Eine geschlossen Kasten Modell quer Aortenstenose Verengung bei Mäusen zu induzieren

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll der transversalen Aortenstenose Verengung (TAC) über eine laterale Thorakotomie. Diese Technik ist ein minimal-invasive, geschlossenen Brust chirurgischer Eingriff mit dem Ziel, drucküberlastung und Herzinsuffizienz bei Mäusen unter Verwendung der Standardeinstellungen TAC-Labor zu simulieren.

Zusammenfassung

Forschung auf Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz basiert häufig auf Druck Überladung Mausmodellen induziert durch TAC. Das Standardverfahren ist eine partielle Thorakotomie zu visualisieren, die quer Aortenbogen durchzuführen. Allerdings ändert das chirurgische Trauma verursacht durch die Thorakotomie in offenen Brust Modelle die Atmungsphysiologie wie die Rippen werden seziert und verließ nach Brust Schließung ungebunden. Um dies zu verhindern, haben wir einen minimal-invasiven, geschlossenen Brust Ansatz über laterale Thorakotomie gegründet. Hier nähern wir uns der Aortenbogen über den 2^Nd intercostalneuralgie Space ohne Eingabe der Brust Hohlräume, verlassen die Maus mit einer weniger traumatischen Verletzung zur Wiederherstellung. Wir führen diese Operation mit standard-Labor-Einstellungen für offenen Brustkorb TAC Verfahren mit gleichen Überlebensraten. Neben der Aufrechterhaltung der physiologischen Atemmustern aufgrund der geschlossenen Brust Ansatz, scheinen die Mäuse zeigen rasche Erholung profitieren, da die weniger invasive Technik, einen schnellen Heilungsprozess zu erleichtern und Immunantwort nach Trauma zu reduzieren scheint.

Einleitung

Maus-Modellen werden oft zur menschlichen Krankheiten¹zu imitieren. Transversale Aortenstenose Verengung (TAC) wird verwendet, um drucküberlastung induzieren und linke ventricular Hypertrophie². Das offene Brust TAC-Modell bei Mäusen wurde von Rockman Et Al. bestätigt. ³ und den chirurgischen Eingriff wird ausführlich beschrieben, von DeAlmeida Et al. ⁴. Banding der transversalen Aorta ist günstiger im Vergleich zur abdominalen Aorta Verengung, denn ein größerer Teil des Umlaufs negative Auswirkungen dieser letztgenannte Vorgehensweise²ausgleichen kann.

Die Streifenbildung der transversalen Aorta führt zu einer erhöhten arteriellen Druck in der aufsteigenden Aorta und Brachiocephalic Arterie aber verlässt ausreichende Durchblutung der Organe über die distalen Gefäße (d. h. die linke gemeinsame Halsschlagader der linken subclavia Arterie, und absteigende Aorta). Dies führt zu eine erhöhte kardiale Nachlast und einer erhöhten Herzwand Stress. Der Wand Stress sinkt anschließend durch Faser Verdickung⁵. Die chronische Änderung der kardialen Hämodynamik Ergebnisse in Wirtschaft und Dilatation des linken Ventrikels. Auf diese Weise die TAC schafft ein reproduzierbares Modell Herzhypertrophie führt schließlich zu einer Herzinsuffizienz.

Das Standardverfahren zur TAC wie von DeAlmeide Et Al. beschrieben ⁴ Ansätze der Aortenbogen über eine partielle obere Thorakotomie über Dissektion der Rippen oder dem Brustbein und betreten das Mediastinum sowie den pleural Raum. Dies ermöglicht eine gute Sicht auf den Aortenbogen und seiner Seitenäste. Leider können nicht sezierten Rippen angesetzt werden, die lässt sie frei schwebend und damit eine Veränderung der Atmung Dynamik.

