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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Mitochondrien enthalten mehrere Flavin-abhängige Enzyme, die reaktive Sauerstoffspezies (ROS) produzieren kann. Überwachung von ROS ist Freigabe von einzelnen Standorten in den Mitochondrien schwierig wegen unerwünschten Nebenreaktionen. Wir präsentieren Ihnen eine einfache, kostengünstige Methode zur direkten Beurteilung der native Preise für ROS Release mit gereinigtem Flavoenzymes und Mikrotestplatte Fluorometry.

Zusammenfassung

Es wurde berichtet, dass Mitochondrien können bis zu 12 enzymatische Quellen von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) enthalten. Ein Großteil dieser Seiten gehören Flavin-abhängige Atemwege komplexe und Dehydrogenases, die eine Mischung aus Superoxid (O2● -) und Wasserstoffperoxid (H2O2) zu produzieren. Genaue Quantifizierung der ROS-Produktion Potenzial der einzelnen Standorte in isolierten Mitochondrien kann aufgrund des Vorhandenseins von antioxidativen Verteidigungssysteme und Nebenreaktionen, die auch O2●-/ h2O2bilden schwierig sein. Verwendung von unspezifische Inhibitoren, die mitochondriale Bioenergetik stören können kann auch Messungen beeinträchtigen, durch ROS Freisetzung von anderen Websites der Produktion ändern. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode für die gleichzeitige Messung von H2O2 -Version und Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide (NADH) Produktion von gereinigtem Flavin verbunden Dehydrogenases. Für unsere Zwecke hier haben wir gereinigten Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDHC) und α-Ketoglutarate Dehydrogenase Komplex (KGDHC) Schweine Herz Ursprungs als Beispiele verwendet. Diese Methode ermöglicht eine genaue Messung der native H2O2 Freisetzungsraten von einzelnen Standorten der Produktion durch den Wegfall von anderen potenziellen Quellen von ROS und antioxidativen Systeme. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode für einen direkten Vergleich des Verhältnisses zwischen H2O2 -Version und Enzym-Aktivität und die Prüfung der Wirksamkeit und Selektivität von Inhibitoren für ROS-Produktion. Alles in allem kann dieser Ansatz für die eingehende Beurteilung der native Raten von ROS Freigabe für einzelne Enzyme vor komplexere Experimente mit isolierten Mitochondrien oder permeabilized Muskelfaser ermöglichen.

Einleitung

Das ultimative Ziel der Nährstoff Stoffwechsel ist Adenosintriphosphat (ATP) zu machen. In Säugerzellen geschieht dies in den Mitochondrien, Doppel-membraned Organellen, die in Kohlenstoff in ATP gespeicherte Energie umwandeln. Die ATP-Produktion beginnt, wenn Kohlenstoff verbrannt von Mitochondrien bilden zwei Elektronen Träger, NADH und Flavin-Adenin-Dinucleotide (FADH2)1ist. NADH und FADH2 werden dann oxidiert durch Multi-Untereinheit Atemwege komplexe I und II, beziehungsweise, und die freigesetzten Elektronen werden auf das terminal Elektron Akzeptor molekularer Sauerstoff (O2) am Komplex IV1befördert. Die thermodynamisch günstigen "bergab" Übertragung von Elektronen auf O2 am Ende der Kette ist gekoppelt an den Export von Protonen in den Intermembrane Raum von komplexen I, III und IV. Dies schafft einen transmembranen elektrochemischen Gradienten von Protonen (Proton Motive Force), eine temporäre Form der freien Enthalpie von komplexen V zu ATP2getippt wird. Electron Transferreaktionen in den Mitochondrien sind nicht perfekt, ATP Produktion gekoppelt. An verschiedenen Punkten in der Krebs-Zyklus und die Atmungskette können Elektronen vorzeitig mit O2 Formular ROS3interagieren. O2●- und H2O2sind die biologisch relevanten ROS von Mitochondrien erzeugt. O2● - oft der proximalen ROS von Mitochondrien gebildet gilt, ist es jetzt offensichtlich, dass Produktionsstätten eine Mischung aus O2●- und H2O2 bilden, das ist verbunden mit dem kostenlosen radikale Chemie der Flavin prothetische Gruppen4,5. Auf einem hohen Niveau kann ROS gefährlich sein, biologische Bestandteile, die notwendig für die Zellfunktion durch oxidativen Stress6zu beschädigen. Allerdings in geringen Mengen erfüllen mitochondrialen ROS Signalisierung Vitalfunktionen. Zum Beispiel hat H2O2 -Version von Mitochondrien verwickelt, bei der Kontrolle der T-Zellaktivierung, Stress-Signalisierung (z.B. Induktion von Nrf2 Signalwege), die Induktion der Zell-Proliferation und Differenzierung, Insulin-Signal und Freigabe und Fütterung Verhalten7. Erhebliche Fortschritte im Verständnis der Signalisierung Funktion von ROS. Jedoch wichtige Fragen bleiben in Bezug auf die Enzyme in den Mitochondrien als die wichtigsten Quellen und dienen wie Produktion gesteuert wird.

