hinaus ist bestand Blut von Blutbanken nur für bestimmte Krankheiten und das Potenzial für die Verbreitung von Blut übertragbaren Krankheiten untersucht ein potenzielles Risiko. Suchen Sie sofort medizinischen Hilfe in dem Auftreten von Verletzungen.

1. Vorbereitung und Messung von 3 7 Plasmodium Falciparum Parasit Verdünnungsreihe

Hinweis: Plasmodium SP. Kultur ist sehr empfindlich. Frisch/noch nicht abgelaufenen Reagenzien zu verwenden und die Parasiten durch Ändern der Medien regelmäßig zu füttern. Futtermittel-Kulturen unter 5 % Parasitemia jeden zweiten Tag. Kulturen zwischen 6-10 % Parasitemia einmal oder zweimal täglich zu füttern; und Kulturen zwischen 11 und 20 % bis zu 4 mal täglich zu füttern. Parasiten, die anfangen zu hungern verlieren ihre Form und beginnen, sich zusammenzuziehen. In einem solchen Fall füttern Sie und verdünnen Sie sofort von den Medien ändern und Hinzufügen von Lager Erythrozyten sammeln das Spenderblut in Blutentnahmeröhrchen mit Heparin als Antigerinnungsmittel und Maßnahme innerhalb der ersten 6 h.

1. Kultur insgesamt 30 mL von 3-7 Belastung Plasmodium Falciparum Parasiten nach dem Standardprotokoll, bis die Parasitemia 10 % Ringe erreicht.
2. Synchronisation von Parasiten
   1. 11 h nach Shizogeny in den Lebenszyklus des Parasiten, aufzuwirbeln, die Kultur und den Transfer in ein 50 mL konische Röhrchen mit einer automatisierten Pipette.
   2. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 300 – 400 x g und standard Laborbedingungen (25° C und 100 kPa) für 5 min.
   3. Entfernen Sie den Überstand durch Ausarbeitung mit einer Pipette oder mit einer Pasteurpipette angebracht zu einem Vakuum ohne zu stören das Pellet. Entsorgen Sie Abfall Medien in einem 10 % Bleichmittel-Lösung.
   4. Langsam das Pellet mit einem automatisierten Pipette 12 – 15 mL 4 % Sorbit-Lösung hinzu und mischen Sie die Kultur durch Kappung und invertieren das Rohr, bis die Kultur homogen ist.
   5. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C für 15 min.
   6. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 300 – 400 x g und standard Laborbedingungen für 5 min.
   7. Den Überstand zu entfernen, wie in Schritt 1.2.3 beschrieben.
   8. Das Pellet 10 – 15 mL 0,9 % Kochsalzlösung hinzu und mischen Sie die Lösung durch Kappung und invertieren das Rohr, bis die Kultur homogen ist.
   9. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.6–1.2.8 zweimal mehr, alle Reste von Sorbit zu waschen.
3. Vorbereitung der Baureihe Parasitemia Verdünnung
   1. Waschen Sie Lager Erythrozyten wie in den Schritten 1.2.6–1.2.9.
   2. Die Kultur bei standard Laborbedingungen, Lager Erythrozyten bei 300 – 400 X g für 5 min Zentrifugieren und überstand wie in Schritt 1.2.3 zu verwerfen.
   3. Label Mikrozentrifugenröhrchen als 0 %, 0,010 %, 0,025 %, 0.075 %, 0,100 %, 0.250 %, 0.750 % und 1.000 % und 0 µL, 1 µL, 2,5 µL, 7,5 µL, 10 µL, 25 µL, 75 µL und 100 µL der Kultur, die jeweils mit einer 0,2-20 µL Pipette dazugeben.
   4. Hinzu kommen 100 µL, 99 µL, 97,5 µL, 92,5 µL, 80 µL, 75 µL, 0 und 25 µL Lager RBCs die Röhren beschriftet 0 %, 0,010 %, 0,025 %, 0.075 %, 0,100 %, 0.250 %, 0.750 % und 1.000 % bzw..
   5. Zentrifugieren Sie die frischen Spenderblut gesammelt in Antikoagulans Rohre bei 1.200 x g und standard Laborbedingungen für 10 min.
   6. Entfernen Sie das Plasma durch Ausarbeitung mit einer Pipette und verwerfen, wie in Schritt 1.2.3 beschrieben.
   7. 900 µL isolierte Erythrozyten in jeder Microcentrifuge Schlauch und gründlich mischen durch 10 X invertieren.
4. Spektralen Erwerb
   1. Mit dem zugehörigen spektralen Erwerb Programm, klicken Sie auf "Instrument Set-up" und die Daten Sammlung Parameter Folgendes: 128 Scans für Hintergrund; 32-Scans für Probe; und die Auflösung auf 8/cm über die maximale Sample-Bereich des Instruments.
   2. Stellen Sie die Temperatur des ATR-FTIR-Spektrometers pro Empfehlung des Herstellers oder über Nacht.
   3. Reinigen Sie den Kristall sanft in kreisenden Bewegungen mit Flusen frei wischt mit Reinstwasser gedämpft schrubben. Dann trocknen Sie gründlich, mit einem anderen Flusen frei wischen.
   4. Nehmen Sie eine Hintergrundmessung der Luft, indem Sie auf "Hintergrundmessung". Alle 20 min, reinigen Sie den Kristall wie in Schritt 1.4.3 und wiederholen Sie diese Messung.
   5. Öffnen Sie die live-Ansicht durch Klicken auf "Vorschau". Beobachten Sie eine flache, horizontale Grundlinie, die angibt, dass das Glas sauber ist.
   6. Pipette 10 µL deionisiertes Wasser direkt auf die Mitte des Kristalls und klicken Sie auf "Maßnahme Sample". Wiederholen Sie die Messung dieses Wasser nach jeder fünften Probe.
   7. Trocknen Sie den Kristall ein Fussel freien abwischen mit sanften kreisenden Bewegungen.
   8. Pipette 10 µL der Probe, und klicken Sie auf "Maßnahme Sample".
   9. Reinigen Sie den Kristall zwischen Proben wie in Schritt 1.4.3.
   10. Wiederholen Sie, bis 3 Wiederholungen erworben werden, und achten Sie auf die Reihenfolge der Proben und die Wiederholungen zu randomisieren.

