Medição simultânea de peróxido de hidrogénio superóxido e produção de NADH por desidrogenases mitocondriais contendo Flavin

Resumo

As mitocôndrias contêm várias enzimas dependentes de flavina que podem produzir espécies reativas de oxigênio (ROS). Liberação de sites individuais nas mitocôndrias monitoramento ROS é um desafio devido às reações colaterais indesejados. Apresentamos um método fácil e barato para avaliação direta do nativas taxas para liberação ROS usando flavoenzymes purificado e microplacas fluorometry.

Resumo

Tem sido relatado que a mitocôndria pode conter até 12 fontes enzimáticas de espécies reativas de oxigênio (ROS). A maioria desses sites incluem complexos respiratórios flavin-dependente e desidrogenases que produzem uma mistura de superóxido (O₂^{● -}) e peróxido de hidrogênio (H₂O₂). Pode ser um desafio devido à presença de sistemas de defesa antioxidante e reações colaterais que também formam O₂^●-/ h₂O₂quantificação exata do potencial produção de ROS de sites individuais em mitocôndrias isoladas. Uso de inibidores inespecíficos que podem interromper a bioenergética mitocondrial também pode comprometer as medições alterando ROS lançamento de outros sites de produção. Aqui, apresentamos um método fácil para a medição simultânea de dinucleótido de nicotinamida e adenina (NADH) produção e lançamento de H₂O₂ por desidrogenases purificadas flavin-lig. Para este efeito, utilizámos purificada piruvato desidrogenase complexo (PDHC) e α-cetoglutarato desidrogenase complexo (KGDHC) de origem suína coração como exemplos. Este método permite uma medida exata de taxas lançamento₂ de₂O de H de nativos por sites individuais de produção, eliminando outras fontes potenciais de sistemas ROS e antioxidante. Além disso, este método permite uma comparação direta da relação entre a versão de₂ H₂O e atividade enzimática e o rastreio da eficácia e seletividade de inibidores para a produção de ROS. Em geral, esta abordagem pode permitir a avaliação aprofundada das taxas nativas de introdução ROS em enzimas individuais antes de conduzir experiências mais sofisticadas com mitocôndrias isoladas ou permeabilized fibra muscular.

Introdução

O objetivo final do metabolismo de nutrientes é tornar trifosfato de adenosina (ATP). Em células de mamíferos, isso ocorre nas mitocôndrias, organelas double-membraned que convertem a energia armazenada em carbono em ATP. A produção de ATP começa quando o carbono é queimado pela mitocôndria formando duas transportadoras de elétrons, NADH e dinucleótido de flavina e adenina (DANIII₂)¹. NADH e DANIII₂ são então oxidados por complexos respiratórios multi subunidade I e II, respectivamente, e os elétrons libertados são levados até o terminal do elétron aceitador oxigênio molecular (O₂) no complexo IV¹. A termodinamicamente favorável "ladeira abaixo" transferência de elétrons para O₂ no final da cadeia é acoplada à exportação de prótons para o intermembrane espaço pelos complexos I, III e IV. Isso cria um gradiente eletroquímico transmembrana de prótons (força motriz protónica), uma forma temporária de energia livre de Gibbs que é aproveitada pelo complexo V tornar ATP². Reações de transferência de elétrons nas mitocôndrias não são perfeitamente acopladas a produção de ATP. Em vários pontos do ciclo de Krebs e a cadeia respiratória, elétrons prematuramente podem interagir com O₂ para formar ROS³. ROS mais biologicamente relevante gerado por mitocôndrias são O₂^{● -} e H₂O₂. Embora O₂^{● -} é muitas vezes considerado o ROS proximal formado por mitocôndrias, agora é evidente que sites de produção formam uma mistura de O₂^{● -} e H₂O₂, que é associado com o livre química radical de flavin prótese grupos^4,5. Em níveis elevados, ROS pode ser perigoso, danificando componentes biológicos necessários para a função celular, resultando em angústia oxidativo⁶. No entanto, em quantidades reduzidas, ROS mitocondriais cumprir funções de sinalização vitais. Por exemplo, lançamento de H₂O₂ de mitocôndrias tem sido implicado no controle da ativação de células T, sinalização de stress (por exemplo, indução de vias de sinalização Nrf2), a indução da proliferação celular e diferenciação, sinalização da insulina e liberação e alimentação comportamento⁷. Progresso considerável tem sido feito na compreensão da função de sinalização de ROS. No entanto, importantes questões ainda permanecem em relação à qual enzimas nas mitocôndrias servem como as fontes mais importantes e como a produção é controlada.

