Beurteilung der lysosomalen Alkalisierung in den Darm von Leben Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

Eine schrittweise Anleitung zum Verlust der lysosomalen Säure im Darm von C. Elegans mit der pH-Sensitive vital Farbstoff 6 - Carboxy - 2', 7'-dichlorofluoresceins Diacetat (cDCFDA) Sonde

Zusammenfassung

Der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) ist ein Modell, das häufig verwendet wird, um Langlebigkeit und Entwicklungsstörungen Wege zu studieren. Solche Studien werden erleichtert durch die Transparenz des Tieres, die Fähigkeit, weiterleiten und umkehren, genetische Tests, die relative Leichtigkeit der Generierung von eindringmittel markierte Proteine und die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen, die entweder in den frühen mikroinjiziert werden können Embryo oder integriert in seine Nahrung (E. Coli -Stamm OP50) zellulare Organellen (z.B. 9-Diethylamino-5 H-Benzo (a) Phenoxazine-5-1 und (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) Methylidene]-2 H-Pyrrol-5-Yl-KappaN} - N - beschriften [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Hier präsentieren wir Ihnen die Verwendung von einem pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff, der Darm Lysosomen Flecken bietet eine visuelle Auslesen der dynamischen, physiologische Veränderungen in lysosomalen Säure im Leben Würmer. Dieses Protokoll misst nicht lysosomale pH-Wert, sondern vielmehr soll eine zuverlässige Methode zur Beurteilung relevanten physiologischen Variationen in lysosomalen Säure. cDCFDA ist eine Zelle-permeationsfähigen Substanz, die in den fluoreszierenden Fluorophor 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) nach Hydrolyse von intrazellulären Esterasen umgewandelt wird. Protonierung in Lysosomen fallen cDCF in diese Organellen, wo es sich ansammelt. Aufgrund seiner niedrigen pKa von 4,8 wurde dieser Farbstoff als pH-Sensor in der Hefe verwendet. Hier beschreiben wir die Verwendung von cDCFDA als Nahrungsergänzungsmittel zu beurteilen, den Säuregehalt des intestinalen Lysosomen in C. Elegans. Diese Technik ermöglicht die Erkennung von alkalisierenden Lysosomen mit lebenden Tieren, und hat ein breites Anwendungsspektrum experimentelle Studien über das Altern, Autophagie und lysosomale Biogenese einschließlich.

Einleitung

Das Erscheinungsbild von proteinaggregaten ist weithin anerkannt, zu einem Markenzeichen des Alterns in eukaryotischen Zellen^1,2,3, und die Bildung von denen angenommen wird, unter den Fahrern Prinzip der zellulären Seneszenz^{4 , 5 , 6 , 7}. es gibt zunehmend Beweise wie Alter Zellen, PROTEINKATABOLISMUS, führt zu einem Anstieg der Proteinaggregation vorliegt. Der Zusammenbruch der Proteolyse in alternden Zellen beinhaltet eine Beeinträchtigung der Autophagie⁸ sowie Proteasom-vermittelten Protein Degradation⁹. Schließlich wird irreversibel Protein Oxidation in alten Zellen erhöht Protein Katabolismus¹⁰weiter zu beeinträchtigen.

Autophagie wurde ursprünglich gedacht, um ein nicht-selektiven Verfahren zur Masse Abbau von beschädigten Proteinen, aber neuere Studien haben gezeigt, dass Autophagie ist sehr selektiv zu den Katabolismus von Protein-Aggregate und dysfunktionalen Organellen, die nicht Abbau über andere Protein-Clearance Mechanismen¹¹zugänglich. Während des Prozesses der Autophagie sind beschädigt und aggregierte Proteine in einer Doppel-Membran Vesikel genannt die Autophagosome abgesondert. Dieser Autophagosome verschmilzt dann mit der sauren Organellen genannt Lysosomen, die führt zu einer Verschlechterung der Autophagosome Ladung¹². Lysosomen repräsentieren den Endpunkt des selbstverdauende Weges und verschiedene zelluläre Prozesse wie Membran Reparatur, transcriptional Control und Nährstoff sensing beteiligt; Hervorhebung ihrer zentralen Rolle in zelluläre Homöostase (überarbeitet in Nr. 13). Mehrere Studien haben einen Zusammenhang zwischen einer altersabhängige Rückgang der lysosomalen Funktion und verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen¹³gezeigt. Konsequent, kann Wiederherstellung der lysosomalen Funktion in älteren Zellen alterungsbedingte Phänotypen^14,15verzögern. Studien der Komposition des Intralumen Milieus deuten darauf hin, dass der Zusammenbruch der lysosomalen Funktion in älteren Zellen nicht durch einen Rückgang der Produktion von lysosomale Proteasen¹⁶. Alternativ wurde vorgeschlagen, dass Verlust der Intralysosomal Säure, eine entscheidende Voraussetzung für seine enzymatische Aktivität, den Rückgang der Lysosomen-vermittelten Proteolyse¹⁷zugrunde liegen kann. Um diese Hypothese zu erkunden zu können, ist es entscheidend für die Entwicklung von Reagenzien und Protokolle, dynamische Veränderung des lysosomalen pH-Wertes in lebenden Zellen in eine reproduzierbare und konsistente Weise zu erforschen.

