Évaluer l’alcalinisation Lysosomal dans l' intestin de vivre Caenorhabditis elegans

Résumé

Un guide étape par étape pour sonder la perte d’acidité lysosomale dans l’intestin c. elegans en utilisant le colorant vital sensibles au pH 6 - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescéine diacétate (cDCFDA)

Résumé

Le nématode Caenorhabditis elegans (c. elegans) est un système de modèle qui est largement utilisé pour étudier la longévité et les voies de développement. Ces études sont facilitées par la transparence de l’animal, la possibilité de d’avance et de retour des tests génétiques, la facilité relative de la production de protéines fluorescent étiquetés et l’utilisation des colorants fluorescents qui peut soit être micro dans le début embryon ou incorporés dans sa nourriture (e. coli de souche OP50) d’étiqueter les organites cellulaires (par exemple 9-diéthylamino-5 H-benzo [a] Phénoxazine-5 et la (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) disodique]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Nous présentons ici l’utilisation d’un colorant fluorescent de sensibles au pH qui taches intestinales lysosomes, fournissant une lecture visuelle de la dynamique des changements physiologiques en acidité lysosomale en direct vers. Ce protocole ne mesure pas pH lysosomal, mais vise plutôt à établir une méthode fiable d’évaluation des variations physiologiques importantes en acidité lysosomale. cDCFDA est un composé cellulaire perméable qui est converti en fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) après hydrolyse par les estérases intracellulaires. Protonation à l’intérieur des lysosomes des pièges cDCF dans ces organites, où il s’accumule. En raison de sa faible pKa de 4,8, ce colorant a été utilisé comme un capteur de pH dans la levure. Nous décrivons ici l’utilisation de cDCFDA comme un complément alimentaire afin d’évaluer l’acidité des lysosomes intestinales dans c. elegans. Cette technique permet la détection des lysosomes alcalinisants animaux vivants,, et a une large gamme d’applications expérimentales, notamment des études sur le vieillissement, autophagie et biogenèse lysosomale.

Introduction

L’apparition d’agrégats de protéines est largement reconnue pour être une caractéristique du vieillissement dans les cellules eucaryotes^1,2,3et la formation dont est pensé pour être parmi les pilotes de principe de sénescence cellulaire^{4 , 5 , 6 , 7}. il n’y a plus de preuves que, comme l’âge des cellules, catabolisme protéique est altérée, conduisant à une augmentation dans l’agrégation des protéines. L’effondrement de la protéolyse dans le vieillissement des cellules implique une déficience de l’autophagie⁸ ainsi que la dégradation de protéine induite par le protéasome⁹. Enfin, oxydation irréversible de protéines est augmentée dans les anciennes cellules, outre une atteinte de catabolisme de protéine¹⁰.

Autophagie était initialement considéré comme un processus non sélectif pour la dégradation de la majeure partie des protéines endommagées, mais des études récentes indiquent que l’autophagie est hautement sélective pour le catabolisme des agrégats de protéine et dysfonctionnels organites qui ne sont pas se prêtent à la dégradation par d’autres protéines clairance mécanismes¹¹. Au cours du processus de l’autophagie, protéines endommagées et agrégées sont séquestrés dans une vésicule double membrane appelée l’autophagosome. Cette autophagosome fusionne alors avec les organites acides appelés lysosomes, qui conduit à la dégradation de l’autophagosome fret¹². Lysosomes représentent l’aboutissement de la voie de l’autophagie et participent aux différents processus cellulaires tels que la réparation de la membrane, contrôle transcriptionnel et détection des éléments nutritifs ; mettant en évidence leur rôle central dans l’homéostasie cellulaire (examinée par Réf. 13). Plusieurs études ont montré une association entre une diminution de la fonction de l’âge en fonction lysosomale et divers de troubles neurodégénératifs¹³. Constamment, le fait de restaurer une fonction lysosomale dans les cellules plus âgées peut retarder l’apparition de phénotypes liés au vieillissement^14,15. Étude de la composition du milieu intralumen suggère que l’effondrement de la fonction lysosomale dans les cellules plus âgées n’est pas due à une diminution de la production de protéases lysosomales¹⁶. Par ailleurs, il a été proposé que la perte d’acidité intralysosomal, une exigence essentielle de l’activité enzymatique, pourrait expliquer la baisse induite par le lysosome protéolyse¹⁷. Pour être en mesure d’explorer cette hypothèse, il est essentiel de développer des réactifs et protocoles pour sonder les variations dynamiques de pH lysosomal dans des cellules vivantes de manière reproductible et cohérente.