ROS-Freigabe durch einen Aufstellungsort der Produktion hängt von mehreren Faktoren ab: (1) die Konzentration der Elektronen zu Spenden vor Ort, (2) die Redox-Status der Elektron Spenden Site, (3) Zugang zu Sauerstoff, und (4) die Konzentration und Art der Oxidation Substrat3, 8 , 9. in den Mitochondrien, andere Faktoren wie die Konzentration von NADH und Membran mögliche Stärke beeinflussen auch ROS Produktion8,10. Zum Beispiel erhöht die Rate der O2●-/ h2O2 Produktion von gereinigtem PDHC oder KGDHC mit zunehmender NADH Verfügbarkeit5,11. In diesem Szenario sind Elektronen von NADH zu FAD-Center in der E-3 -Untereinheit des PDHC oder KGDHC, der Website für O2● // h2O2 Produktion12rückwärts fließt. In ähnlicher Weise hat die Bereitstellung von NAD+ den gegenteiligen Effekt, abnehmender ROS Release von KGDHC12. So kann steuernde Eingang oder den Ausgang der Elektronen von ROS Produktionsstätten verändern wie viel O2●-/ h2O2 gebildet wird. Zum Beispiel blockiert der E-2 -Untereinheit PDHC oder KGDHC mit CPI-613, ein Liponsäure analog, Ergebnisse in fast 90 % O2●-/ h2O2 Produktion13verringern. Ähnliche Ergebnisse können mit chemischen S-Glutathionylation Katalysatoren, Diamide und Disulfiram, O2●-/ h2O2 Produktion von PDHC oder KGDHC über die Konjugation von Glutathion nach E fast abschaffen 2 -Untereinheit14. Der Nachteil für die Sperrung der Elektronenfluss durch die E-2 -Untereinheit des PDHC und KGDHC ist eine Abnahme der NADH-Produktion die ROS-Bildung durch den Elektronentransport-Kette (z.B.komplexe III) vermindert. Dies kann auch ATP Ausgabe durch den Elektronentransport-Kette verringern. Insgesamt kann blockieren Elektron Eintritt in ROS Produktionsstätten ein hochwirksames Mittel zur Produktionskontrolle O2●-/ h2O2 sein.

