Maus-Modellen der Helicobacter -Infektion und Magen-Erkrankungen

Zusammenfassung

Mäuse sind ein unschätzbares in Vivo -Modell, Infektionen und Krankheiten, die durch Magen-Darm-Mikroorganismen zu studieren. Hier beschreiben wir die Methoden zur Untersuchung der bakteriellen Besiedelung und histopathologische Veränderungen in Mausmodellen von Helicobacter Pylori-Krankheiten.

Zusammenfassung

Helicobacter Pylori ist ein Magen-Erreger, die in der Hälfte der Weltbevölkerung vorhanden ist und ist eine wesentliche Ursache für Morbidität und Mortalität beim Menschen. Mehrere Maus-Modellen der Magen Helicobacter -Infektion wurden entwickelt, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu untersuchen, wobei die H. Pylori -Bakterien besiedeln den Magen des menschlichen Wirte und Krankheiten verursachen. Hier beschreiben wir Protokolle: 1) bereiten Sie bakterielle Aufhängungen für die in-Vivo -Infektion von Mäusen über eines-Magensonde; (2) bestimmen Sie bakterienbesiedlung in Maus Magen Gewebe, durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und tragfähige zählen; und 3) krankhafte Veränderungen durch Histologie zu beurteilen. Um Helicobactäh Infektion bei Mäusen zu etablieren, bestimmten Pathogen-freies (SPF) Tiere sind zunächst mit Suspensionen (mit ≥10⁵ koloniebildenden Einheiten KBE) der Maus besiedeln entweder Helicobacter Pylori -Stämme beimpft oder andere Magen Helicobacter spp. von Tieren, wie z. B. Helicobacter Felis. Zu den entsprechenden Zeitpunkten nach der Infektion sind Mägen ausgeschnitten und seziert sagittal in zwei gleich gewebefragmente, jeweils bestehend aus den Regionen Antrum und Körper. Eines dieser Fragmente wird verwendet für tragfähige zählen oder DNA-Extraktion, während die anderen histologischen Verarbeitung unterliegt. Bakterielle Besiedlung und histopathologische Veränderungen im Magen können routinemäßig im Magen Gewebeschnitte gebeizt mit Warthin-Starry, Giemsa oder Hämatoxylin und Eosin (H & E) Flecken, entsprechend bewertet werden. Zusätzliche immunologische Analysen darf auch von Immunohistochemistry oder Immunfluoreszenz auf Maus Magen Gewebeschnitte vorgenommen werden. Die nachfolgend beschriebenen Protokolle sind speziell für die Beurteilung bei Mäusen der gastrischen Krankheiten ähnlich denen in Mensch-im Zusammenhang mit H. Pylori ermöglichen Krankheiten, einschließlich Entzündung, Atrophie der Drüse und lymphoide Follikel Bildung. Das Inokulum Vorbereitung und eines-Magensonde Protokolle können auch an die Pathogenese der anderen magensaftresistenten humanpathogene Erreger zu studieren, die Mäuse, wie Salmonella Typhimurium oder Citrobacter Rodentiumbesiedeln angepasst werden.

Einleitung

Helicobacter Pylori ist eine spiralförmige, Gramnegative, menschlichen Magen Erreger vorhanden in allen Bevölkerungsgruppen auf der ganzen Welt, mit Infektionsraten in den Entwicklungsländern, die voraussichtlich in der Größenordnung von 80 %¹. Obwohl die meisten H. Pylori-infizierte Personen asymptomatisch sind, einige schwere Krankheiten, Magenkrebs²von Verdauungs-Geschwüre bis zu entwickeln. H. Pylori-assoziierten Krebsarten im großen und ganzen zeichnen sich durch bösartige Veränderungen in Epithelzellen (GECs) oder durch die Bildung von extra nodal lymphatischen Gewebe im Magen, wodurch Magen Adenokarzinom oder Schleimhaut-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT) Lymphom, beziehungsweise. H. Pylori ist sehr angepasst, um zu überleben in der rauen ökologische Nische des Magens durch die Anwesenheit von verschiedenen Virulenzfaktoren und Mechanismen, die Erleichterung der Einhaltung, Wachstum und Stoffwechsel in dieser Nische. Insbesondere besitzen virulente Stämme von H. Pylori 40 kb Cag Pathogenität Insel (CagPAI), die ungefähr 30 Gene für die Produktion einer Typ 4-Sekretion System (T4SS)^{3,4 erforderlichen kodiert} . CAG PAI-positiven H. Pylori -Stämme sind verbunden mit der Induktion von höheren Ebenen der chronischen Entzündung in der Hostie, die als ein wesentlicher Vorläufer der Magen Adenokarzinom⁵verwickelt hat.

