Rilevazione e quantificazione del Plasmodium falciparum in acquoso globuli rossi da attenuato spettroscopia infrarossa totale riflessione e l'analisi multivariata dei dati

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per la rilevazione e la quantificazione del Plasmodium falciparum in acquosi globuli rossi infetti utilizzando un spettrometro a infrarossi riflessione totale attenuata e analisi multivariata dei dati.

Abstract

Dimostriamo un metodo di quantificazione e individuazione di parassiti in acquosa di globuli rossi (RBCs) utilizzando un semplice benchtop attenuato totale riflessione Fourier Transform spettrometro a infrarossi (ATR-FTIR) in combinazione con l'analisi multivariata dei dati ( MVDA). 3 7 p. falciparum sono stati coltivati a parassiti fase 10% parassitemia anello e utilizzato a picco i globuli rossi del donatore fresco isolato per creare una diluizione serie tra 0 – 1%. 10 µ l di ciascun campione sono stati collocati al centro della finestra di diamante ATR per acquisire lo spettro. I dati di esempio è stati trattati per migliorare il rapporto segnale-rumore e rimuovere il contributo di acqua, e quindi la derivata seconda è stata applicata per risolvere caratteristiche spettrali. I dati sono stati quindi analizzati utilizzando due tipi di MVDA: primo Principal Component Analysis (PCA) per determinare eventuali valori anomali e quindi regressione di minimi quadrati parziali (PLS-R) per compilare il modello di quantificazione.

Introduzione

La malaria è tra le più devastanti malattie del nostro tempo; oltre la metà della popolazione vive a rischio nelle regioni endemiche ed esso sproporzionatamente opprime il povero^1,2,3,4. Gran parte del problema è i portatori asintomatici e primi pazienti di stadio che fungono da serbatoi per zanzare vettori⁵, causando picchi di infezione durante stagioni umide e permettendogli di persistere nelle comunità. La malaria è causata da parassiti Plasmodium cinque, il più mortale di cui è p. falciparum che causa la forma più grave della malattia².

Attualmente, le tecniche per la diagnosi di malaria sono meno che perfetto. Microscopia ottica, il gold standard attuale, è in grado di rilevare solo 62-88 parassiti / µ l a seconda del metodo utilizzato⁶. Inoltre, a causa della intensità e alta abilità richiesto, in molte regioni microscopia mal diagnostica > 50% dei casi, soprattutto quelli con bassa parassitemia livelli², che possono essere direttamente attribuiti alla mancanza di risorse nella zona e risultati in l'uso improprio di farmaci anti-malarici. Gli altri 2 metodi diagnostici principali sono test diagnostici rapidi (RDT), che utilizzano gli anticorpi per la rilevazione e l'analisi di reazione a catena della polimerasi (PCR), che discriminano e quantificare i parassiti dal DNA. Attualmente, RDTs sono solo in grado di rilevare p. falciparum e p. vivax di almeno 100 parassiti / µ l di sangue con conseguente forme più rare della malattia non viene trattata. ^{7 , 8} al contrario, analisi di PCR discriminare e quantificare le diverse specie di Plasmodium ad una sensibilità di 0,0004-5 parassiti / µ l di sangue. Tuttavia, esso richiede costosi reagenti, equipaggiamento e abilità tecnica e pertanto non è adatto per l'applicazione del campo.

Una tecnica altamente sensibile, affidabile e conveniente è essenziale per migliorare i tempi di diagnosi e così migliorando i risultati pazienti e rendendo possibile l'eliminazione della malattia. Attenuato totale riflessione spettroscopia trasformata di Fourier (ATR-FTIR) offre una possibile soluzione a questo problema. Il lavoro precedente ha indicato che era possibile rilevare e quantificare da p. falciparum in metanolo fissata pellicole di anima raggiungendo i limiti di rilevazione di < 1 parassita / µ l di sangue (< 0,0002% parassitemia)⁹, che è paragonabile ai metodi PCR. Studi recenti hanno dimostrato che è possibile rilevare e quantificare i parassiti in campioni acquosi e quindi eliminare il punto di fissazione. Tuttavia, fattori come il vapore acqueo, rumore spettrale e trattamento dei dati devono essere presi in considerazione per un risultato ottimale¹⁰.

Questo protocollo si propone di mostrare nuovi utenti come acquisire spettri ATR-FTIR e preparare un modello di regressione per il rilevamento di p. falciparum da acquose di campioni di globuli rossi (RBC)¹⁰.