Mitochondrien können bis zu 12 mögliche O2●-/ h2O2 Quellen6enthalten. Die meisten dieser Seiten sind Flavin-haltige Enzyme, die eine Mischung aus O2●- und H2O2zu generieren. Verwendung von verschiedenen Substrat und Inhibitor Kombinationen konnten für die Identifizierung von denen Atemwege komplexe und mitochondriale Dehydrogenases dienen alshoher Kapazität O2●-/ h2O2 Standorte in Bildung verschiedenen Geweben3. PDHC und KGDHC haben gezeigt, als hoher Kapazität O2●-/ h2O2 emittierenden Websites in Muskeln und Leber Mitochondrien13,15dienen. Jedoch bleiben einige Schwierigkeiten in Bezug auf die Prüfung der O2●-/ h2O2 bilden einzelner Websites in Mitochondrien und die Auswirkungen, die verschiedenen Substrat und Inhibitor Kombinationen auf potenzielle die Aktivitäten der Enzyme. Dies ist aufgrund des Vorhandenseins von unerwünschten Nebenreaktionen (z.B. Bildung von O2●-/ h2O2 von Websites außer das Enzym von Interesse), verunreinigen endogenen Nährstoffe (z. B.Fettsäuren Säuren) oder Organellen (z. B., Peroxisomen bilden auch O2●-/ h2O2), und Gebrauch von Inhibitoren, die Selektivität fehlt und/oder Nutzung von Verbindungen, die nicht vollständig ROS Produktion hemmen. Bestimmte Inhibitoren können auch verändern die mitochondriale Bioenergetik und Richtung der Elektronenfluss, und dies ändert ROS Freisetzung von anderen Websites der Produktion und verwirrt Ergebnisse. Absolute Preise für O2●-/ h2O2 -Version von einzelnen Standorten in den Mitochondrien sind auch schwer zu quantifizieren, aufgrund der hohen Konzentration von O2●- und H2O2 Beseitigung von Enzymen in der Matrix und Intermembrane Raum. Beseitigung konkurrierende Reaktionen, die mit O2●-/ h2O2 Release Messungen stören können kann daher sinnvoll sein, beim Identifizieren von hoher Kapazität O2●-/ h2O 2 Seiten bilden.

Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Methode, die für die gleichzeitige Prüfung der O2●-/ h2O2 Produktions- und NADH Bildung von gereinigten Flavin-abhängige Dehydrogenases ermöglicht. Durch die Verwendung gereinigter Enzyme, können unerwünschte Nebenreaktionen bilden ROS und ROS entwürdigende Enzyme ermöglicht ein genaueres Maß der nativen O2●-/ h2O2 Produktionsraten für individuelle Flavoenzymes eliminiert. Diese Methode kann verwendet werden, die O2●-/ h2O2 bilden Kapazität der verschiedenen gereinigte Dehydrogenases oder Bildschirm potenzielle ortsspezifische Inhibitoren für O2●-/ h2O direkt vergleichen 2 -Version. Schließlich können gleichzeitige Messung von O2●-/ h2O2 und NADH Produktion für eine Echtzeit-Bewertung des Verhältnisses zwischen Enzymaktivität und ROS Freisetzung Kapazität.

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Protokoll

(1) Chemikalien und gereinigten Enzyme

  1. Die folgenden Materialien beziehen: PDHC und KGDHC der Schweine Herz Herkunft (oder eine andere gereinigte mitochondriale Flavoenzyme); H2O2 (30 % ige Lösung), Pyruvat, α-Ketoglutarate NAD+, NADH, CoASH, Thiamin-Pyrophosphat (TPP), Mannit, HEPES, Saccharose, EGTA, 3-Methyl-2-Oxo-Valeric-Säure (KMV), Superoxid-Dismutase (SOD), Meerrettich-Peroxidase (HRP), 10-Acetyl-3,7-Dihydroxyphenoxazine Reagenz (AUR), und CPI-613.