In Vivo Tiermodellen, insbesondere Mäuse wurden dadurch, dass Forscher untersuchen die relativen Beiträge der Host, bakterielle und umweltbedingten Faktoren auf H. Pylori -Infektion und Krankheit Ergebnis⁶sehr informativ. Studien haben bisher gezeigt, die verlängerte H. Pylori Infektion der Mäuse C57BL/6 genetischen Hintergrund Ergebnisse bei der Entwicklung von chronischer Gastritis und Drüse verkümmert, beide Kennzeichen von H. Pylori -Infektion-⁷. Infektion mit den verwandten Bakterienarten Katze/Hund, H. Felis, ist darüber hinaus nachweislich induzieren Malz Bildung bei Mäusen mit ähnlichen Pathologie und Fortschreiten der Krankheit wie im menschlichen MALT-Lymphom^8,9zu sehen. Die am häufigsten verwendeten H. Pylori Isolat in Studien an Mäusen Kolonisation ist die "Sydney Sorte 1" (SS1) Belastung¹⁰, die CagPAI⁺ , sondern hat ein nicht-funktionale T4SS (T4SS⁻)¹¹. Andere weit verbreiteten Sorten sind H. Pylori B128 7.13 (CagPAI⁺/T4SS⁺)¹² und X47-2AL (CagPAI^–/T4SS⁻)¹³. Für H. Felis Infektionen, die Belastung CS1 ("Cat Spirale 1", CagPAI^–/T4SS⁻) ist in der Regel verwendete¹⁴.

Hier bieten wir ein Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Helicobacter Impfkulturen für in-Vivo -Infektion, das Verfahren für die eines-Magensonde von Mäusen, sowie Methoden für die Verarbeitung von Gewebe für die Untersuchung von histopathologischen Veränderungen in den Magen. Insbesondere konzentriert sich dieser Artikel auf die histologischen Methoden zur bakteriellen Besiedelung zu visualisieren und histopathologische Veränderungen, einschließlich der Malz-Bildung in der Magenschleimhaut von infizierten Mäusen zu beurteilen. Einige der hier beschriebenen Methoden kann das Studium der andere Darm-Erreger wie S. angepasst werden. Typhimurium oder C. Rodentium.