2. Multivariate Datenanalyse (MVDA)

Hinweis: Datenbehandlung muss über das gesamte Dataset durchgeführt werden, um Lärm und die Zugabe von Gipfeln nicht biologischen Ursprungs zu vermeiden. Im Gegensatz dazu über die biologisch relevanten Regionen analysieren: 2980-2800/cm und 1750-850/cm.

1. Verarbeitung der Daten
   Hinweis: Zwei Software, z. B. Matlab (im folgenden als Software 1 bezeichnet) und The Flaschenaufrichter X (im folgenden als Software 2 bezeichnet) dienen als Beispiele für MVDA. 1-Software hat die Fähigkeit der Ausführung MVDA ohne Zusatz von eine grafische Benutzeroberfläche (GUI). Es wird jedoch empfohlen, eine GUI (Table of Materials) zu kaufen. Die folgenden Anweisungen, wenn bezogen auf Software 1 annehmen, dass in Verbindung mit den im Handel erhältlichen GUI-Toolbox, und Behandlung Beispielskript Daten angehängt wurde.
   1. Öffnen Sie die entsprechenden multivariate Datenanalyse-Software zu, klicken Sie auf "Daten importieren" und wählen Sie den Typ der Datei für die Analyse.
      1. In der Software 1 Eingang "Analyse" in das Befehlsfenster, die GUI zu öffnen. Rechten Maustaste die X-Box, um "Daten importieren" zu finden.
      2. Software 2 Klicken Sie auf die Registerkarte "Datei" "Importieren" zu finden.
   2. Importieren Sie Probe, Wasser und Basislinie Spektren als Datensätze in den Arbeitsbereich durch alle Spektren in jedem Satz separat auswählen und auf "Öffnen" klicken und geben Sie jedem Satz einen kurzen Namen, z. B. "Wat" für Dataset Wasser Spektren.
   3. Wählen Sie neue Tabelle/Matrix durch Klicken auf "neue Matrix/Vektor" und erzeugen Sie einen n × 1-Vektor, wobei n die Anzahl der Samples ist. Geben Sie die Parasitemia jeder Probe und geben Sie dem Vektor der Name "Parasitemia".
      1. 1 Software klicken Sie auf "Neue Variable" im Befehlsfenster.
      2. Software 2 Klicken Sie auf das Symbol "Neue Matrix".
   4. Plot-Daten durch Anklicken der "Plot-Daten". Inspizieren Sie die Spektren für Wasserdampf Effekte durch Klicken auf "Zoom" und Zoomen auf 1800-1400/cm; am deutlichsten beobachtete als kurze, scharfe, schmale Peaks entlang der Hänge der Amid ich und Amid II Bands.
   5. Öffnen Sie in Fällen von extremen Wasserdampf Registerkarte "Bearbeiten/pre-process Data" zu, und wählen Sie "Glättung". Reduzieren Sie die Geräusche bzw. der starken Wasserdampf Beiträge durch Glätten der Probe und Wasser Spektren mit bis zu 25 Punkten der Glättung oder verwenden Sie eine Wasserdampf-Korrektur-Methode.
   6. Richtig nicht-horizontalen Basislinie mithilfe des Grundlinie Korrektur Algorithmus gegebenenfalls unter der gleichen Registerkarte bearbeiten/pre-Prozess Daten in Schritt 2.1.4.
   7. Durchschnittliche Wasser Spektren und kopieren Sie die Zeilen in einer n × m Matrix entspricht der Beispiel-Dataset und reduzieren sie auf 70 % Intensität mit 0,7 multipliziert.