2. Planung der Probe und Reagenz Vorbereitung

  1. Richten Sie die Probe gemäß Tabelle 1 in eine 96-Well-Platte.
    Hinweis: Das Gesamtvolumen für jede Reaktion ist 200 µL. Lager-Konzentrationen sind so eingestellt, dass 20 µL des Reagenz hinzugefügt wird in jede Vertiefung. Dies sorgt für schnelle Zugabe von Cofaktoren und Substrate zu jeder Reaktion gut vor Beginn des Tests.
  2. Bereiten Sie Reaktion Puffer mit 220 mM Mannit, 70 mM Saccharose, EGTA 1 mM und 20 mM HEPES (pH 7.4 mit HCl).
    Hinweis: Dies könnte abhängig von den physikalischen Eigenschaften der verschiedenen gereinigten Enzyme ändern.
  3. Untersuchen Sie die gereinigten KGDHC oder PDHC für Kontamination mit Enzym-Aktivität Assays14,16,17 oder Immunoblot oder Coomassie Fleck5.
  4. Bereiten Sie alle Reagenzien im Puffer Reaktion nach der Arbeit Lösungskonzentrationen in Tabelle 1.
  5. Speichern Sie alle Reagenzien als 1 mL Aliquote bei-20 ° C. Speichern Sie Pyruvat und α-Ketoglutarate bei-80 ° C in 100 µL Aliquots, spontane Degradation durch Auto-Oxidation und wiederholte Frost-Tau-Wechseln zu verhindern.
  6. Bereiten Sie das AUR-Reagenz Meister Lager in 1 mL DMSO und dann bis 100 µM in Reaktion Puffer verdünnen. Vor Licht geschützt lagern.
    Hinweis: Hier ist die 100 µM Arbeitslösung aus frisch alle 2 bis 3 Wochen und vor Licht geschützt werden.

3. Einrichten der Assay-Vorlage

  1. Richten Sie das Testverfahren auf eine monochromatische Mikrotestplatte Leser mit dual Messmöglichkeiten.
  2. Definieren Sie die Lesung durch Auswahl von "Protokoll". Klicken Sie dann auf "Verfahren".
  3. Stellen Sie "Temperatur" auf 25 ° C (Abb. 1A).
  4. Klicken Sie auf "Kinetische starten", um lesen Sie Bedingungen (Abbildung 1A). Legen Sie die Zeit und lesen Sie Intervalle/Experimente.
  5. Klicken Sie auf "lesen" (Abbildung 1 b).
    Hinweis: Proben werden gelesen von Spitzenposition mit einem Gewinn von 50. Zeit: 5 min, 30-s Abständen zu lesen. Kanal 1: Resorufin Fluoreszenz - Anregung/Emission = 565 Nm:600 nm Wellenlänge Breite von 13,5 nm. Kanal 2: NADH Autofluoreszenz - Erregung/Emission = 376 Nm:450 nm Wellenlänge Breite von 20 nm.
  6. Wählen Sie unter "READ" Brunnen zu überwachen (z.B.A1-A4 und B1-B4).
  7. Wählen Sie "Ende kinetische".

4. Standardkurven

  1. Die Reagenzien Auftauen und speichern auf Eis, bis benötigt.
  2. NADH Standardkurve (Abbildung 2A)
    1. Bereiten Sie die funktionierende Lösungen für NADH im Konzentrationsbereich von 0,5-10 mM in Reaktion Puffer.
    2. Fügen Sie 20 µL-Aliquots von jedem NADH Lösungskonzentration in Vertiefungen mit 180 µL Reaktion Puffer arbeiten. Die Endkonzentration von NADH in jedem gut ist 0,05-1 mM.
    3. Klicken Sie auf "Lesen" und Erregung/Emission = 376 Nm:450 nm Wellenlänge Breite von 20 nm.
      Hinweis: Dies ist ein Endpunkt nur-Lese - kinetische Parameter sind nicht erforderlich.
  3. AUR Standardkurve (Abb. 2 b)
    1. Bereiten Sie die Arbeiten Bestände von Wasserstoffperoxid in Reaktion Puffer; Lager-Konzentrationen reichen von 200-4.000 nM.
    2. Jedes gut 120 µL des Puffers Reaktion hinzufügen.
    3. Fügen Sie 20 µL HRP (arbeiten Lager Konzentration = 30 U/mL, Endkonzentration im Brunnen = 3 U/mL), 20 µL der SOD (arbeiten Lager Konzentration = 250 U/mL, Endkonzentration im Brunnen = 25 U/mL), und 20 µL AUR (arbeiten Lager Konzentration = 100 µM Endkonzentration im Brunnen = 10 µM) auf jeder gut mit Reaktion-Puffer.
    4. Fügen Sie 20 µL jeder H2O2 arbeiten Vorratslösung zu jeweils gut Puffer und Assay Reagenzien. Das endgültige Reaktionsvolumen ist 200 µL und die Endkonzentration von H2O2 in jede Vertiefung 20-400 nM.
    5. Inkubieren Sie die Platten für 1 min in der Platte Leser bei 25 ° c
    6. Klicken Sie auf "Lesen" und Erregung/Emission = 565 nm/600 nm Wellenlänge Breite von 13,5 nm. Beachten Sie, dass dies ein Endpunkt nur-Lese - kinetische Parameter nicht erforderlich sind.