Protokoll

1. Wachstum und Vorbereitung der bakteriellen Impfkulturen

1. Tauen Sie Glycerin Bestände von H. Pylori oder H. Felis¹⁵ von-80 ° C und Subkultur auf Pferd BLUTAGAR (HBA) Platten bestehend aus: BLUTAGAR Base Nr. 2 (siehe Tabelle der Materialien); eine modifizierte "Skirrows Antibiotika selektive Ergänzung" (bestehend aus Vancomycin, 10 μg/mL; Polymyxin B, 25 ng/mL; Trimethoprim, 5 µg/mL; Amphotericin B, 2,5 μg/mL); und 5 – 10 % (V/V) Pferd Blut^15,16. Die Bakterien wachsen auch unter Microaerobic Bedingungen in 2,5 oder 3,5 L anaeroben Gläser mit den entsprechenden Gas Packs (siehe Tabelle der Materialien), bei 37 ° C.
   Hinweis: H. Pylori Stämme unter diesen Bedingungen gewachsen müssen nach 1 bis 1,5 Tagen Inkubation, subkultiviert werden, während für H. Felis, mindestens 2 Tage Inkubationszeit ist in der Regel erforderlich. Geeignete Kultur und Lagerung Medien beschrieben worden im detail vorher¹⁵.
2. Maus-Infektion vom frühen bis mittleren logarithmischen Phase Kulturen bakterielle Impfkulturen vorbereiten. Ernten Sie Bakterien sanft von Agarplatten durch Überflutung jede Platte mit 1 – 2 mL des Gehirns Herz Infusion (BHI) Brühe. Aspirieren Sie Suspensionen aus Platten mit Pasteur Pipetten.
   1. Alternativ bereiten Sie Inokula von Helicobacter -Bakterien, die in der BHI Suppe für 16 – 18 h¹⁵weitergegeben wurden. In diesem Fall sammeln Sie Bakterien durch niedrige Drehzahl Zentrifugation bei 2.200 X g für 10 min bei 4 ° C.
3. Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit und Beweglichkeit der Bakterien durch die Untersuchung nasspräparat Vorbereitungen unter Phasenkontrastmikroskopie (100 X Objektiv). Bereiten Sie nassen Reittiere durch resuspending eine IMPFÖSE Bakterien in ein 10 – 20 μL Tröpfchen der BHI Brühe auf einen Glas-Objektträger vor. Im Falle von H. Felis, die eine viel größere Bakterium als H. Pyloriist, verwenden Sie eine Zählkammern genau die Anzahl der lebensfähigen Bakterien zählen. Bestätigen Sie Kultur Reinheit durch eine Gram-Färbung ausführen.
   Hinweis: Verwenden Sie H. Pylori Impfkulturen nur, wenn die Mehrheit der Bakterien eine bacillary oder spiralförmige Form (die Morphologie variieren abhängig von der Sorte). H. Felis Impfkulturen sollte in erster Linie helical-förmige Bakterien. enthalten. Verwenden Sie Impfkulturen nicht, wenn die meisten Bakterien eine kokkoiden Morphologie haben, diese Formen sind nicht lebensfähig und werden keine Infektion bei Mäusen.
4. Schätzen Sie die Anzahl der Bakterien in das Inokulum zählen unter Phasenkontrastmikroskopie die ungefähre Anzahl der Bakterien pro Feld (100 X Objektiv) und mithilfe der folgenden Anleitung: 1 Bakterium pro Feld = ca. 10⁶ koloniebildenden Einheiten () CFU) von Helicobacter/mL; 10 Bakterien pro Feld = ca. 10⁷ KBE/mL; 100 Bakterien pro Feld = ca. 10⁸ KBE/mL, etc.
   1. Bei der Verwendung von einem Zählkammern berechnen Sie KBE/mL mithilfe der folgenden Formel:
      KBE/mL = (durchschnittliche Anzahl von Bakterien in einem 4 x 4-Feld) x (Verdünnungsfaktor) X (10⁴).
5. Nachstellen Sie die bakterielle Zelle Dichte des Inokulums bis ca. 10⁷– 10⁸ KBE/mL durch Verdünnung im BHI-Bouillon, ggf..
   1. Um maximale bakterielle Rentabilität zu gewährleisten, verwenden Sie Impfkulturen für eines-Magensonde so bald wie möglich nach der Zubereitung.
   2. Immer bestätigen Sie H. Pylori Zelldichte und Lebensfähigkeit durch tragfähige Zählung der Impfkulturen unmittelbar nach dem Eingriff Magensonde (siehe unten) durchführen. Dies ist nicht immer möglich für H. Felis, wie es in der Regel nicht isolierte Kolonien auf Nährmedien sind. Die Anzahl der lebensfähigen Helicobacter-s in Impfkulturen nicht durch Messung der optischen Dichte (ein₆₀₀) allein bestimmt werden, da diese Methode nicht zwischen lebensfähig zu unterscheiden (d. h.bacillary/Spirale/spiralförmige) und nicht-lebensfähige ( d. h. kokkoiden) Bakterien.
   3. Verwenden Sie optische Dichtewerte als ein Mittel zur Schätzung der Anzahl der lebensfähigen H. Pylori Bakterien in Inokula, aber in diesem Fall ist es zunächst erforderlich, eine Wachstumskurve zu generieren. Hierzu sind A₆₀₀ Werte von H. Pylori Kulturen im Laufe der Zeit überwacht und korreliert direkt gegen die Anzahl der lebensfähigen Bakterien, durch zählen der Platte bestimmt.
      Hinweis: Eine bequeme Methode für die Durchführung von Abschlussvolumen Wachstum Kurve soll Kultur Bakterien im flüssigen Medium (Abschnitt 1.2), mit standard Flachboden Gewebe Kulturflaschen in einem 10 % CO₂ Inkubator platziert. Die Nummern der KBE, ermittelt aus Aliquote der Kulturen erhalten alle 4 – 6 h über 2 – 3 Tage, sind dann im Vergleich zu den entsprechenden eine₆₀₀ -Werte-¹⁷. Wichtig ist, müssen Wachstumskurven für jede Belastung H. Pylori generiert werden, da diese unterschiedlich schnell wachsen können und darüber hinaus nicht alle Stämme gut in 10 % CO_{2 wachsen}.

(2) eines-Magensonde von Mäusen mit Helicobacter

Hinweis: Diese Methode der eines-Magensonde kann andere Bakterienarten zugewiesen werden, die den Darm z. B. S. kolonisieren TyphimuriumC. Rodentium, Listeria Monocytogenes.