Wir, errichtete daher, eine minimal-invasive geschlossen-Brust Herangehensweise an den Aortenbogen mit einem seitlichen chirurgischen Ansatz über den 2^Nd intercostalneuralgie Space. Der größte Vorteil dieses Modells ist die Fähigkeit, TAC auch spanlos durch die Rippen durchzuführen. Das chirurgische Trauma beschränkt sich auf den Einschnitt der Haut und das Sezieren von den Zwischenrippenmuskeln. Dieses Verfahren minimiert das Trauma selbst und hilft, um angemessene Brust Stabilität zu erhalten.

Hier beschreiben wir eine detaillierte schrittweise Prozedur zum TAC bei Mäusen operieren ohne die Summe oder der oberen Thorakotomie. Hochfrequenz-Doppler wurde verwendet, um sicherzustellen, dass der Erfolg der TAC ^6,7wie oben beschrieben.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde von der Ethikkommission für Tier Experimente LANUV Recklinghausen (#84-02.04.2016.A374) genehmigt. In der Regel ist dieser Vorgang an Erwachsenen Mäusen > 10 Wochen alt. Jedoch ist es möglich, diese Operation auf jüngere Tiere sowie durchführen. Chirurgische Instrumente müssen vor Gebrauch sterilisiert werden und alle Schritte sind unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden.