Lançamento ROS por um site de produção depende de vários fatores: 1) a concentração da doação de elétrons do site, 2) o estado redox do site doar elétrons, 3) acesso ao oxigênio e 4) a concentração e tipo de substrato de oxidação^{3, 8 , 9}. nas mitocôndrias, outros fatores como a concentração de NADH e membrana potencial força também influenciam a produção de ROS^8,10. Por exemplo, a taxa de O₂^●-/ h₂O₂ produção purificada PDHC ou KGDHC aumenta com NADH crescente disponibilidade de^5,11. Nesse cenário, os elétrons estão fluindo para trás do NADH ao centro FAD na subunidade₃ E PDHC ou KGDHC, o site para O₂^●-/ h₂O₂ produção¹². Da mesma forma, a prestação de NAD⁺ tem o efeito contrário, diminuindo a liberação ROS de KGDHC¹². Assim, controlando a entrada e a saída de elétrons a partir de sites de produção de ROS pode alterar quanto₂●/h₂O₂ é formado. Por exemplo, bloqueando a subunidade₂ E PDHC ou KGDHC com CPI-613, um ácido lipoico analógico, o que resulta em uma quase 90% diminuição₂●/h₂O₂ produção¹³. Resultados semelhantes podem ser obtidos com o químico S-glutathionylation catalisadores, diamido e dissulfiram, que quase abolir O₂^●-/ h₂O₂ produção pelo PDHC ou KGDHC através da conjugação de glutationa para o E ₂ subunidade¹⁴. O trade-off para bloquear o fluxo de elétrons através da subunidade₂ E PDHC e KGDHC é uma diminuição na produção de NADH, que diminui a formação de ROS por cadeia de transporte de elétrons (por exemplo, complexo III). Isto também pode diminuir a produção de ATP pela cadeia de transporte de elétrons. Em geral, bloqueando a entrada do elétron aos locais de produção de ROS pode ser um meio altamente eficaz de controlar O₂^●-/ h₂O₂ produção.

As mitocôndrias podem conter até 12 potencial O₂^●-/ h₂O₂ fontes⁶. A maioria destes sites são flavin-contendo enzimas que geram uma mistura de O₂^{● -} e H₂O₂. Utilização de substrato diferente e combinações do inibidor permitiram a identificação dos quais complexos respiratórios e desidrogenases mitocondriais servem como O de alta capacidade₂^●-/ h₂O₂ formando sites em diferentes tecidos³. PDHC e KGDHC foram mostrados para servir como alta capacidade₂●/h₂O₂ sites emitindo no músculo e fígado mitocôndrias^13,15. No entanto, algumas dificuldades permanecem no que se refere a análise do₂●/h₂O₂ formando potenciais de sites individuais em mitocôndrias e o impacto que combinações de inibidor e substrato diferente em a atividade das enzimas. Isto é devido à presença de reações colaterais indesejáveis (por exemplo, formação de₂●/h₂O₂ por sites que não sejam a enzima de interesse), contaminando nutrientes endógenos (por exemplo,graxos ácidos) ou organelas (por exemplo,, peroxissomos que também formam O₂^●-/ h₂O₂) e uso de inibidores que a falta de seletividade, e/ou uso de compostos que não inibir totalmente a produção de ROS. Certos inibidores podem também alterar a bioenergética mitocondrial e a direção do fluxo de elétrons, e isto altera a liberação ROS de outros sites de produção e confunde os resultados. Preços absolutos para O₂●/h₂O₂ liberação de sites individuais nas mitocôndrias também são difíceis de quantificar devido à alta concentração de O₂^{● -} e H₂O₂ eliminando as enzimas no espaço matriz e intermembrane. Portanto, a eliminação de reações concorrentes que possam interferir com O₂^●-/ h₂O₂ lançamento medições pode ser útil quando identificando O de alta capacidade₂^●-/ h₂O₂ formando sites.