1. Verwenden Sie 6 – 8 Wochen alten, spezifische Erreger frei (SPF) und Helicobacter-männliche oder weibliche Mäusen zu befreien. Verwenden Sie Tiere mit einem C57BL/6 genetischen Hintergrund für Infektions-Experimente mit H. Pylori oder H. Felis. In der vorliegenden Studie wir Wildtyp (WT) und gentechnisch veränderte C57BL/6 Mäusen fehlt einen Schlüssel angeborene immun-Rezeptor (Knock-out- oder KO Tiere bezeichnet).
   Hinweis: Mäuse auf andere genetische Hintergründe können auch für Helicobacter Infektionen verwendet werden, jedoch Kolonisation Ebenen und Schwere der Erkrankung können beeinflusst werden durch die Art der Gastgeber Hintergrund^18,19.
2. Aspirieren Sie das bakterielle Inokulum (Schritt 1.5) in Einweg-1 mL Spritzen und ersetzen Sie die mitgelieferten Nadeln mit 23 Gauge Nadeln auf dem aufgeklebten Einweg-Polyethylen-Katheter (Länge, 6 – 8 cm; Innendurchmesser, 0,58 mm) sind. Katheter, die Nadeln durch die Anwendung der schmale Streifen aus Kunststoff zu befestigen (siehe Tabelle der Materialien). Alternativ, ersetzen Sie die Nadel/Katheter Assembly durch Verwendung von sterilen Plastik Fütterung Tubes (20 gauge 38 mm).
3. Zurückhalten Sie physisch Mäuse mit einem festen Griff auf das Genick, Hals und Schwanz.
   Hinweis: Dieses Verfahren kann ohne Narkose, oder alternativ mit dem Einsatz von inhalativen Narkosemittel, z. B. Methoxyflurane oder Isofluran¹⁵durchgeführt werden.
4. Katheter in der Mitte der offenen Kiefer und Führer in einer kaudalen Richtung Speiseröhre einfügen. Den Hals der Maus ermöglicht leichten Zugang zu den Magen durch die Speiseröhre (und Weg von der Luftröhre) zu verlängern, bis die meisten oder alle des Katheters ist nicht mehr sichtbar und ein Widerstand zu spüren ist, entspricht die Basis des Magens. Liefern Sie eine bestimmte Aliquote, in der Regel 100 μL pro Impfung (Abbildung 1).
   Hinweis: Mäuse sollte gavaged mit ≥ 10⁵ KBE um optimale Besiedlung und Krankheit Pathologie zu gewährleisten.
5. Hausmäuse in ein SPF Tierhaltung für die Dauer des Experiments.
   Hinweis: Schwere Pathologie und Adenokarzinom in WT C57BL/6 Mäusen wird nur bei etwa 24 Monate nach der Infektion²⁰beobachtet. Dieser Effekt kann jedoch bei einigen genetisch veränderten Tieren, oder bei Mäusen mit anderen genetischen Hintergründen beschleunigt werden.
6. Nach Abschluss des Verfahrens Magensonde, führen Sie eine Änderung der Meilen und Misra Technik bestimmen die Anzahl der lebensfähigen H. Pylori Bakterien an Mäusen verabreicht. Dafür, das Inokulum wird seriell verdünnt (ab 10⁻¹ bis 10^-5) im BHI mit der beschriebenen Methode im detail vorher¹⁵.
   Hinweis: Um eine Isolierung der einzelnen Kolonien gewährleisten, HBA Platten sollten erwärmt und getrocknet werden in einem biologischen Sicherheit Schrank oder 37 ° C Inkubator für 10 – 15 Minuten vor dem Gebrauch.

3. Ernte Gewebe von Mäusen nach dem experiment

1. Einschläfern Sie Mäuse durch Kohlendioxid Einatmen oder Zervikale Dislokation, laut der zuständigen Ethikkommission für Tierversuche.
2. Öffnen der Bauchhöhle und Verbrauchssteuern den Magen mit feinen, gebogenen Schere.
   Hinweis: Sera können auch durch Herzpunktion, Hilfe bei der Untersuchung der systemischen Reaktionen auf Helicobacter -Infektion gesammelt werden. Darüber hinaus die Sammlung von Milz und Lymphknoten Paragastric eignen sich adaptive Immunantworten zu studieren.
3. Schneiden Sie den Magen entlang größerer Krümmung und entfernen Sie restliche Nahrung durch sanfte Waschen in sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einem 50 mL-Tuben.
4. Den Magen wieder in sterilen PBS waschen und dann das Nassgewicht tarierten 6 cm Kunststoff Petrischalen mit aufzeichnen.
5. Glätten des Magens und sezieren sagittal in zwei gleich gewebefragmente, jedes bestehend aus: Antrum, Körper und nicht glanduläre Vormagen Regionen (Abbildung 2). Entfernen die nicht glanduläre Region und wiegen eine Hälfte eines jeden Magen bevor Sie hinzufügen entweder 1 mL sterile BHI (für tragfähige zählen) oder snap Einfrieren in flüssigem Stickstoff (für DNA/RNA-Extraktion).
   Hinweis: Röhrchen mit Gewebe in BHI müssen auf Eis gespeichert werden, bis sie verarbeitet werden können. Snap gefrorenen Magen Gewebe können auch verwendet werden, RNA oder Proteine für qPCR (quantitative PCR) oder western Blot Analysen, bzw. zu extrahieren.
6. Fügen Sie andere Magen die Hälfte auf eine 15 mL Röhrchen mit 10 % Formalin. Tauchen Sie Gewebe in 10 % Formalin für 10 s und dann flach auf der Oberseite der Rohre. Gewebe zu beheben, bevor wieder Eintauchen in 10 % Formalin-Lösung für ein Minimum von 24 h zu ermöglichen.
   Hinweis: Gewebe können viele Wochen vor der Verarbeitung für Histologie in 10 % Formalin verbleiben. Längerer Lagerung des Gewebes beeinträchtigen jedoch seine Architektur und/oder Antigenität was zu suboptimalen Ergebnissen in nachgeschalteten Analysen.