1. Induktion der Anästhesie und Intubation

1. Buprenorphin 0,1 µg/g Körpergewicht intraperitoneal zur Schmerzlinderung zu injizieren. Wiederholen Sie die intraperitonealen Injektionen von Buprenorphin 0,1 mg/kg alle 8 h für die nächsten drei Tage nach der Operation.
2. Platzieren Sie für die Induktion den Mauszeiger in eine Anästhesie-Induktion-Box, die mit dem Verdampfer legen auf 3,0 Vol% Isofluran mit einer Sauerstoff-Flow von 1 L/min verbunden ist.
3. Tiefe Narkose durch Induktion eine taktile Anregung zu gewährleisten.
   Hinweis: Erhöhung der Vol% Isofluran bis zu 5 %, wenn nicht Induktion der Anästhesie oder Narkose nicht tief genug ist.
4. Drücken Sie Ende der Maus reflex Abwesenheit sicherzustellen. Im Falle einer vollständigen Fehlen von Reflexen, wiegen die Maus für optimale Ventilator-Setup (siehe 1.12).
5. Bewegen Sie die Maus auf eine temperaturgeführte OP-Tisch eine Körpertemperatur von 37 ° C während des Verfahrens.
6. Legen Sie die Nase der Maus in einem Kunststoff Kegel an die Anästhesie Induktion Box weiterhin Narkose angeschlossen ist.
7. Befestigen Sie die oberen Schneidezähne der Maus mit einer Nylon-Naht. Die Extremitäten mit einem Klebeband zu fixieren.
8. Üben Sie Druck auf die Hinterpfote mit der Spitze der Zange um eine ausreichende Narkose wieder zu gewährleisten. In Ermangelung eines Rückzugs Reflex mit den folgenden Schritten fortfahren.
   Hinweis: Volumen % Isofluran zu erhöhen, wenn nicht Induktion der Anästhesie oder Narkose nicht tief genug ist und warten auf das Fehlen der Reflex-Entzug.
9. Legen Sie ophthalmologische steriles Gleitmittel auf die Hornhaut zu verhindern Austrocknung in Narkose.
10. Schmieren Sie die rektale Sonde um rektale Trauma zu vermeiden. Führen Sie eine rektale Temperatursonde dafür eine Kerntemperatur von 37 ° C.
11. Enthaaren Sie am Hals und oberen Brustbereich mit Enthaarungscreme gemäß den Anweisungen des Herstellers. Wischen Sie die Creme nach 1 min. Falls erforderlich, wiederholen Sie diesen Schritt erst erfolgreich.
    Hinweis: Verwenden Sie Baumwolle Spitze Tupfer im Falle von Blutungen.
12. Reinigen Sie den enthaarten Bereich mit 70 % Ethanol. Wenden Sie dann Povidon-Jod für lokalen hautdesinfektion 3 Mal und mindestens 3 Minuten lang.
13. Einstellungen Sie Ventilator-auf physiologische Parameter. Legen Sie die Atemfrequenz auf 150/min und Atemzugvolumina auf 8-10 µL/g Körpergewicht (BW).
14. Ein neues Paar sterile Handschuhe anziehen. Platzieren Sie den Mauszeiger unter einem Operationsmikroskop und legen Sie ein steriles gefenstert Tuch über die Maus.
15. Die Haut an der Mittellinie etwa 3 mm unter den Unterkiefer auf der 2^Nd Rippe einzuschneiden. Mittellinie und Bindegewebe der mandibulären Drüse zu identifizieren. Verwenden Sie abgewinkelte intrakapsuläre Zange, um sanft Teilen der Drüse an der Mittellinie unverblümt mit zwei Pinzetten und erkunden die Trachealkanüle Muskel.
16. Bereiten Sie die Luftröhre sanft durch Auseinanderziehen der Para-trachealen Muskeln unverblümt mit intrakapsuläre Zangen.
17. Ziehen Sie auf der Zunge, mit der Pinzette die Kehle für einfacher Intubation Bedingungen zu begradigen und sanft einfügen eine Intubation Kanüle (OD 1,2 mm) in die Luftröhre. Bestätigen Sie die Intubation durch direkte Visualisierung des Schlauches in die Luftröhre und Überprüfung auf korrekte Brust Bewegung.
18. Passen Sie die Isofluran-Konzentration nach Intubation, 2 % Isofluran mit einem Fluss von 1,0 L/min und 100 % O₂.
    Hinweis: Wenn Atmung Bewegungen nicht aufhören oder Mäuse bewegen beginnen, zuerst erhöhen Sie die Atemfrequenz bis 180/min. Wenn nötig, erhöhen Sie die Isofluran-Konzentration bis zu 3,5 % Sekundär bis die Maus aufhört zu atmen auf eigene. Leckagen oder unzureichende Füllung des Verdampfers zu bewerten, als die am häufigsten auftretenden Probleme.
19. Alternativ führen Sie Intubation wie vorgeschlagen in den folgenden Sub-Schritten.
    1. Positionieren Sie den Mauszeiger auf einem Tisch in einem Winkel von 60°.
    2. Die Extremitäten der Maus mit Klebeband zu fixieren und den Kopf zurücklehnen.
    3. Legen Sie eine Kaltlichtquelle direkt auf der Haut oberhalb des Kehlkopfes.
    4. Ziehen Sie die Zunge vorsichtig mit Zangen, die Stimmbänder zu visualisieren.
    5. Setzen Sie ein Kunststoffrohr eine IV-Kanüle (24 G) durch die Stimmbänder und schließen Sie die ventilatoreinstellungen das Kunststoffrohr.
    6. Verbinden Sie den Ventilator an der Kanüle, Intubation durch Synchrone Brust Bewegungen zu bestätigen.
       Hinweis: Wenn Atmung Bewegungen nicht aufhören oder Mäuse bewegen beginnen, zuerst die Atemfrequenz bis zu 180 / Min. erhöht. Wenn nötig, Sekundär erhöhen Sie Isofluran Konzentration bis zu 3,5 % bis die Maus aufhört zu atmen auf eigene. Leckagen oder unzureichende Füllung des Verdampfers zu bewerten, als die am wahrscheinlichsten Probleme.

