Un modello chiuso-cassa per indurre costrizione trasversale aortica in topi

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo di costrizione trasversale aortica (TAC) tramite un thoracotomy laterale. Questa tecnica è una procedura chirurgica mini-invasiva, chiuso il petto con l'obiettivo di simulare sovraccarico pressorio e insufficienza cardiaca nei topi utilizzando le impostazioni standard di Laboratorio TAC.

Abstract

Ricerca sull'ipertrofia cardiaca e scompenso cardiaco spesso si basa su modelli murini di sovraccarico pressione indotte dalla TAC. La procedura standard consiste nell'eseguire un thoracotomy parziale per visualizzare l'arco aortico trasversale. Tuttavia, il trauma chirurgico causato dal thoracotomy aperto petto modelli cambia la fisiologia respiratoria come le costole sono sezionate e lasciare scollegate dopo chiusura sul petto. Per evitare questo, abbiamo stabilito un approccio minimamente invasivo, chiuso il petto via il thoracotomy laterale. Qui ci avviciniamo l'arco aortico tramite lo spazio intercostale 2^nd senza entrare nella cavità toracica, lasciando il mouse con una lesione meno traumatica per recuperare da. Eseguiamo questa operazione utilizzando le impostazioni standard del laboratorio per le procedure di petto aperto TAC con tassi di sopravvivenza uguale. Oltre a mantenere la fisiologica respirazione grazie all'approccio di cassa chiusa, i topi sembrano trarre giovamento mostrando rapido recupero, come la tecnica meno invasiva appare per facilitare un rapido processo di guarigione e di ridurre la risposta immunitaria dopo il trauma.

Introduzione

Modelli murini sono spesso utilizzati per simulare malattie umane¹. Restringimento aortico trasversa (TAC) viene utilizzato per indurre sovraccarico pressorio e ipertrofia ventricolare sinistra². Il modello di TAC del aperto petto nei topi è stato convalidato da Rockman et al. ³ e la procedura chirurgica è descritta in dettaglio da DeAlmeida et al. ⁴. Banding dell'aorta trasversa è più favorevole rispetto al restringimento aortico addominale perché una porzione maggiore della circolazione in grado di compensare gli effetti negativi di questo di quest'ultima procedura².

Le bande dell'aorta trasversa conduce ad un aumento della pressione arteriosa nell'aorta ascendente e dell'arteria brachiocefalica ma lascia sufficiente perfusione degli organi attraverso i vasi distali (cioè l'arteria carotide comune sinistra, la succlavia sinistra arteria e dell'aorta discendente). Questo porta ad un aumento del afterload cardiaco e uno stress di parete cardiaca elevata. Lo stress di parete successivamente diminuisce a causa della fibra ispessimento⁵. La variazione emodinamica cardiaca cronica provoca maladaptation e dilatazione del ventricolo sinistro. In questo modo la TAC crea un modello riproducibile dell'ipertrofia cardiaca alla fine che conducono all'infarto.

La procedura standard per TAC come descritto da DeAlmeide et al. ⁴ si avvicina l'arco aortico tramite un thoracotomy superiore parziale tramite dissezione delle costole o dello sterno ed entrando il mediastino, come pure la cavità pleurica. Ciò consente una buona vista dell'arco aortico e suoi rami collaterali. Purtroppo, non è possibile riassociare le costole dissecate, che li lascia galleggiare liberamente e alterando così le dinamiche di respirazione.

Abbiamo, pertanto, stabilire un approccio mini-invasivo di chiuso-cassa per l'arco aortico usando un approccio chirurgico laterale via lo spazio intercostale 2^nd . Il grande vantaggio di questo modello è la possibilità di eseguire TAC senza taglio uniforme attraverso le costole. Il trauma chirurgico è limitato per l'incisione della pelle e la dissezione dei muscoli intercostali. Questa procedura riduce al minimo il trauma stesso e aiuta a mantenere la stabilità della cassa adeguata.

Qui descriviamo una descrizione dettagliata della procedura per eseguire un intervento chirurgico di TAC nei topi senza eseguire il totale o la toracotomia superiore. Ad alta frequenza Doppler è stato utilizzato per garantire che il successo della TAC come precedentemente descritto ^6,7.

Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dal comitato etico per la sperimentazione animale LANUV Recklinghausen (n. 84-02.04.2016.A374). Generalmente, questa procedura è eseguita su topi adulti > 10 settimane dell'età. Tuttavia, è possibile eseguire questo intervento chirurgico su anche gli animali più giovani. Strumenti chirurgici devono essere sterilizzati prima dell'uso e tutti i passaggi devono essere eseguiti in condizioni asettiche.

1. induzione dell'anestesia e l'intubazione

1. Iniettare buprenorfina 0,1 µ g/g di peso corporeo per via intraperitoneale per sollievo dal dolore. Ripetere le iniezioni intraperitoneali di buprenorfina 0,1 mg/kg ogni 8 h per i prossimi tre giorni dopo la chirurgia.
2. Per induzione, posizionare il mouse in una scatola di induzione di anestesia che è collegata al vaporizzatore al 3,0% Vol di isoflurane con un flusso di ossigeno di 1 L/min.
3. Garantire la narcosi profonda inducendo uno stimolo tattile.
   Nota: Aumento Vol % di isoflurane fino al 5%, se non riesce ad induzione di anestesia o narcosi non è abbastanza profonda.
4. Pizzicare la coda del mouse per assicurare l'assenza di riflesso. In caso di completa assenza di riflessi, pesare il mouse per l'installazione ottimale del ventilatore (v 1.12).
5. Spostare il mouse a una tabella di funzionamento temperatura controllata per mantenere una temperatura corporea di 37 ° C durante tutta la procedura.
6. Posto il naso del mouse in un cono di plastica che è collegato alla scatola di induzione dell'anestesia per mantenere la narcosi.
7. Difficoltà gli incisivi superiori del mouse con una sutura in nylon. Fissare le estremità con un nastro adesivo.
8. Applicare pressione sulla zampa posteriore con la punta delle pinze per garantire un'adeguata narcosi nuovamente. In assenza di un riflesso di ritiro procedere con i passaggi seguenti.
   Nota: Aumentare volume % di isoflurane se non riesce ad induzione di anestesia o narcosi non è abbastanza profonda e attendere per l'assenza del riflesso del ritiro.
9. Posto sterile oftalmica lubrificante sulle cornee per evitare essiccazione sotto anestesia.
10. Lubrificare la sonda rettale per evitare trauma rettale. Inserire una sonda rettale temperatura per garantire una temperatura di 37 ° C.
11. Depilare la gola e la parte superiore del torace con la crema depilatoria secondo le istruzioni del produttore. Togliere la crema dopo 1 min. Se necessario, ripetere questo passaggio fino a quando è successo.
    Nota: Usare tamponi con punta di cotone in caso di sanguinamento.
12. Pulire la zona Depilata con etanolo al 70%. Quindi applicare povidone-iodio per la disinfezione della pelle locale 3 volte e per almeno 3 min.
13. Regolare le impostazioni del ventilatore di parametri fisiologici. Impostare la frequenza respiratoria a 150/min e volumi correnti per peso corporeo di 8-10 µ l/g (BW).
14. Mettere su un nuovo paio di guanti sterili. Posizionare il mouse sotto un microscopio chirurgico e posizionare un telino sterile fenestrato sopra il mouse.
15. Incidere la pelle in corrispondenza della linea mediana di circa 3 mm sotto la mandibola giù la nervatura 2^nd . Identificare la linea mediana e dei tessuti connettivi della ghiandola sottomandibolare. Quindi utilizzare forcipe intracapsular angolato delicatamente dividere la ghiandola al midline senza mezzi termini con due pinze ed esplorare il muscolo trachea.
16. Preparare la trachea delicatamente tirando i muscoli para-tracheale senza mezzi termini con il forcipe intracapsular.
17. Tirare la linguetta con il forcipe per raddrizzare la gola per più facili condizioni di intubazione e inserire delicatamente una cannula di intubazione (OD 1.2 mm) all'interno della trachea. Confermare l'intubazione con visualizzazione diretta del tubo all'interno della trachea e verificando per il movimento di cassa adeguato.
18. Regolare la concentrazione di isoflurane dopo intubazione per isoflurano 2% con un flusso di 1,0 L/min e 100% O₂.
    Nota: Se non smettere di movimenti respiratori o topi iniziano a muoversi, prima di aumentare la frequenza respiratoria fino a 180/min. Se necessario, aumentare la concentrazione di isoflurane fino a 3,5% secondariamente fino a quando il mouse smette di respirare autonomamente. Valutare le perdite o inadeguato riempimento del vaporizzatore come i problemi più comuni.
19. In alternativa, eseguire l'intubazione come suggerito nei passaggi seguenti sub.
    1. Posizionare il mouse su un tavolo in un angolo di 60°.
    2. Fissare le estremità del mouse con il nastro adesivo e reclinare la testa.
    3. Posizionare una fonte di luce fredda direttamente sulla pelle sopra la laringe.
    4. Tirare delicatamente la linguetta con il forcipe per visualizzare le corde vocali.
    5. Inserire un tubo di plastica di un IV-cannula (24 G) attraverso le corde vocali e collegare il tubo di plastica per le impostazioni del ventilatore.
    6. Collegare il ventilatore alla cannula per confermare l'intubazione da movimenti di cassa synchrone.
       Nota: Se non smettere di movimenti respiratori o topi iniziano a muoversi, prima di aumentare la frequenza respiratoria fino a 180 / min. Se necessario, aumentare secondariamente la concentrazione di isoflurane fino a 3.5% fino a quando il mouse smette di respirare autonomamente. Valutare fuoriuscite o inadeguato riempimento del vaporizzatore come i problemi più probabili.