Der Darm von C. Elegans ist das große metabolische Gewebe in Worms und es ist eine kritische Regulator des systemischen Homöostase und Lebensdauer. Haben wir Tests zur Beurteilung von Veränderungen in der Säure des Lumens der intestinalen Lysosomen von Worms um festzustellen, wie Lysosomen-vermittelten Proteolyse trägt zur Alterung. Wenn pH-Sensitive Fluorophore zuvor in C. Elegans verwendet wurden, um intestinale Lysosomen zu markieren, wurde es noch keinem bemühen, eine erfolgreiche Protokoll zu etablieren, die kleine Erhöhungen in lysosomalen pH-Wert in Vivo¹⁸. erkennen kann Hier bieten wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, um Verlust der lysosomalen Säure in die Darmzellen von C. Elegans zu erkennen, über eine einfache und bequeme Fütterung Protokoll, die einen pH-Sensitive Fluorophor (cDCFDA) enthält in OP50 Nahrung.

Protokoll

(1) färben und Image-Darm Lysosomen

1. Samen Nematoden Wachstumsmedien (NGM) Platten mit OP50
   1. NGM Platten nach den empfohlenen Protokoll¹⁹ vorzubereiten und die geschlossenen Platten für 2 Tage bei Zimmertemperatur trocknen.
   2. OP50 Bakterien in sterilen Luria Brühe (LB) Brühe zu impfen und wachsen in einem schütteln Inkubator oder Wasserbad bei 37 ° C für 36 h oder bis die OD zwischen 0,2 und 0,4. Vermeiden Sie die Verwendung einer Bakterienkultur mit OD > 1 oder OD < 0,2.
   3. Sobald NGM Platten trocken sind, geben Sie einen Tropfen (~ 30 µL) von OP50 Inokulum auf der Mitte der Platte, und breitete sich dann des Tropfens in einen Patch, der etwa 2 cm x 2 cm groß ist.
      Hinweis: Alle verbleibenden OP50 Inokulum kann bei 4 ° C bis zu einem Monat gespeichert werden.
   4. Invertieren Sie die OP50-Platten zu, sobald das Inokulum (etwa 10 oder 15 min) getrocknet ist, und inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 36 h.
   5. Entfernen Sie nach 36 h die Platten im Inkubator und Store bei 4 ° C bis zur späteren Verwendung.
      Hinweis: Die Platten sollte gut für bis zu 1 Monat bei 4 ° c sein.
2. Ergänzende cDCFDA, OP50
   1. Ergänzend zu cDCFDA auf OP50 Platten bereiten Sie einen arbeiten bestand von 10 mM cDCFDA in Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Halten Sie die cDCFDA-Lösung geschützt vor Licht und bei-20 ° C für die spätere Verwendung speichern.
   2. Sanft lege 100 µL 10 mM cDCFDA Lösung auf die Oberfläche von 2 cm x 2 cm OP50 Patch, so dass die gesamte Patch gleichmäßig mit cDCFDA bedeckt ist.
      Hinweis: Es ist sehr wichtig, dass der gesamte Patch von OP50 mit cDCFDA bedeckt ist. Falls erforderlich, verwenden Sie bis zu 150 µL des cDCFDA für jede Platte. Es ist auch unerlässlich, dass die cDCFDA Lösung nicht über die Grenzen des OP50 Patch, da jede cDCFDA, die aus dem OP50 Patch fließt nicht in der Nahrung aufgenommen werden und zu geringeren Intensität der Färbung führt.
   3. Die OP50-Platten in einer dunklen Kiste auf den Tisch legen, bis aller die cDCFDA Lösung ist die bakterielle Patch aufgenommen (in der Regel etwa 25 bis 30 min.).
3. Färbung der Würmer mit cDCFDA
   1. Sobald die cDCFDA den OP50 Patch vollständig durchdrungen hat, platzieren Sie nicht mehr als 20 Würmer pro Platte zu und inkubieren Sie die Platten bei 20 ° C bei einem Mindestaufenthalt von 14 h invertiert.
      Hinweis: Es wird empfohlen, die cDCFDA Platten in einem undurchsichtigen Lichteinfall minimieren zu platzieren.
   2. Zur Steuerung für Aufnahme Unterschiede zwischen Experimenten und cDCFDA Signale zu normalisieren empfohlen () mit 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) (Co Fleck Difluoro) Bor (2,5 µL einer frisch zubereiteten 1 mM-Lösung), ein Acidotropic schwach Amin Farbstoff deren Fluoreszenz weitgehend nicht-Variante im sauren pH-Spektrum ist (siehe Tabelle der Materialien für Trivialnamen von Reagenzien).
      Hinweis: Flecken Sie Würmer für weniger als 14 h keine, da dies möglicherweise unzureichend cDCFDA Färbung Intensität und eine falsche Interpretation des lysosomalen pH-Wertes geben.
4. Vorbereitung von Folien für die Mikroskopie
   1. Legen Sie zwei parallele Streifen der Kennzeichnung Band ungefähr 3 Zoll auseinander auf eine glatte, flache Oberfläche wie ein Spiegel (Abbildung 1).
   2. Beschichten der Oberfläche des Spiegels mit Wasser abweisenden Spray und überschüssige Flüssigkeit abwischen.
   3. Schmelzen Sie 2 % Agarose (gelöst in destilliertem H₂O) in der Mikrowelle bis vollständig verflüssigt, dann Tropfen Sie einen 50 µL Agarose zwischen den beiden Streifen Klebeband und decken Sie schnell den Tropfen mit einem Mikroskop-Objektträger, so dass die Folie senkrecht zu den Streifen des Band. Nachdem die Agarose erstarrt ist, bilden eine kreisförmige Pad unterhalb der Folie umdrehen Sie die Folie und fügen Sie 10 bis 15 µL 5mM Natriumazid (NaN₃) auf das Agarose-Pad.