L’intestin de c. elegans est un tissu métabolique majeur à worms et c’est un critique régulateur de l’homéostasie systémique et de la durée de vie. Nous avons développé des tests pour évaluer les changements de l’acidité de la lumière des lysosomes intestinales de worms pour déterminer comment le lysosome-mediated protéolyse contribue au vieillissement. Bien que sensibles au pH fluorophores ont été utilisés auparavant chez c. elegans pour marquer les lysosomes intestinales, il n’y a encore un effort pour établir un protocole de succès qui peut de détecter de faibles hausses en pH lysosomal en vivo¹⁸. Ici, nous fournissons un protocole qui peut être utilisé pour détecter la perte d’acidité lysosomale dans les cellules intestinales de c. elegans en utilisant un protocole alimentaire simple et pratique qui intègre un fluorophore sensibles au pH (cDCFDA) dans la nourriture OP50.

Protocole

1. tache et Image des lysosomes intestinales

1. Milieux de culture nématode de semences (NGM) plaques avec OP50
   1. Préparer les assiettes NGM selon le protocole recommandé¹⁹ et laisser les plaques fermés à sécher pendant 2 jours à température ambiante.
   2. Ensemencer les bactéries OP50 bouillon stérile de bouillon Luria (LB) et de grandir dans un agitateur incubateur ou le bain-marie à 37 ° C pendant 36 h ou jusqu'à ce que le diamètre extérieur est de 0,2 à 0,4. Évitez d’utiliser une culture bactérienne avec OD > 1 ou OD < 0,2.
   3. Une fois que NGM plaques sont secs, déposez une goutte (~ 30 µL) d’inoculum OP50 vers le centre de la plaque et s’étend ensuite la goutte dans un patch à peu près qui est de 2 cm sur 2 cm dans la taille.
      Remarque : N’importe quel inoculum OP50 restant peut être stocké à 4 ° C pendant jusqu'à un mois.
   4. Inverser les plaques OP50 une fois que l’inoculum est sèche (environ 10 ou 15 min) et puis incuber les plaques à 37 ° C pendant 36 h.
   5. Après 36 h, enlever les plaques de l’incubateur et le conserver à 4 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
      Remarque : Les plaques doivent être bons pendant environ 1 mois à 4 ° C.
2. Complétant cDCFDA à OP50
   1. Pour compléter les cDCFDA sur des plaques de OP50, préparation d’un stock de travail de 10 mM cDCFDA dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Conserver la solution cDCFDA, protégée de la lumière et conserver à-20 ° C pour une utilisation ultérieure.
   2. Placez délicatement 100 µL de solution de cDCFDA de 10 mM sur la surface du patch OP50 2 cm x 2 cm, tels que le patch entier est uniformément recouvert de cDCFDA.
      Remarque : Il est très important que le patch entier de OP50 est recouvert de cDCFDA. Si nécessaire, utilisez jusqu'à 150 µL de cDCFDA pour chaque plaque. Il est également impératif que la solution de cDCFDA ne s’étend pas au-delà des frontières du patch OP50, depuis n’importe quel cDCFDA qui s’écoule le patch OP50 ne figureront pas dans les aliments et se traduira par une moindre intensité de coloration.
   3. Placer les plaques OP50 dans une boîte sombre sur le dessus de banc jusqu'à ce que toute la solution cDCFDA est absorbée dans le patch bactérien (habituellement environ 25 à 30 min).
3. Coloration à l’aide de cDCFDA les vers
   1. Une fois que le cDCFDA a complètement imprégné le patch OP50, sans toutefois dépasser 20 vers par plaque et incuber les plaques inversés à 20 ° C pendant au moins 14 h.
      Remarque : Il est recommandé de placer les plaques de cDCFDA dans une boîte opaque pour minimiser l’exposition à la lumière.
   2. Pour contrôler des différences de consommation entre les expériences et de normaliser les signaux cDCFDA, (recommandé) Co tache avec 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)) difluoro) bore (2,5 µL d’une solution fraîchement 1 mM), un colorant de faibles amine acidotrope dont la fluorescence est en grande partie non variantes sur le spectre d’un pH acide (voir Table des matières des noms communs de réactifs).