4. Bestätigung der bakteriellen Besiedelung in den Magen nach der Infektion

1. Tragfähige zählen von H. Pylori im Magen
   1. Ergänzung sterile HBA-Platten mit zusätzlichen Antibiotika (200 μg/mL Bacitracin und 10 μg/mL Naladixic Säure) vor der Durchführung Kolonie zählt von infizierten Maus Mägen¹⁶.
   2. Homogenisieren Magen Abschnitte entweder manuell, mit autoklavierbar Polypropylen Micropestles, oder mit einem mechanischen Dissoziation-Instrument (siehe Tabelle der Materialien).
   3. Bereiten Sie doppelte Verdünnungsreihen (10⁻¹ bis 10⁻²) von der daraus resultierenden Magen Homogenates in sterilen BHI.
      Hinweis: Verdünnungen sollte entschieden werden anhand der typischen bakteriellen Lasten bezogen auf einen bestimmten H. Pylori Infektion sowie die Dauer der Infektion verwendete Stamm. Unverdünnte Proben können auch verwendet werden.
   4. Unterteilen Sie vorgetrocknete HBA-Platten (siehe Hinweis oben) in drei oder vier Segmente. Eine Anpassung der Meilen und Misra-Technik verwenden, fügen Sie 10 – 100 mL jeder Verdünnung auf ein Segment der Agar-Platte und verbreiten mit steriler Kunststoff Schleifen¹⁵.
   5. Lassen Sie die Platten zu trocknen und dann legen Sie sie hängend (Deckel nach unten) in Anaerobe Gas Gläsern. Um Feuchtigkeit in die Gläser zu erhalten, gehören Sie eine Petrischale mit Wasser.
   6. Inkubieren Sie Gläser bei 37 ° C, bis Kolonien bilden (in der Regel 4 – 7 Tage).
   7. Zählen Sie Segmente, die zwischen 10 und 100 isolierte Kolonien auf.
      Hinweis: H. Pylori Kolonien und H. Felis Wachstum auf Platten können von denen der anderen Mitglieder der murinen Magen Mikrobiota mit Urease, Katalase und Oxidase Standardtests unterschieden werden. H. Pylori und H. Felis sind für alle drei Tests positiv.
   8. Berechnen Sie die bakterielle Belastungen als (KBE/g Gewebe), mithilfe der folgenden Formel:
      [(Durchschnittliche Anzahl der Kolonien gezählt) × (Verdünnungsfaktor) x (Volumen vernickelt)] / (Magen-Gewicht).
2. Erkennung von H. Felis -Infektion im Magen Gewebe durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
   1. Extrahieren Sie DNA von Maus Mägen mit Standardprotokollen DNA-Isolierung oder einem im Handel erhältlichen Kit.
   2. Die DNA-Konzentration der Proben mit einer fluorometrisch Quantifizierung Technik zu bestimmen (siehe Tabelle der Materialien).
   3. PCR-Reaktionen auf ein 325-Basenpaaren (bp)-Fragment von H. Felis Urease B-Gen (UreB)²¹eingerichtet. Jede Reaktion sollte enthalten: 100 ng genomic DNA; 1 mM nach vorne (5'-AAA ATC CAC GAA GAC TGG GG-3') und rückwärts (5'-CTT TTA TCC AAG TGG TGG CAC ACC-3') Primer; 200 mM dNTPs; 0,5 Einheiten Taq Polymerase und die entsprechenden Mengen an Puffer und Nuklease-freies Wasser.
      Hinweis: Dieses Oligonukleotid-Paar wurde entwickelt, um erkennen und binden Sie an homologe Sequenzen in H. Pylori und H. Felis UreB Gene, aber wenn die PCR-Zustände unter, nicht im anwesenden UreB ausgesetzt Gene des enterohepatischen Helicobacter spp.
   4. PCR-Amplifikation mit der folgenden Wärmeprofil durchführen: Heizung bei 94 ° C für 5 min, gefolgt von 35 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 61 ° C für 30 s und 72 ° C für 1 min, bevor halten bei 20 ° C.
   5. Laufen Sie PCR-Produkte auf einem 2 % Agarose-Gel für 30 min bei 100 V.