2. präoperative Doppler-Messung

1. Bereiten Sie beide Halsschlagadern welche Laien Ergänzung zur Trachea durch vorsichtig Auseinanderziehen des Bindegewebes mit der Pinzette.
2. Setzen Sie die Spitze der 20 MHz-Doppler-Sonde mit einigen steril Ultraschallgel auf der rechten und der linken Arteria carotis bei einem Winkel von weniger als 45°.
3. Drehen Sie langsam die Sonde zu bewegen es lateralen und medialen zu finden ein Doppler-Signal und kippen Sie die Sonde um das Signal zu optimieren.
4. Verwenden Sie eine Doppler-Software zur Anzeige und Strömungsgeschwindigkeiten in die rechten und linken gemeinsame Halsschlagadern auf einem Computer zu speichern.

(3) Thorakotomie

1. Verwenden Sie eine Reihe von sterile Handschuhe für jede einzelne Maus Operationsstelle Infektionen zu verhindern.
2. Der Hautschnitt bis zu den 2^Nd intercostalneuralgie Raum mit einer Schere zu erweitern.
3. Identifizieren des 2^Nd intercostalneuralgie Raumes visuell durch die Rippen zählen und dann unverblümt Eindringen dieses Raumes mit intrakapsuläre Zangen.
   Hinweis: Die 1^St Rippe befindet sich unterhalb des Schlüsselbeins und ist daher nicht sichtbar, da die 2^Nd intercostalneuralgie Raum zwischen erste sichtbare Rippe (d.h. 2^Nd Rippe) und die 3^rd Rippe gefunden wird.
4. Freifläche der 2^Nd intercostalneuralgie mit Hilfe der Zange Tipps und legen Sie die Retraktoren.
5. Passen Sie die Retraktoren mit einem Gummiband befestigt auf dem OP-Tisch, einen klaren Blick des Thymus.
6. Im Falle von Blutungen mit einem Wattestäbchen und auf die oberflächlichen Gefäße für 2 min bestätigen.

(4) Streifenbildung der Aorta quer

1. Passen Sie die Vergrößerung auf 200 %, Mittellinie und Bindegewebe zu identifizieren. Verwenden Sie abgewinkelte Zange, um die Thymusdrüse sanft teilen. Fettgewebe zu entfernen, bis der Aortenbogen deutlich zu erkennen.
2. Bereiten Sie einen Tunnel mit abgewinkelt binden Zange unter der transversalen Aorta zwischen die Brachiocephalic Arterie und linke gemeinsame Halsschlagader (siehe Abbildung 1). Halten Sie das Ende einer 6,0 Naht mit Hilfe von feinen Pinzette und führen Sie den Faden unter dem Aortenbogen.
3. Nehmen Sie den Faden mit der zweiten Zange von der anderen Seite des Bogens.
4. Schneiden Sie ein 3 mm langes Stücklänge eines 27 g mit der Nadel als ein Abstandhalter für TAC-Ligatur für Mäuse mit einem Gewicht zwischen 19-25 g Körpergewicht und einer 26 G-Nadel als Abstandshalter für Mäuse > 25 g BW.
5. Legen Sie das Distanzstück vorsichtig parallel zur Aorta quer.
6. Bereiten ein lose doppelknoten auf die Abstandhalter und sorgen für optimale Platzierung des Abstandhalters parallel zu der Aorta. Binden Sie dann des ersten Wurfs und führen Sie schnell eine zweite entgegen zu werfen. Entfernen Sie das Distanzstück umgehend.
7. Um Schein-Mäuse für Kontrolle durchzuführen, folgen Sie das gleiche Protokoll weglassen der Ligatur der Aorta.
8. Schließen Sie den 2^Nd intercostalneuralgie Raum mit einer 6,0 Polypropylen Naht. Besonderes Augenmerk auf die subclavian Behälter bei der Ligation.
9. Naht der Haut mit einer 6,0 Polypropylen Naht in einem kontinuierlichen Naht Muster.