2. preoperative Doppler misura

1. Preparare entrambe le arterie carotiche che laico aggiunta alla trachea tirando delicatamente il tessuto connettivo con il forcipe.
2. Posizionare la punta della sonda MHz Doppler 20 con alcuni gel per ultrasuoni sterile sulla destra e l'arteria carotide sinistra presso un angolo inferiore a 45°.
3. Ruotare lentamente la sonda per spostarlo laterale e mediale per trovare un segnale Doppler ed inclinare la sonda per ottimizzare il segnale.
4. Utilizzare un software di Doppler per visualizzare e memorizzare le velocità di flusso nelle arterie carotiche comuni destra e sinistra su un computer.

3. toracotomia

1. Utilizzare un set di guanti sterili per ogni mouse individuali per prevenire le infezioni del sito chirurgico.
2. Espandere l'incisione della pelle verso il basso per lo spazio intercostale 2^nd con una forbice.
3. Identificare visivamente lo spazio intercostale 2^nd contando le costole e poi penetrare senza mezzi termini questo spazio con il forcipe intracapsular.
   Nota: La 1 costola^st si trova sotto la clavicola e non è quindi visibile perché lo spazio intercostale 2^nd è stato trovato tra primo visibile (cioè 2^nd costola) e le costole di 3^rd .
4. Aprire lo spazio intercostale 2^nd con l'aiuto di pinze suggerimenti e inserire i divaricatori.
5. Regolare i riavvolgitori con una band di gomma attaccato al tavolo operatorio per avere una visione chiara del timo.
6. In caso di sanguinamento utilizzare una punta di cotone e premere sui vasi superficiali per 2 min.

4. la fascia dell'Aorta trasversa

1. Regolare l'ingrandimento al 200% per identificare la linea mediana e tessuti connettivi. Quindi utilizzare forcipe angolato per dividere delicatamente il timo. Rimuovere il tessuto adiposo fino a quando l'arco aortico può essere visto chiaramente.
2. Preparare un tunnel con angolato legatura forcipe sotto l'aorta trasversa tra l'arteria brachiocefalica e l'arteria carotica comune di sinistra (Vedi Figura 1). Tenere l'estremità di una sutura 6.0 con l'aiuto di una pinzetta e passare il filo sotto l'arco aortico.
3. Prendere il filo con il forcipe secondo da altro lato dell'arco.
4. Tagliato a una lunghezza di 3 mm lungo pezzo di un 27 G di usare l'ago come un distanziatore per TAC-legatura per topi pesano fra 19-25 g del peso corporeo e un ago da 26 G come un distanziatore per topi > 25 g BW.
5. Posizionare il distanziale parallelo all'aorta trasversa.
6. Preparare un doppio nodo sciolto sul distanziatore e garantire un posizionamento ottimale del distanziatore in parallelo all'aorta. Poi legare il primo tiro ed eseguire rapidamente un secondo tiro al contrario. Rimuovere il distanziale prontamente.
7. Per eseguire sham topi per controllo, seguire lo stesso protocollo omettendo la legatura della aorta.
8. Chiudere lo spazio intercostale 2^nd con una sutura in polipropilene 6.0. Prestare particolare attenzione ai vasi subclavian quando legando.
9. Suturare la pelle utilizzando una sutura in polipropilene 6.0 in un modello di sutura continua.