Aqui, apresentamos um método simples que permite a análise simultânea de O₂^●-/ h₂O₂ produção e formação de NADH por purificada desidrogenases dependentes de flavin. Usando enzimas purificadas, indesejados ROS formando reações colaterais e ROS enzimas degradantes podem ser eliminadas permitindo uma medida mais precisa do nativo O₂^●-/ h₂O₂ taxas de produção para flavoenzymes individual. Esse método pode ser usado para comparar diretamente os₂●/h₂O₂ formando a capacidade de diferentes desidrogenases purificadas ou aos potenciais inibidores específicos do site de tela para O₂^●-/ h₂O versão ₂ . Finalmente, medir₂●/h₂O₂ e a produção de NADH simultaneamente pode permitir uma avaliação em tempo real da relação entre a atividade enzimática e a capacidade de liberação ROS.

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Protocolo

1. produtos químicos e enzimas purificadas

1. Adquirir os seguintes materiais: PDHC e KGDHC de origem porcina coração (ou outra flavoenzyme mitocondrial purificada); H₂O₂ (solução a 30%), piruvato, α-cetoglutarato, NAD⁺, NADH, CoASH, pirofosfato de tiamina (TPP), sacarose manitol, HEPES, EGTA, Ácido valérico de 3-metil-2-oxo (KMV), superóxido dismutase (SOD), peroxidase de rábano (HRP), 10-acetil-3,7-dihydroxyphenoxazine reagente (AUR) e CPI-613.

2. planejamento do ensaio e preparação dos reagentes

1. Configure o ensaio de acordo com a tabela 1 em uma placa de 96 poços.
   Nota: O volume total para cada reação é 200 µ l. concentrações de estoque são ajustadas de tal que 20 µ l de reagente é adicionado a cada poço. Isso garante a rápida adição de cofactores e substratos para cada reação bem antes de começar o ensaio.
2. Prepare a solução tampão de reação com manitol 220mm, sacarose de 70 mM, 1 mM EGTA e 20 mM HEPES (pH 7,4 com HCl).
   Nota: Isto pode mudar dependendo das propriedades físicas de diferentes enzimas purificadas.
3. Examine o KGDHC ou o PDHC purificada por contaminação usando a enzima atividade ensaios^14,16,17 ou por immunoblot ou Coomassie mancha⁵.
4. Prepare todos os reagentes no buffer de reação conforme as concentrações de solução de trabalho na tabela 1.
5. Armazenar todos os reagentes como alíquotas de 1ml a-20 ° C. Loja de piruvato e α-cetoglutarato a-80 ° C, em alíquotas de 100 µ l para prevenir a degradação espontânea devido à auto-oxidação e congelamento-descongelamento repetidos.
6. Preparar o reagente AUR estoque mestre em 1 mL de DMSO e então diluir a 100 µM em tampão de reação. Armazenar protegido da luz.
   Nota: Aqui, a solução de trabalho de 100 µM é feito fresco a cada 2 a 3 semanas e protegido da luz.

3. configurar o modelo de ensaio

1. Configure o procedimento de ensaio em um leitor de microplacas monocromática com capacidades de medição dual.
2. Defina o processo de leitura, selecionando "Protocolo". Clique em "Procedimento".
3. Defina "Temperatura" a 25 ° C (figura 1A).
4. Clique em "Iniciar cinético" para definir as condições de leitura (figura 1A). Defina a hora e o número de intervalos de leitura/experiências.
5. Clique em "ler" (figura 1B).
   Nota: As amostras são lidos da posição superior com um ganho de 50. Tempo: 5 min, ler em intervalos de 30-s. Canal 1: Fluorescência Resorufin - excitação/emissão = 565 nm nm:600, largura do comprimento de onda de 13.5 nm. Canal 2: NADH autofluorescência - excitação/emissão = 376 nm nm:450, largura do comprimento de onda de 20 nm.
6. Em "Leitura", selecione poços para monitor (por exemplo, A1-A4 e B1-B4).
7. Selecione "END cinética".