Protocollo

Consultare appropriato Material Safety Data Sheets (MSDS) e cercare la formazione adeguata di livello 2 di biosicurezza (BSL-2). Tutti i passaggi di coltura devono essere fatto in un cabinet di BSL-2 usando una tecnica asettica, il che significa che c'è un rischio di esposizione a radiazioni UV nocive da operazioni di decontaminazione, punture accidentali ed esposizione potenziale biologico e infezione se la cultura di parassita entra tutte le lesioni. Inoltre, è un potenziale rischio sangue stock da banche del sangue è solo proiettato per alcune malattie e il potenziale per la diffusione di malattie a carico del sangue. Cercare aiuto medico immediato nell'avvenimento della lesione.

1. preparazione e misurazione dei 3 7 serie di diluizioni del parassita Plasmodium falciparum

Nota: Plasmodium SP. cultura è altamente sensibile. Usare i reagenti freschi/scaduto e nutrire i parassiti regolarmente modificando il supporto. Nutrire le colture sotto 5% parassitemia ogni secondo giorno; nutrire le colture tra 6-10% parassitemia una o due volte al giorno; e nutrire le colture tra 11 – 20% fino a 4 volte al giorno. Parassiti che stanno cominciando a morire di fame si perdono la loro forma e inizia a contrarsi. In tal caso, mangimi e diluire immediatamente cambiando i media e aggiungendo brodo di RBCs. raccogliere il sangue del donatore in provette contenenti eparina come anticoagulante e misura entro le prime 6 ore.

1. Cultura un totale di 30 mL di 3 7 ceppo parassiti Plasmodium falciparum secondo il protocollo standard fino a quando la parassitemia raggiunge 10% anelli.
2. Sincronizzazione dei parassiti
   1. 11 h dopo shizogeny nel ciclo di vita del parassita, Risospendere la cultura e il trasferimento in una provetta conica 50 mL utilizzando una pipetta automatica.
   2. Centrifugare la coltura a 300-400 x g e a condizioni di laboratorio standard (25° C e 100 kPa) per 5 min.
   3. Eliminare il surnatante tramite elaborazione dello stesso con una pipetta o usando una pipetta di Pasteur attaccata ad un vuoto senza disturbare il pellet. Gettare il terreno dei rifiuti in una soluzione di candeggina al 10%.
   4. Lentamente aggiungere 12 – 15 mL di soluzione al 4% sorbitolo al pellet utilizzando una pipetta automatica e mescolare la cultura tappatura ed invertendo il tubo fino a quando la cultura è omogenea.
   5. Incubare la coltura a 37 ° C per 15 min.
   6. Centrifugare la coltura a 300-400 x g e le condizioni standard di laboratorio per 5 min.
   7. Rimuovere il surnatante come descritto al punto 1.2.3.
   8. Aggiungere 10 – 15 mL di soluzione fisiologica 0,9% al pellet e miscelare la soluzione di tappatura e invertendo il tubo fino a quando la cultura è omogenea.
   9. Ripetere i passaggi 1.2.6–1.2.8 altre due volte per lavare tutti i resti di sorbitolo.
3. Preparazione della parassitemia diluizione serie
   1. Lavare Stock in RBCs come in passaggi 1.2.6–1.2.9.
   2. Centrifugare la coltura in condizioni standard di laboratorio, Stock in RBCs a 300-400 x g per 5 min ed eliminare il surnatante come descritto al punto 1.2.3.
   3. Etichetta per microcentrifuga come 0%, 0.010%, 0,025%, 0,075%, 0,100%, 0.250%, 0.750% e 1.000% e aggiungere 0 µ l, 1 µ l, 2,5 µ l, 7,5 µ l, 10 µ l, 25 µ l, 75 µ l e 100 µ l di cultura rispettivamente usando una pipetta di 0,2-20 µ l.
   4. Aggiungere 100 µ l, µ l 99, 97,5 µ l, µ l 92,5, 80 µ l, 75 µ l, 0 e 25 µ l di Stock in RBCs al tubi etichettati 0%, 0.010%, 0,025%, 0,075%, 0,100%, 0.250%, 0.750% e 1.000%, rispettivamente.
   5. Centrifugare il sangue del donatore freschi raccolto in provette dell'anticoagulante a 1.200 x g e condizioni standard di laboratorio per 10 min.
   6. Rimuovere il plasma di elaborazione dello stesso con una pipetta e scartando come descritto al punto 1.2.3.
   7. Aggiungere 900 µ l di RBCs isolato in ciascuna provetta per microcentrifuga e miscelare accuratamente capovolgendo 10x.
4. Acquisizione spettrale
   1. Utilizzando il programma di acquisizione spettrale accompagnamento, fare clic su "Strumento set-up" e impostare i parametri di raccolta di dati seguenti: 128 scansioni per sfondo; 32 scansioni per il campione; e risoluzione a 8/cm sopra la gamma di frequenza di campionamento massima dello strumento.
   2. Impostare la temperatura dello spettrometro FTIR-ATR per la raccomandazione del produttore o durante la notte.
   3. Pulire il cristallo di strofinare delicatamente con un movimento circolare utilizzando lanugine gratis salviette inumidito con acqua ultrapura. Quindi asciugare con un altro panno libero wipe.
   4. Prendere una misura di sfondo dell'aria facendo clic su "Sfondo misura". Ogni 20 min, pulire il cristallo come descritto al punto 1.4.3 e ripetere la misurazione.
   5. Aprire la visualizzazione live facendo clic su "Anteprima". Osservare una linea di base piana, orizzontale che indica che il cristallo sia pulito.
   6. Pipettare 10 µ l di acqua deionizzata direttamente sul mezzo del cristallo e fare clic su "Esempio di misura". Ripetere questa misurazione di acqua dopo ogni campione quinto.
   7. Asciugare il cristallo usando un panno libero wipe e un delicato movimento circolare.
   8. Pipettare 10 µ l di campione e fare clic su "Esempio di misura".
   9. Pulire il cristallo tra i campioni come descritto al punto 1.4.3.
   10. Ripetere fino a 3 replicati vengono acquisiti, assicurandosi di randomizzare l'ordine di entrambi i campioni e le repliche.