(5) histologische Analysen von Helicobacter -infizierten Maus Magen Abschnitte

1. Verarbeitung von Magen Gewebe
   1. Entfernen Sie Magen Gewebe aus Formalin und in sauberen Petrischalen.
   2. Schneiden Sie Magen-Gewebe mit einem Skalpell in mehrere gleichgroße längs-Streifen (je 2 – 3 mm dick) und in gekennzeichneten einbetten Kassetten mit Schaumstoffpolsterung.
   3. Magen Gewebe zu beheben, indem man einbetten Kassetten in ein Glas, gefüllt mit 80 % Ethanol.
      Hinweis: Mägen sofort verarbeitet oder gespeichert werden können bis zu 1 – 2 Tage vor dem Fortfahren mit dem nächsten Schritt fort.
   4. Prozess-Mägen auf einem automatisierten Gewebe-Prozessor programmiert mit den folgenden Einstellungen:
      Dehydratation: 70 % igem Ethanol - 1 Zyklus, 20 min; 90 % Ethanol - 1 Zyklus, 20 min; 100 % Ethanol - 2 Zyklen, 20 min. + 1 Zyklus, 40 min + 1 Zyklus 1 h.
      Clearing: Xylol – 2 Zyklen, 30 min + 1 Zyklus, 45 min.
      Imprägnierung: Paraffinwachs bei 60 ° C - 1 Zyklus, 1,25 h 45 min + 1 Zyklus, 1 h + 1 Zyklus.
   5. Die Proben aus der Maschine nehmen und bei Raumtemperatur für die Einbettung von Paraffin lagern.
2. Paraffin Einbetten der Magen Gewebe verarbeitet
   1. Platzieren Sie Edelstahl Basis Formen auf der Bühne des Referats einbetten, die Grundlagen der Schimmelpilze warm.
      Hinweis: Einbettung Maschine sollte bei 60 ° C für effiziente Paraffin eingebettete festgelegt werden.
   2. Ort gewachst Kassetten mit den Proben in einen Warmwachs Bad/heiße Platte Bereich des Referats einbetten, bis Wachs vollständig auflöst.
      Hinweis: Es wird empfohlen, dass die Probe eingebettet werden, kurz nachdem Wachs löst sich. Dies sorgt dafür, dass die Verhärtung des Gewebes nicht auftritt.
   3. Füllen Sie die Hälfte der Edelstahl-Formen mit Paraffinwachs. Mit warmen Zange Magen Gewebe Streifen von Kassetten und sanft schieben Sie der Magen durch das Paraffin auf der Basis der Schimmelpilze Streifen entfernen. Gewebe Streifen im rechten Winkel an der Basis der Formen sorgfältig zu orientieren, so dass ihre geschnittenen enden nach oben gerichtet sind.
      Hinweis: Die folgenden Schritte sollten zur Vermeidung von Härten und Trennung der Schichten Paraffin eingebettete Blöcke so schnell wie möglich durchgeführt werden. Die korrekte Ausrichtung der Magen Gewebe ist entscheidend für nachgelagerte Analysen.
   4. Legen Sie Formen auf die kalte Platte des Referats einbetten zu fixieren die Proben und Gewebe neu zu orientieren, wenn nötig.
      Hinweis: Wenn das Gewebe verdrängt werden und das Paraffin beginnt auszuhärten, platzieren Sie Formen wieder auf die Heizplatte, das Wachs zu schmelzen und erneut einbetten Gewebe in Formen.
   5. Legen Sie die Hälfte der gekennzeichneten einbetten Kassetten (die für die Verarbeitung von Gewebe verwendet wurden) an der Spitze der Formen und füllen Sie sanft mit Warmwachs. Lassen Sie sich nicht von Paraffin zum Überlaufen.
   6. Sanft Formen auf einen kalten Teller legen und abkühlen lassen.
   7. Sobald das Paraffin vollständig untergegangen ist, trennen Sie die eingebetteten Blöcke von Formen. Sauber überschüssiges Paraffin Wachs auf Kassette Kanten mit einer heißen Platte (über 80 ° C eingestellt) oder einem Schaber. Blöcke können bei Raumtemperatur gelagert werden, bis Schnitt durchgeführt wird.
3. Schneiden von Gewebe
   1. Paraffin-eingebetteten Gewebe Blöcke auf dem Eis kühlen und erwärmen ein Wasserbad mit Reinstwasser auf 40 – 45 ° c gefüllt
   2. Sichern Sie die Klinge des Inhabers Mikrotom und festlegen Sie der Freiwinkel zwischen 1 – 5° Kontakt zwischen dem Block Gesicht und Messer Facette, vor dem Einsetzen der Paraffin-Blöcke zu verhindern.
      Hinweis: Sicherstellen Sie, dass Blöcke überschüssiges Paraffin einbetten, gewonnenen klar sind, wie dies die Passform des Blocks behindern kann.
   3. Das Blatt für einen geraden Schnitt über den Block zu orientieren. Schneiden Sie sanft 2 – 3 Dünnschliffe zur korrekten Positionierung des Blocks zu gewährleisten.
   4. Schneiden Sie Blöcke durch eine Dicke von ca. 10 – 30 mm. Diese Schritt wird sichergestellt, dass eine maximale Fläche von jedem Gewebe Streifen geschnitten werden.
   5. Schneiden Sie 10 µm Abschnitte und verwerfen alle, die Löcher, die verursacht durch Trimmen enthalten.