      1. In der Software 1 dazu im Befehlsfenster Eingabe das folgende Skript "AverageWater=mean(WaterDataset)". Dann kopieren und Einfügen der Zeilen entsprechend dem Beispieldatensatz. Um die Intensität zu reduzieren, geben Sie "AverageWater70 = AverageWater * 0,70".
   8. Durschnittliche Spektren von jedem Probenspektrum abziehen.
      1. In der Software 1, tun dies im Befehlsfenster durch Eingabe des folgenden Skripts "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".
   9. Öffnen Sie die Registerkarte bearbeiten/pre-Prozess Daten um eine zweite abgeleitete Funktion anwenden und dann die Daten durch Auswahl der einzelnen normalen Variate (SNV) Funktion zu normalisieren und Center-Daten bedeuten.
      1. In der Software 1 tun dies in einem Rutsch. Wählen Sie zuerst "Derivat" und Eingabe 25 Punkte der Glättung, Polynomgrad 3 und abgeleitete Ordnung auf das Sample-set mit 25 Punkten der Glättung und eine Savitzky-Golay-Funktion. Wählen Sie dann "SNV" und "Meine Mitte". Klicken Sie auf "OK/übernehmen".
   10. Öffnen Sie die Registerkarte "Bearbeiten/pre-Prozess-Daten" und wählen Sie im "Spalte Variablen", 2.980 – 2.800/cm und 1.750 – 850/cm indem sichergestellt wird, dass nur ihre Kästchen angekreuzt sind.
2. Datenanalyse
   1. Principal Component Analysis (PCA)
      1. Klicken Sie auf "Analyse | Decomposition"und wählen Sie PKA.
         1. 1 Software klicken Sie auf "Modell zu bauen".
         2. In 2-Software die Eingabemethoden Sie PCA. Die optimale Anzahl der wichtigsten Komponenten (PCs) - in dieser Arbeit, 7 - Eingang und einem Maximum von 100 Iterationen und ausgewählte Kreuzvalidierung für die Validierungsmethode. Klicken Sie auf "Ausführen".
      2. Beobachten Sie die 95 % Vertrauensgrenze, die gestrichelte Ring, auf dem Punkte-Grundstück zwischen PC1 und PC2.
      3. Markieren Sie die Probe-Spektren mit Noten, die außerhalb der Grenze als potenzielle Ausreißer mit dem "wählen Sie Spectra-Tool" auftreten.
      4. Wenn die markierte Spektren haben schließen Hotellings T² Werte und hohe Q Residuen sie von der weiteren Analyse.
   2. Partial Least Squares Regression (PLS-R)
      1. Klicken Sie auf "Analyse | Regression"und wählen Sie"PLS-R".
         1. In Software 1, Y-Block rechts klicken und wählen Sie den Vektor "Parasitemia | Bauen Sie Modell".
         2. In 2-Software die Eingabemethoden Sie PLS-R. Wählen Sie den Vektor "Parasitemia" als "Y-Referenz" und die Beispiel-Dataset als "X Data Set" und wählen Sie Kreuzvalidierung als die Validierungsmethode. Klicken Sie auf "Ausführen".
      2. Analysieren Sie das Regressionsmodell. R² Werte über 0,80 und Root-Mean-Square-Fehler der Kreuzvalidierung (RMSECV) Werte, die kleiner als 0,1 % Parasitemia sind akzeptabel.
      3. Analysieren Sie den Vektor der Regression und identifizieren Sie die biologische Bands.