      Hinweis: NaN₃ ist ein Inhibitor der Cytochrom C, die bei in geringen Konzentrationen verwendet, reversibel anesthetizes Würmer, so dass sie nicht während der Aufnahme bewegt.
   4. Wählen Sie Würmer aus dem OP50-Teller mit cDCFDA ergänzt, und übertragen Sie sie auf einen sauberen Teller der NGM ohne jede OP50. Können Sie die Würmer, sich für einige Sekunden, um die meisten der OP50 erlauben zu bewegen von der Oberfläche der Würmer entfernt werden, und übertragen Sie dann die Würmer auf die Agarose-Pad mit 5 mM Natriumazid.
   5. Sofort die Agarose-Pad mit einem Deckglas abdecken. Achten Sie darauf, legen Sie das Deckglas vorsichtig ohne zu viel Druck, da diese Würmer platzen führen kann.
      Hinweis: OP50 Bakterien cDCFDA ¤ nzt fluoreszieren, wenn durch Mikroskopie visualisiert, daher ist es wichtig, die Würmer so gut wie möglich zu reinigen, bevor man sie auf die Agarose-Pad mit Natriumazid. Wenn mehr als 6 Sorten von C. Elegans (einschließlich N2, Wildtyp-Kontrolle) vorbereiten, ist es ratsam, zur Vorbereitung der Proben in Chargen von 6, um sicherzustellen, dass die Würmer auf dem Agarose-Pad nicht austrocknen. In einigen Stämmen beginnt die Vulva zu Bruch nach längere Zeit aufgrund des Drucks durch das Deckglas, so ist es wichtig, entsprechend zu planen.
5. Konfokale Mikroskopie
   Hinweis: Einige Mikroskope haben eine eingebaute Funktion, die automatisch erhöht die Fluoreszenzintensität Ausgleich für Variable Ebenen der Fluoreszenz. Diese Mikroskope funktionieren möglicherweise nicht gut für imaging-Würmer gebeizt mit cDCFDA, da sie von Natur aus der Fluoreszenzintensität von Proben zu erhöhen.
   1. Führen Bildgebung auf einem standard confocal Mikroskop mit Erregung/Emission Wellenlängen eingestellt auf 488/530 nm für cDCFDA. Nehmen Sie einziges Flugzeug Bilder (nicht Z-Stapel) der Darm Lysosomen und verwenden Sie nur Lysosomen, die im Fokus (maximale Signalstärke) zur Quantifizierung der Intensität sind.
      Hinweis: Vielleicht wegen der Unterschiede in der Verfügbarkeit von Farbstoff, Lysosomen die Darmzellen direkt posterior, den Pharynx pflegen cDCFDA Färbung Intensität unabhängig von Genotyp oder Alter, daher sollte darauf geachtet werden, imaging Lysosomen in diesen Zellen zu vermeiden.
   2. Bild der Folie, die 2 Tage alten Wildtyp, die N2 zuerst Würmer enthalten. Passen Sie dabei die konfokale bildgebenden Parameter wie Laserleistung, Lochkamera und Blende, um sicherzustellen, dass die cDCFDA Färbung Intensität nicht übersättigt ist.
      Hinweis: Sobald diese Einstellungen festgelegt sind, ändern sie für die gesamte Dauer der Bildgebung für diesen Tag.
   3. 1024 x 1024 Pixel Aufnahmen von einer Ebene des Darmes (3 bis 4 Bilder pro Wurm) mit einem 60 X vergrößerungslinse.
      Hinweis: Das cDCFDA Emissionsspektrum Worms erbringt eine einzelne markante Gipfel bei 520 nm zeitgleich mit seiner gemeldeten Fluoreszenz Spektrum²⁰, bietet eine spezifisches Signal-Anzeige, die sich vom Darm Autofluoreszenz (Abbildung 3) unterscheidet.
   4. Exportieren Sie konfokale Rohbild (.lsm Dateien) als TIFF-Dateien für jeden Kanal.
   5. Als nächstes öffnen Sie ImageJ und klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie , öffnen Sie die Bilddatei quantifiziert werden. Nachdem das Bild geladen wurde, verwenden Sie die ovale Form-Auswahl-Werkzeug in ImageJ, um einer Region of Interest (ROI) auszuwählen.
   6. Klicken Sie danach auf analysieren | Maßnahme , Fluoreszenzintensität für diese Rendite zu quantifizieren. Wählen Sie 4 – 5 verschiedene in-Fokus Lysosomen pro Bild und Berechnung der durchschnittlichen relativen Fluoreszenzintensität der jeweiligen Region of Interest (ROI).
   7. Für jedes Bild Messen der Fluoreszenzintensität Hintergrund in einer Region des Darms zwischen Lysosomen. Subtrahieren Sie die Hintergrundwerte Fluoreszenz Intensität von den lysosomalen Fluoreszenz-Intensität-Werten.
   8. Sammeln Sie insgesamt rund 30 bis 50 einzelne normalisierte Werte für cDCFDA Intensität (6 bis 10 Tiere) für jede Belastung getestet. Verwenden Sie diese Werte, um eine Box und Whisker Plot, die Verwendung von geeigneten statistischen Software zu zeichnen.
      Hinweis: Färbung kann abhängig von Faktoren wie Temperatur, Inkubationszeit und die allgemeine Gesundheit/Alter der Tiere unterschiedlich so dass Fluoreszenz Intensität Vergleiche nur Proben Prozess im gleichen Färbung Experiment relevant sind. Es ist daher wichtig, Kontrollen in jeder Färbung Experiment zu verarbeiten. Statistische Unterschiede berechnen (t-Tests) Verwendung von geeigneten statistischen Software.
   9. Bild alle Stämme aus dem gleichen Experiment (gebeizt am selben Tag) nacheinander, kümmert sich nicht um die bildgebenden Parameter ändern.