   6. Sorgfältig holen Sie Abschnitte mit einer Pinzette ab und schweben sie im Wasserbad zum abflachen. Benutzen Sie eine Pinzette, um jeden Abschnitt zu trennen.
   7. Sammeln Sie Abschnitte aus dem Wasserbad und stellen auf geladene Objektträger (siehe Tabelle der Materialien).
   8. Speichern Sie Folien in einem Dia-Rack aufrecht zu und legen Sie in einem Inkubator bei 37 ° C. Trockene Abschnitte über Nacht.
   9. Abschnitten bei Raumtemperatur auf unbestimmte Zeit für spätere Analysen zu speichern.
4. Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung der Magen Gewebe
   1. Wachsentfernung Folien mit 3 Wäschen von Xylol für jeweils 5 min, gefolgt von 3 Wäschen in 100 % Ethanol, 3 Minuten lang. Stellen Sie sicher, dass frische Lösungen in jeder Phase eingesetzt werden.
   2. Spülen Sie Folien in Leitungswasser für 30 – 60 s.
   3. Entfernen Sie überschüssiges Wasser durch leichtes Klopfen unten der Folien auf einem Papiertuch. Färben Sie mit gefilterten Hämatoxylin für mind. 3 Stellen Sie sicher, dass Abschnitte mit der Lösung ausreichend abgesichert sind.
   4. Spülen Sie Folien unter fließendem Leitungswasser bis Wasser klar ist.
   5. Tauchen Sie Folien in Scotts Leitungswasser für 8 – 10 s. Setzen Sie nicht zu der Lösung, die mehr als 10 Folien s als dies wird dunkler und intensiver Flecken führen. Färbung der Abschnitte kann unter einem Mikroskop betrachtet werden. Effiziente Färbung in dieser Phase führt zu einer "baby blue" Farbe.
      Hinweis: Bereiten Sie Scotts Leitungswasser durch 2 g Natrium-Hydrogencarbonat (Nahco3₃) und 20 g Magnesiumsulfat (MgSO₄) in 1 L destilliertem Wasser auflösen.
   6. Spülen Sie Folien in Leitungswasser für 30 – 60 s.
   7. Überschüssiges Wasser zu entfernen, wie in Schritt 3 beschrieben, und dann Flecken mit gefilterten 1 % wässrige Eosin 3 Minuten lang.
   8. Spülen Sie Folien unter fließendem Leitungswasser bis Wasser klar ist.
      Hinweis: Färbung kann bewertet werden mit einem Lichtmikroskop. Wenn Färbung zu dunkel ist, können Folien in 100 % igem Ethanol für länger als die angegebene Zeit pausiert. Wenn dunkler Färbung erforderlich ist, können Folien für 1 – 2 min. länger, bevor Sie mit weiteren Schritten fortfahren mit Eosin befleckt werden.
   9. Entwässern Sie Folien mit 3 Wäschen von 100 % Ethanol für 30 s, gefolgt von 3 Wäschen von Xylol 2 min. lang. Stellen Sie sicher, dass frische Lösungen in jeder Phase eingesetzt werden.
   10. Montieren Sie Folien mit Eindeckmedium. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmittel in der Mitte von einem sauberen deckgläschen vor sanftes Auflegen der Folie an der Spitze mit Abschnitten nach unten.
       Hinweis: Trocknen Sie Folien vor dem Deckel rutscht nicht.
   11. Folien auf eine flache Unterlage legen und an der Luft trocknen. Dias können auch in einer Dampfhaube Trocknungszeit beschleunigt getrocknet werden.
5. Giemsa Färbung der Magen Gewebe
   1. Wachsentfernung Folien mit 2 Wäschen von Histolene für jeweils 5 min, gefolgt von 2 Waschungen von 100 % Ethanol für 3 min und dann eine endgültige Wäsche in 70 % igem Ethanol für 3 min. sorgen frische Lösungen für jede Wäsche verwendet werden.
   2. Spülen Sie Folien in Leitungswasser für 30 – 60 s.
   3. Bereiten Sie Giemsa-Lösung 20 % Giemsa Fleck mit 80 % destilliertem Wasser vermischen. Färben Sie Folien mit Giemsa-Lösung für 1 h.
   4. Legen Sie die Folien in 100 mL destilliertem Wasser mit 3 – 4 Tropfen Essigsäure für 2 – 3 s.
      Hinweis: Lösung muss auch vor der Verwendung gemischt werden. In diesem Stadium sollten Folien in Farbe hellblau angezeigt werden.
   5. Waschen Sie Folien in 96 % igem Ethanol für 30 s.
   6. Waschen Sie Folien in 3 Bädern von Isopropanol für jeweils 2 min, gefolgt von 3 Bäder von Histolene für 2 min. Verwenden Sie frische Isopropanol und Histolene für jede Wäsche.
   7. Deckglas gleitet mit Montage Medium, wie oben beschrieben.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt eine orale Magensonde Technik um eines-Infektion mit H. Pylori oder H. Felis in murinen Mausmodellen (Abbildung 1) zu erreichen. Nach Euthanasie Mägen sind entfernt, gewogen und geteilt in 2 gleiche Hälften bestehend aus Antrum, Körper und nicht-Drüsen Regionen der Magen Gewebe (Abbildung 2). Nicht glanduläre Region wird entfernt, bevor Sie irgendwelche Analysen durchführen.