2. multivariata analisi (MVDA)

Nota: Trattamento dei dati deve essere fatto sopra l'intero set di dati al fine di evitare il rumore e l'aggiunta di cime di origine non biologica. Al contrario, analizzare sopra le regioni biologicamente rilevanti: 2980-2800/cm e 1750-850/cm.

1. Trattamento dei dati
   Nota: Due software, ad esempio, Matlab (d'ora in poi denominati software 1) e il riordinatore X (d'ora in poi denominati software 2) sono utilizzati come esempi per MVDA. Software 1 ha la capacità di eseguire MVDA senza l'aggiunta di un'interfaccia utente grafica (GUI). Tuttavia, è consigliabile acquistare una GUI (Tabella materiali). Le seguenti istruzioni quando riferendosi al software 1 presupporrà che è in congiunzione con il toolbox di GUI disponibile in commercio, e lo script di trattamento di dati di esempio è stato allegato.
   1. Aprire il software di analisi di dati multivariati appropriato, fare clic su "Importa dati" e selezionare il tipo di file per l'analisi.
      1. Nel software 1, ingresso "Analisi" nella finestra di comando per aprire l'interfaccia grafica. Fare clic destro la X box per trovare "Importa dati".
      2. Nel software 2, fare clic sulla scheda "File" per trovare "Importazione".
   2. Importare gli spettri del campione, acqua e linea di base come insiemi di dati nello spazio di lavoro selezionando tutti gli spettri in ogni set separatamente e facendo clic su "Apri" e dare ogni set un nome breve, ad esempio, 'wat' per set di dati di spettri di acqua.
   3. Selezionare nuova tabella o matrice facendo clic su "nuovo Matrix/Vector" e generare un vettore di n × 1, dove n è il numero di campioni. La parassitemia di ogni campione di input e dare il vettore il nome 'Parassitemia'.
      1. Nel software 1, fare clic su "Nuova variabile" nella finestra di comando.
      2. Nel software 2, fare clic sull'icona "Nuova matrice".
   4. Tracciare i dati facendo clic su "Stampa dati icona". Ispezionare gli spettri per gli effetti del vapore acqueo facendo clic su "Zoom" e zoomando su 1800-1400/cm; più chiaramente osservato come breve, tagliente, stretti picchi lungo le pendici del ammide io e ammide Band II.
   5. In casi di estrema vapor d'acqua, aprire la scheda Modifica/pre-process dati e selezionare "Smoothing". Ridurre il rumore e/o contributi di forte vapore acqueo lisciando gli spettri del campione e acqua utilizzando fino a 25 punti di lisciatura o utilizzare un metodo di correzione di vapore acqueo.
   6. Corretta rispetto al basale non orizzontali utilizzando l'algoritmo di correzione della linea di base, se del caso, la stessa scheda di dati di modifica/pre-process nel passaggio 2.1.4.
   7. Media acqua spettri e copiare le righe in una matrice di n × m equivalente al set di dati campione e ridurlo al 70% intensità moltiplicandolo per 0,7.
      1. Nel software 1, farlo nella finestra di comando inserendo il seguente script "AverageWater=mean(WaterDataset)". Quindi copiare e incollare le righe per corrispondere al set di dati di esempio. Per ridurre l'intensità, di input "AverageWater70 = AverageWater * 0.70".
   8. Sottrarre acqua medio spettri da ogni spettro campione.
      1. Nel software 1, farlo nella finestra di comando inserendo il seguente script "WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70".
   9. Aprire la scheda Modifica/pre-process dati per applicare una seconda funzione derivative e quindi normalizzare i dati selezionando la funzione di singola variabile normale (SNV) e significa centro dati.
      1. Nel software 1, è possibile farlo in una sola volta. In primo luogo selezionare "Derivato" e ingresso 25 punti di lisciatura, ordine polinomiale di 3 e derivati ordine sul campione impostato utilizzando una funzione Savitzky Golay e 25 punti di lisciatura. Quindi selezionare "SNV" e "Media Center". Fare clic su "OK/applicare".
   10. Aprire la scheda di dati di modifica/pre-process e nella colonna "variabili", selezionare 2.980 – 2.800/cm e 1.750 – 850/cm assicurandosi che siano selezionate solo le caselle.
2. Analisi dei dati
   1. Analisi delle componenti principali (PCA)
      1. Fare clic su "analisi | Decomposizione"e seleziona PCA.
         1. Nel software 1, cliccare su "Build Model".
         2. Nel software 2, il PCA metodi di input. Immettere il numero ottimo di componenti principali (PC) - in questo lavoro, 7 - e un massimo di 100 iterazioni e seleziona Convalida incrociata per il metodo di convalida. Fare clic su "Esegui".
      2. Osservare il limite di confidenza del 95%, l'anello tratteggiata, la trama di punteggi tra PC1 e PC2.
      3. Contrassegnare gli spettri del campione con i punteggi che si verificano di fuori del limite come potenziali outlier utilizzando lo "strumento di spettri seleziona".
      4. Se gli spettri contrassegnati hanno alti valori di² Hotellings T e alta Q residui escludono da ulteriori analisi.
   2. Regressione di minimi quadrati parziali (PLS-R)
      1. Fare clic su "analisi | Regressione"e selezionare"PLS-R".
         1. Nel software 1, fare clic destro Y blocco e selezionare il vettore "parassitemia | Costruire il modello".
         2. Nel software 2, i PLS-R metodi di input. Selezionare il vettore "Parassitemia" come il "riferimento Y" e il set di dati del campione come "insieme di dati X" e seleziona Convalida incrociata come il metodo di convalida. Fare clic su "Esegui".
      2. Analizzare il modello di regressione. R² valori sopra 0,80 ed errore quadratico medio dei valori di cross-validazione (RMSECV) che sono meno di 0.1% parassitemia sono modelli accettabili.
      3. Il vettore di regressione di analizzare e individuare le bande biologiche.