Ergebnisse

cDCFDA Flecken Lysosomen in einem pH-abhängigen Weise, und seine niedrige pKa und bereit Aufnahme in Lysosomen macht es eine ideale pH-Sensor-²¹. cDCFDA Färbung Intensität ist umgekehrt proportional zur lysosomalen pH-Wert (d. h. Färbung Intensität erhöht als pH-Wert sinkt)^18,22. cDCFDA Signale sind durchweg schwach in Lysosomen von Tieren behandelt mit 20 mM von Chloroquin, ein Inhibitor der...

Diskussion

Eine Vielzahl von zellulären und molekularen Ereignissen trägt zum Altern, von Lebensgeschichte Merkmale und genetische Faktoren beeinflusst. Unsere aktuelle Studie²² legt nahe, dass die reproduktive Zyklus eine wichtige Rolle spielt bei der Kontrolle der Fitness von Soma durch die Regulierung der lysosomalen pH Dynamik. Wir zeigten, dass dieser lysosomalen vermittelte Proteolyse gefördert wird, während Tiere aktiv reproduzieren durch Hochregulation von V-ATPase Transkription, sorgt wiederum f...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
OP50 (E. coli)	Caenorhabditis Genetics Center		Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50
5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate	ThermoFisher	C369	Commonly known as cDCFDA
9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron	ThermoFisher	L7528	Commonly known as Lysotracker Red
Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)
ImageJ			Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LB Broth powder	ThermoFisher	22700041
Bacto Agar	Sigma	A5306-1KG
NaCl	Sigma	S9888
Bacto Peptone	Fisher Scientific	S71604
Cholesterol powder	Sigma	C3045
CaCl2	Sigma	449709
MgSO4	Sigma	M7506
K3PO4	Sigma	P5629
Sodium Azide	Sigma	S2002
DMSO	Sigma	D8418
Microscope Slides	VWR	48311-703
Cover Slips	ThermoFisher	3406
Agarose	Sigma	A6013
Incubator
Mirror or other smooth flat surface