Erfolgre...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von einem in-Vivo -Mausmodell für Helicobacter -Infektion. Die entscheidenden Schritte des Verfahrens sind die: 1) Vorbereitung der Helicobacter Inokula, lebensfähige und bewegliche Bakterien; (2) Lieferung der entsprechenden Zahl von Bakterien an die Maus über eines-Magensonde; (3) Nachweis von bakteriellen Infektionen durch koloniezahlbestimmung und/oder PCR; und 4) Verarbeitung von Magen Gewebe ermöglichen die Beurteilung der Histopathologie in ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacteriological reagents
Oxoid Blood Agar Base No.2	Thermo Fischer Scientific	CM0271B	Dissolve in deinonized water prior to sterilization
Premium Defibrinated Horse blood	Australian Ethical Biologicals	PDHB100
Bacto Brain Heart Infusion Broth	BD Bioscience	237500	Dissolve in deinonized water prior to sterilization
CampyGen gas packs	Thermo Fischer Scientific	CN0035A/CN0025A
Histological reagents
Formalin, neutral buffered, 10%	Sigma Aldrich	HT501128
Absolute alcohol, 100% Denatured	ChemSupply	AL048-20L-P
Isopropanol (2-propanol)	Merck	100995
Xylene (sulphur free)	ChemSupply	XT003-20L
Mayer's Haematoxylin	Amber Scientific	MH-1L	Filter before use
Eosin, Aqueous Stain	Amber Scientific	EOCA-1L	Filter before use
Wright-Giemsa Stain, modified	Sigma Aldrich	WG80-2.5L	Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)
Histolene	Grale Scientific	11031/5
DPX mounting medium	VWR	1.00579.0500
Molecular biology reagents
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Thermo Fischer Scientific	Q32850
Oligonucleotides	Sigma Aldrich		The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61 °C
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8291	Kit includes 10x PCR buffer and Magnesium Chloride
dNTPs	Bioline	BIO-39028	Dilute to 10 mM in sterile nuclease free water before use
Molecular Grade Agarose	Bioline	BIO-41025
Sodium Hydrogen Carbonate	Univar (Ajax Fine Chemicals)	A475-500G
Magnesium Sulphate Heptahydrate	Chem-Supply	MA048-500G
Antibiotics
Vancomycin	Sigma Aldrich	V2002-1G	Dissolve in deionized water
Polymyxin B	Sigma Aldrich	P4932-5MU	Dissolve in deionized water
Trimethoprim (≥98% HPLC)	Sigma Aldrich	T7883	Dissolve in 100% (absolute) Ethanol
Amphotericin	Amresco (Astral Scientific)	E437-100MG	Dissolve in deionized water
Bacitracin from Bacillus licheniformis	Sigma Aldrich	B0125	Dissolve in deionized water
Naladixic acid	Sigma Aldrich	N8878	Dissolve in deionized water
Other reagents
Methoxyflurane (Pentrhox)	Medical Developments International	Not applicable
Paraffin Wax	Paraplast Plus, Leica Biosystems	39601006
Equipment and plasticware
Oxoid Anaerobic Jars	Thermo Fischer Scientific	HP0011/HP0031
COPAN Pasteur Pipettes	Interpath Services	200CS01
Eppendorf 5810R centrifuge			Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4 °C
23 g precision glide needle	BD Bioscience	301805
Parafilm M	Bemis, VWR	PM996
Portex fine bore polythene tubing	Smiths Medical	800/100/200
Plastic feeding catheters	Instech  Laboratories	FTP20-30
1 mL tuberculin luer slip disposable syringes	BD Bioscience	302100
Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes	Sigma Aldrich	Z317314	Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization
GentleMACs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue
M Tubes (orange cap)	Miltenyi Biotec	30-093-236
Qubit Fluorometer	Thermo Fischer Scientific	Q33216
Sterile plastic loop	LabServ	LBSLP7202
Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System	Leica Biosystems	Not applicable
Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6	Sakura, Alphen aan den Rijn	4124
Tissue-Tek III Uni-Casette System	Sakura, Alphen aan den Rijn	4170
Microtome, Leica RM2235	Leica Biosystems
Charged SuperFrost Plus glass slides	Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific	4951PLUS4