Risultati

Trama di minimi quadrati parziali (PLS-R) e un vettore di regressione associato, Figura 1a e 1b rispettivamente, mostrano che il segnale da parassiti sono abbastanza distinta da globuli rossi che servono per formare una regressione lineare modello da utilizzare per la previsione dei parassiti in insiemi di dati futuri.

Un robusto modello lineare PLS-R è stato generato con un valore...

Discussione

Modello: PLS-R è un metodo multivariato supervisione che trova una relazione lineare, Y = bX + E, tra le variabili predittive X (qui, l'assorbanza a ciascun numero d'onda) e un continuo variabile Y (qui, il livello di parassitemia). In breve, il modello combina le variabili in X per creare un nuovo insieme di variabili latenti (LVs) che catturano la varianza su X correlato con Y e calcola un vettore di regressione (b) che moltiplicato per un nuovo risultati di spettro nella stima del valore y. La forza del modello può ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Donor blood	-	-	Must be collected by a trained medical practitioner
Stock blood	Australian Red Cross`	-
3D7 Plasmodium falciparum	The Burnet Institute	-	Laboratory strain wild type equivalent
RPMI-1640 media with L-hepes without Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	R6504
Albumax (Gibco)	Thermofisher	E003000PJ	Aliquot into 50 mL falcon tubes and store in freezer
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Giemsa Stain	Sigma Aldrich	48900
Sorbitol	Sigma Aldrich	S1876	Must be filtered before use in culture
Blood collection tubes (Vacutainers)	Becton, Dickonson and Company	367671
Immersion Oil	Thermofisher	M3004
50 mL culture dishes	Falcon	353025
25mL pipette tips	Falcon	357515
10mL pipette tips	Falcon	357530
Microscope Slides	Sigma Aldrich	S8902
Centrifuge tubes 50 mL	Sigma Aldrich	T2318
Automated pipette controller	Integra-biosciences	155 015
Sorvall Legend X1R Centrifuge	Thermofisher	75004260
Forma™ 310 Direct Heat CO2 Incubators	Thermofisher	310TS
Nikon Eclipse E-100 Binocular Microscope	Nikon Instruments	E100_2CE-MRTK-1	When purchasing ensure that the 100x lens is an oil immersion lens
Bruker Alpha Ft-IR Spectrometer with ATR Quick Snap Attachment	Bruker	9308-3700	Be sure to request "Eco-ATR" attachment when purchasing
Matlab	Mathworks Inc		Multivariate data analysis software
The Unscrambler X	CAMO		Multivariate data analysis software
PLS-Toolbox	Mathworks, Inc.		GUI for Matlab