5. Bestätigung des erfolgreichen Unterbindung der Aorta quer

1. Platzieren Sie ein 20-MHz-Doppler-Sonde auf beiden Seiten des Halses in einem 45°-Winkel wie in Abschnitt 2.
2. Dokumentieren Sie die Strömungsgeschwindigkeiten auf jeder Seite.
   Hinweis: Eine erfolgreiche TAC kann durch Doppler Strömungsgeschwindigkeit validiert werden, wie in Abbildung 2dargestellt. Eine Geschwindigkeit Verhältnis von 4-10 zwischen der rechten und linken Halsschlagader in der Regel garantiert ausreichende TAC (siehe Abbildung 2).

6. Herz-Ernte

1. Narkose nach Schritte 1.2 zu induzieren. und 1.3.
2. Platzieren Sie den Mauszeiger in einer Euthanasie-Kammer und passen Sie die Kohlendioxid-Durchflussmenge um 10-30 % der Lautstärke/Minute zu verdrängen.
3. Fixieren Sie die Maus auf einem OP-Tisch. Öffnen Sie den Bauch mit Schere und Ernte Blut aus der minderwertigen Vena Cava mit einer Kanüle zur weiteren Analyse.
4. Schneiden Sie das Zwerchfell und das Brustbein mit starken Schere und entfernen Sie das Herz.
5. Entfernen Sie alle arteriellen und Bindegewebe vor dem Wiegen der Herzen.
6. Trennen Sie den rechten Ventrikel und das Septum aus dem linken Ventrikel und wiegen Sie beide Proben.
7. Beide Gewebeproben in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Ergebnisse

Eine erfolgreiche TAC garantiert die Induktion der drucküberlastung und linke ventricular Hypertrophie. Eine ad-hoc-Validierung der drucküberlastung lässt sich mit Doppler Messung von Geschwindigkeit, wie in Abbildung 2dargestellt. Während präoperative Blut Strömungsgeschwindigkeit in beide Halsschlagadern entspricht, TAC bewirkt, dass eine erweiterte Blut-Geschwindigkeit in der rechten Halsschlagader durch erhöhten Druck im linken Ventrikel und Aorta ...

Diskussion

Die schnelle einsetzende Bluthochdruck durch TAC unterscheidet sich von klinisch relevanten Hypertrophie durch Aortenstenose oder Bluthochdruck verursacht. Dennoch die Verwendung kleiner Tiermodelle Herzinsuffizienz induzieren hat viele Vorteile und daher viele Ermittler¹¹gewählt. Diese geschlossenen Kasten-Modell verbessert die bereits bestehenden Modelle der chirurgischen Technik quer Aortenstenose Verengung in Mäusen⁴induzieren.

Die wichtigs...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pressure-volume catheter	Millar Instruments, USA	SPR-839
Mouse ventilator	Harvard Apparatus GmbH, Germany	Minivent - TYPE 845
Mouse ventilator	Harvard Apparatus GmbH, Germany	Y-connection with intubation cannula OD 1.2mm 73-2844
Vaporizer	Dräger Medical AG&CO.KG, Germany	19.3 Isofluran-Vaporizer (a newer version is available under catalog number  D-877-2010)
Microscope	Leica Microsystems, Germany	MZ 7.5
Light source	Schott AG, Germany	KL 1500 LCD
6-0 Prolene	Ethicon, USA	Polypropylene suture BV-1 9.3 mm 3/8c	suture for surgery
Seraflex	Serag Wiessner, Germany	USP 5/0 schwarz;  IC108000	suture for constriction
Homoeothermic Controlled Operating Tables	Harvard Apparatus GmbH, Germany	Typ 872/3 HT with tripod stand and homoeothermic controller Type 874; 73-4233
Flexible Rectal Probe	Harvard Apparatus GmbH, Germany	1.6 mm OD; 55-7021
Doppler Signal Visualisation Instrument	Indus Instruments, USA	Doppler Signal Processing Workstation (DSWP) with 20MHz Pulsed Doppler Module
Arruga Intracapsular Forceps	Altomed, UK	A5400
Doppler Probe	Indus Instruments, USA	20MHz Tubing-mounted Probe
Jaffe Lid Retractor	Altomed, UK	A3513