5. Messung von O2●- / h2 O2 Release und NADH-Herstellung von KGDHC und PDHC

  1. Siehe Tabelle 1 für die Reihenfolge der Zugabe von verschiedenen Reagenzien, die Konzentration von jedem Arbeitslösung und die Lautstärke der einzelnen hinzugefügt gut.
  2. Jedes gut 40 µL Puffer Reaktion hinzufügen. Fügen Sie für Assays mit KMV oder CPI-613 20 µL Puffer in jede Vertiefung.
  3. Fügen Sie 20 µL PDHC oder KGDHC (arbeiten Lager von 1 U/mL, Endkonzentration pro Bohrloch = 0,1 U/mL) in jede Vertiefung.
  4. Inkubieren Sie PDHC und KGDHC bei 25 ° C für 2 min.
  5. Fügen Sie 20 µL des KMV (arbeiten Lager = 100 mM, Endkonzentration = 10 mM) oder 20 µL der CPI-613 (arbeiten Lager Konzentration = 1,5 mM, Endkonzentration = 150 µM) (Tabelle 2).
    Hinweis: Dieser Schritt kann ausgeschlossen werden, wenn nicht die Assays Inhibitoren eingesetzt werden.
  6. 1 min bei 25 ° c inkubieren
    Hinweis: Dieser Schritt kann ausgeschlossen werden, wenn nicht die Assays Inhibitoren eingesetzt werden.
  7. Fügen Sie 20 µL HRP (arbeiten Lager Konzentration = 30 Einheiten/mL, Endkonzentration im Brunnen = 3 Einheiten/mL) und 20 µL der SOD (arbeiten Lager Konzentration = 250 Einheiten/mL, Endkonzentration im Brunnen = 25 Einheiten/mL) in jede Vertiefung.
  8. Fügen Sie 20 µL des Coenzym A (arbeiten Lager Konzentration = 1 mM Endkonzentration = 0,1 mM), 20 µL TPP (arbeiten Lager Konzentration = 3 mM, Endkonzentration = 0,3 mM), und 20 µL NAD+ (arbeiten Lager Konzentration = 10 mM, Endkonzentration = 1 mM) zu jedem w Ell.
  9. AUR-Reagenz vom schützenden Alufolie abdecken und fügen Sie 20 µL in jede Vertiefung.
  10. Fügen Sie 20 µL Pyruvat (Lager Konzentration reicht von 1-100 mM, Endkonzentration für Assays arbeiten = 0,1-10 mM), Brunnen, PDHC und α-Ketoglutarate enthält (arbeiten Lager Konzentration reicht von 1-100 mM, Endkonzentration für Assays = 0,1-10 mM), Brunnen mit KGDHC.
  11. Klicken Sie auf "Lesen" um kinetische Messung zu starten.