Ergebnisse

Partial Least Squares (PLS-R) plot und seiner damit verbundenen Regression Vektor, Abbildung 1a und 1 b bzw. zeigen, dass das Signal vom Parasiten unterscheidet die Erythrozyten, die sie verwendet werden können, bilden eine lineare Regression Modell für verwendet werden die Vorhersage des Parasiten in zukünftigen Datensätzen.

Eine robuste, lineare PLS-R-Modell wurde mit einem Be...

Diskussion

PLS-R-Modell ist eine betreute multivariate Methode, die findet eine lineare Beziehung, Y = bX + E, zwischen den prädiktiven Variablen X (hier: der Extinktion bei einzelnen Wellenzahl) und eine kontinuierliche Variable Y (hier: der Parasitemia-Ebene). Kurz gesagt, das Modell verbindet die Variablen X, um einen neuen Satz von latenten Variablen (LVs) erstellen, die die Varianz auf X korreliert mit Y zu erfassen, und einen Regression Vektor (b) berechnet, die ein neues Spektrum Ergebnisse bei der Schätzung der y-Wert mul...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Donor blood	-	-	Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood	Australian Red Cross`	-
3D7 Plasmodium falciparum	The Burnet Institute	-	Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	R6504
Albumax (Gibco)	Thermofisher	E003000PJ	Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Giemsa Stain	Sigma Aldrich	48900
Sorbitol	Sigma Aldrich	S1876	Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers)	Becton, Dickonson and Company	367671
Immersion Oil	Thermofisher	M3004
50 mL culture dishes	Falcon	353025
25mL pipette tips	Falcon	357515
10mL pipette tips	Falcon	357530
Microscope Slides	Sigma Aldrich	S8902
Centrifuge tubes 50 mL	Sigma Aldrich	T2318
Automated pipette controller	Integra-biosciences	155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge	Thermofisher	75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators	Thermofisher	310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope	Nikon Instruments	E100_2CE-MRTK-1	When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment	Bruker	9308-3700	Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab	Mathworks Inc		Multivariate data analysis software
The Unscrambler X	CAMO		Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox	Mathworks, Inc.		GUI for Matlab