4. padrão curvas

1. Descongelar os reagentes e armazenar no gelo até ser necessário.
2. Curva padrão de NADH (Figura 2A)
   1. Prepare as soluções de trabalho para NADH na faixa de concentração de 0,5-10 mM de tampão de reação.
   2. Adicione 20 alíquotas µ l de cada NADH trabalhando a concentração da solução de poços que contém 180 µ l tampão de reação. A concentração final de NADH em cada bem é 0,05-1 mM.
   3. Clique em "Ler" e defina a excitação/emissão = 376 nm nm:450, largura do comprimento de onda de 20 nm.
      Nota: Este é um ponto de extremidade somente leitura - parâmetros cinéticos não são necessários.
3. Curva padrão AUR (Figura 2B)
   1. Preparar as ações de trabalho de peróxido de hidrogênio no amortecedor da reação; intervalo de concentrações estoque de 4.000-200 nM.
   2. Adicione 120 µ l de buffer de reação a cada poço.
   3. Adicionar 20 µ l de HRP (trabalhando a concentração das ações = 30 U/mL, concentração final no poço = 3 U/mL), 20 µ l de SOD (trabalhando a concentração das ações = 250 U/mL, concentração final no poço = 25 U/mL) e 20 µ l de AUR (trabalhando a concentração das ações = 100 µM concentração final no poço = 10 µM) para cada bem com tampão de reação.
   4. Adicione 20 µ l de cada H₂O₂ solução estoque a cada bem contendo reagentes buffer e ensaio de trabalho. O volume final da reação é de 200 µ l e a concentração final de H₂O₂ em cada poço é 20-400 nM.
   5. Incubar as placas por 1 min no leitor a 25 ° C.
   6. Clique em "Ler" e defina a excitação/emissão = 565 nm/600 nm, largura do comprimento de onda de 13.5 nm. Note que este é um ponto de extremidade somente leitura - parâmetros cinéticos não são necessários.

5. medir O^●- / h₂ O₂ versão₂e a produção de NADH por KGDHC e PDHC

1. Ver tabela 1 para a ordem de adição dos reagentes diferentes, a concentração de cada solução de trabalho e o volume adicionado a cada poço.
2. Adicione 40 µ l de tampão de reação a cada poço. Para os ensaios usando KMV ou CPI-613, adicione 20 µ l de buffer para cada poço.
3. Adicionar 20 µ l do PDHC ou KGDHC (estoque de trabalho de 1 U/mL, concentração final por alvéolo = 0.1 U/mL) a cada poço.
4. Incube o PDHC e KGDHC a 25 ° C por 2 min.
5. Adicionar 20 µ l de KMV (estoque de trabalho = 100 mM, concentração final = 10 mM) ou 20 µ l de CPI-613 (trabalhando a concentração das ações = 1,5 mM, concentração final = 150 µM) (tabela 2).
   Nota: Este passo pode ser excluído se inibidores não estão sendo usados para os ensaios.
6. Incubar durante 1 min a 25 ° C.
   Nota: Este passo pode ser excluído se inibidores não estão sendo usados para os ensaios.
7. Adicionar 20 µ l de HRP (trabalhando a concentração das ações = 30 unidades/mL, concentração final no poço = 3 unidades/mL) e 20 µ l de SOD (trabalhando a concentração das ações = 250 unidades/mL, concentração final no poço = 25 unidades/mL) a cada poço.
8. Adicionar 20 µ l de coenzima A (trabalhando a concentração das ações = 1 mM, concentração final = 0,1 mM), 20 µ l de TPP (trabalhando a concentração das ações = 3mm, concentração final = 0,3 mM) e 20 µ l de NAD⁺ (trabalhando a concentração das ações = 10mm, concentração final = 1 mM) para cada w Ell.
9. Remover o reagente AUR do revestimento protetor de papel alumínio e adicionar 20 µ l de cada poço.
10. Adicionar 20 µ l de piruvato (trabalhando a concentração das ações, que varia de 1-100 mM, a concentração final para os ensaios = 0,1-10 mM) para poços contendo PDHC e α-cetoglutarato (trabalhando a concentração das ações, que varia de 1-100 mM, a concentração final para os ensaios = 0,1-10 mM) para poços contendo KGDHC.
11. Clique em "Ler" para iniciar a medição cinética.