(6) Datenanalyse

  1. Halten Sie die "Strg" Taste auf der Tastatur gedrückt und klicken Sie auf Brunnen um ein Diagramm enthält alle kinetische Messungen entsprechend Kanal 1 (Abbildung 3A) zu generieren.
  2. Klicken Sie auf "Daten" in das Symbol "anzeigen" in der oberen rechten Ecke für Rohwerte für relative Fluoreszenz Einheiten (RFU) zu den verschiedenen Zeitpunkten (Abb. 3 b) gemessen.
  3. Exportieren Sie die Werte für die Analyse (Tabelle 3).
  4. Klicken Sie "Graph" Dropdown-Menü oben rechts (Abb. 3 b) für RFU Werte der Fluoreszenz-Kanal 2 zugeordnet.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 6.1 bis 6.3 für Kanal 2.

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Ergebnisse

Abbildung 3A bietet eine repräsentative Spur für das RFU während der gleichzeitigen Messung von H2O2 und NADH Produktion von gereinigten KGDHC gesammelt. Die RFU-Rohdaten für jedes Zeitintervall ist in Abbildung 3 bdargestellt. Die RFU Rohdaten werden dann zur Analyse exportiert. Durch Extrapolation aus standard Kurven in Abbildung 2dargestellt, kann die absolute Menge an NA...

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Diskussion

Dieses Protokoll ist vorteilhaft da, (1) Es beseitigt alle konkurrierenden Reaktionen, die sonst mit H2O2 Nachweis (z.B., Antioxidans oder anderen Quellen von ROS), 2 stören können) bietet eine direkte Bewertung der einheimischen Rate ROS zu lösen, indem eine Flavin-haltigen mitochondriale Dehydrogenase, 3) erlaubt den Vergleich der einheimischen ROS veröffentlichen Preise von zwei oder mehr gereinigt Flavin-basierte Dehydrogenases, 4) ermöglichen einen direkten Vergleich der Rate der ...

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Offenlegungen

Es gibt nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von naturwissenschaftlich-technischen Forschung Rat von Kanada (NSERC) finanziert. Video-Produktion erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Zentrum für Innovation in Lehre und lernen (CITL) an der Memorial University of Newfoundland.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Pyruvate dehydrogenase complexSIGMAP7032-10UNpurified flavoenzyme
alpha-ketoglutarate dehydrogenase complexSIGMAK1502-20UNpurified flavoenzyme
30% hydrogen peroxide solutionSIGMAHX0640-5reagent, standard curves
NAD+SIGMAN0632-1Greagent, activity/ROS release assay
NADHSIGMAN4505-100MGreagent, standard curves
pyruvateSIGMAP2256-5Greagent, activity/ROS release assay
alpha-ketoglutarateSIGMA75892-25Greagent, activity/ROS release assay
CoASHSIGMAC3019-25MGreagent, activity/ROS release assay
thiamine pyrophosphateSIGMAC8754-1Greagent, activity/ROS release assay
mannitolSIGMAM4125-100Gbuffer component
HepesSIGMAH3375-25Gbuffer component
sucroseSIGMAS7903-250Gbuffer component
EGTASIGMAE3889-10Gbuffer component
KMVSIGMA198978-5Greagent, ROS release inhibitor
CPI-613Santa Cruzsc-482709reagent, ROS release inhibitor
SODSIGMAS9697-15KUreagent, ROS release detection
horseradish peroxidaseSIGMAP8375-1KUreagent, ROS release detection
Amplex Ultra RedThermofisherA36006reagent, ROS release detection
Biotech Synergy 2 microplate readerBioTek Instrumentsmicroplate reader for assays
Gen5 softwareBioTek Instrumentssoftware, used for collection of raw RFU
Graphpad PrismGraphpad softwaresoftware, data analysis
Microsoft EXCELMicrosoftsoftware, data analysis

Referenzen

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