5. conferma della riuscita legatura dell'Aorta trasversa

1. Inserire una sonda MHz Doppler 20 su entrambi i lati del collo ad un angolo di 45° come in sezione 2.
2. La velocità di flusso su ogni lato del documento.
   Nota: Un successo TAC possa essere convalidato dalla velocità di flusso di Doppler come mostrato nella Figura 2. Un rapporto di velocità di flusso di 4-10 tra destra e sinistra arteria carotica solitamente garantisce adeguata TAC (Vedi Figura 2).

6. raccolta di cuore

1. Indurre la narcosi secondo passi 1.2. e 1.3.
2. Posizionare il mouse in un'aula di eutanasia e regolare la portata di anidride carbonica per spostare 10-30% del volume/minuto.
3. Fissare il mouse su una tabella di chirurgia. Aprire l'addome con forbici e raccolto il sangue dalla vena cava inferiore con una cannula per ulteriori analisi.
4. Tagliare il diaframma e l'osso sternale con forbici forte e togliere il cuore.
5. Rimuovere tutti i arterioso e del tessuto connettivo prima della pesatura del cuore.
6. Separare il ventricolo destro e il setto dal ventricolo sinistro e pesano entrambi i campioni.
7. Congelare entrambi campioni di tessuto in azoto liquido.

Risultati

Un TAC successo garantisce l'induzione di sovraccarico di pressione e l'ipertrofia ventricolare sinistra. Una validazione ad hoc di sovraccarico di pressione può essere raggiunto utilizzando la misura della velocità di flusso di Doppler come mostrato nella Figura 2. Mentre la velocità del flusso sanguigno preoperatoria è uguale in entrambe le arterie carotiche, TAC provoca una velocità aumentata di sangue nell'arteria carotica di destra a causa della ele...

Discussione

La rapida comparsa di ipertensione dovuto TAC differisce dall'ipertrofia clinicamente rilevante causato da stenosi aortica o ipertensione. Tuttavia, l'uso di piccoli modelli animali per indurre insufficienza cardiaca ha molti vantaggi ed è, pertanto, scelto da molti investigatori¹¹. Questo modello di petto chiuso migliora i modelli già esistenti della tecnica chirurgica per indurre costrizione trasversale aortica in topi⁴.

La fase più critica ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pressure-volume catheter	Millar Instruments, USA	SPR-839
Mouse ventilator	Harvard Apparatus GmbH, Germany	Minivent - TYPE 845
Mouse ventilator	Harvard Apparatus GmbH, Germany	Y-connection with intubation cannula OD 1.2mm 73-2844
Vaporizer	Dräger Medical AG&CO.KG, Germany	19.3 Isofluran-Vaporizer (a newer version is available under catalog number  D-877-2010)
Microscope	Leica Microsystems, Germany	MZ 7.5
Light source	Schott AG, Germany	KL 1500 LCD
6-0 Prolene	Ethicon, USA	Polypropylene suture BV-1 9.3 mm 3/8c	suture for surgery
Seraflex	Serag Wiessner, Germany	USP 5/0 schwarz;  IC108000	suture for constriction
Homoeothermic Controlled Operating Tables	Harvard Apparatus GmbH, Germany	Typ 872/3 HT with tripod stand and homoeothermic controller Type 874; 73-4233
Flexible Rectal Probe	Harvard Apparatus GmbH, Germany	1.6 mm OD; 55-7021
Doppler Signal Visualisation Instrument	Indus Instruments, USA	Doppler Signal Processing Workstation (DSWP) with 20MHz Pulsed Doppler Module
Arruga Intracapsular Forceps	Altomed, UK	A5400
Doppler Probe	Indus Instruments, USA	20MHz Tubing-mounted Probe
Jaffe Lid Retractor	Altomed, UK	A3513