6. análise de dados

1. Mantenha pressionado o botão "CTRL" no teclado e clique em poços para gerar um gráfico que contém todas as medições cinéticas correspondente para o canal 1 (Figura 3A).
2. Clique em "dados" no ícone de exibição no canto superior direito para valores brutos para unidades de fluorescência relativo (RFU) medidas nos pontos de tempo diferentes (Figura 3B).
3. Exporte os valores para análise (tabela 3).
4. Clique em "Graph" menu drop-down no canto superior direito (Figura 3B) para acessar valores RFU associados com o canal 2 de fluorescência.
5. Repita as etapas de 6.1 a 6.3 para canal 2.

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Resultados

Figura 3A fornece um traço representativo para a RFU recolhida durante a medição simultânea de H₂O₂ e a produção de NADH por KGDHC purificado. Os dados brutos da RFU para cada intervalo de tempo são representados na Figura 3B. Os dados brutos da RFU são então exportados para análise. Por extrapolando curvas padrão apresentadas na Figura 2, pode ser determinada a quant...

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Discussão

Este protocolo é vantajoso desde, 1) elimina quaisquer reacções concorrentes que caso contrário podem interferir com o H₂O₂ detecção (por exemplo, sistemas antioxidantes ou outras fontes de ROS), 2) fornece uma avaliação directa da taxa nativa de ROS de lançamento por uma desidrogenase mitocondrial contendo flavin, 3) permite a comparação do nativo ROS liberar a taxas de dois ou mais purificado desidrogenases flavin-baseado, 4) pode permitir a uma comparação direta da taxa de a...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pyruvate dehydrogenase complex	SIGMA	P7032-10UN	purified flavoenzyme
alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex	SIGMA	K1502-20UN	purified flavoenzyme
30% hydrogen peroxide solution	SIGMA	HX0640-5	reagent, standard curves
NAD+	SIGMA	N0632-1G	reagent, activity/ROS release assay
NADH	SIGMA	N4505-100MG	reagent, standard curves
pyruvate	SIGMA	P2256-5G	reagent, activity/ROS release assay
alpha-ketoglutarate	SIGMA	75892-25G	reagent, activity/ROS release assay
CoASH	SIGMA	C3019-25MG	reagent, activity/ROS release assay
thiamine pyrophosphate	SIGMA	C8754-1G	reagent, activity/ROS release assay
mannitol	SIGMA	M4125-100G	buffer component
Hepes	SIGMA	H3375-25G	buffer component
sucrose	SIGMA	S7903-250G	buffer component
EGTA	SIGMA	E3889-10G	buffer component
KMV	SIGMA	198978-5G	reagent, ROS release inhibitor
CPI-613	Santa Cruz	sc-482709	reagent, ROS release inhibitor
SOD	SIGMA	S9697-15KU	reagent, ROS release detection
horseradish peroxidase	SIGMA	P8375-1KU	reagent, ROS release detection
Amplex Ultra Red	Thermofisher	A36006	reagent, ROS release detection
Biotech Synergy 2 microplate reader	BioTek Instruments		microplate reader for assays
Gen5 software	BioTek Instruments		software, used for collection of raw RFU
Graphpad Prism	Graphpad software		software, data analysis
Microsoft EXCEL	Microsoft		software, data analysis