      Remarque : Tache pas worms pour moins de 14 h, puisque ceci peut fournir l’intensité de coloration de cDCFDA inadéquate et donner une fausse interprétation du pH lysosomal.
4. Préparation des lames pour la microscopie
   1. Placez deux bandes parallèles de marquage bande environ 3 pouces dehors sur une surface lisse et plane, comme un miroir (Figure 1).
   2. Recouvrir la surface du miroir avec vaporisateur hydrofuge et essuyer le liquide excédentaire.
   3. Faire fondre 2 % d’agarose (dissous dans distillée H₂O) dans un four à micro-ondes jusqu'à ce que complètement liquéfié, puis déposer une goutte de 50 µL d’agarose entre les deux morceaux de ruban adhésif et couvrir rapidement la baisse avec une lame de microscope, telle que la diapositive soit perpendiculaire aux bandes de ruban adhésif. Après que l’agarose est solidifié, formant un tampon circulaire au titre de la diapositive, retourner la diapositive et ajouter 10 à 15 µL 5mM d’azide de sodium (NaN₃) sur le bloc de gel d’agarose.
      NOTE : NaN₃ est un inhibiteur du cytochrome C que lorsqu’il est utilisé en faible concentration, anesthetizes réversible vers afin qu’ils ne bougera pas pendant la formation image.
   4. Choisissez vers de la plaque OP50 additionné de cDCFDA et les transférer sur un plat NGM propre sans aucune OP50. Laissez les vers se déplacer pendant quelques secondes permettre à la plupart de la OP50 à supprimer de la surface vers et ensuite transférer les vers sur le tampon de gel d’agarose contenant de l’azide de sodium 5 mM.
   5. Couvrir immédiatement le tampon de gel d’agarose avec une lamelle couvre-objet. N’oubliez pas de placer délicatement la lamelle couvre-objet sans exercer trop de pression, car cela peut entraîner vers d’éclatement.
      NOTE : OP50 bactéries additionnés de cDCFDA sont fluorescents lors de microscope, c’est pourquoi il est important de nettoyer les vers autant que possible avant de les placer sur le coussinet de gel d’agarose contenant de l’azide de sodium. S’apprêter à plus de 6 souches c. elegans (y compris N2, contrôle de type sauvage), il est conseillé de préparer les échantillons dans des lots de 6, afin de s’assurer que les vers ne sèchent pas sur le coussinet de gel d’agarose. Chez certaines souches, la vulve commence à se rompre après une période prolongée en raison de la pression de la lamelle couvre-objet, il est donc important de planifier en conséquence.
5. Microscopie confocale
   Remarque : Certains microscopes ont une fonction intégrée qui augmente automatiquement l’intensité de la fluorescence pour compenser des niveaux variables de la fluorescence. Ces microscopes peuvent ne pas fonctionner bien pour imagerie vers colorées avec cDCFDA, car ils augmenteront intrinsèquement l’intensité de la fluorescence des échantillons.
   1. Effectuer l’imagerie sur un microscope confocal standard en utilisant des longueurs d’onde d’excitation/émission définis sur 488/530 nm pour cDCFDA. Prendre des images de plan unique (pas de Z-cheminées) de lysosomes intestinales et utiliser uniquement les lysosomes qui sont en discussion (intensité du signal maximale) pour la quantification de l’intensité.
      NOTE : Peut-être à cause de différences dans la disponibilité de colorant, les lysosomes des cellules intestinales directement derrière le pharynx maintiennent cDCFDA coloration intensité quel que soit le génotype ou l’âge, c’est pourquoi il faut éviter d’imagerie lysosomes dans ces cellules.
   2. Image de la diapositive contenant 2 jour vieux type sauvage que N2 worms tout d’abord. Ce faisant, régler les paramètres d’imagerie confocale tels que la puissance du laser, sténopé et l’ouverture pour s’assurer que le cDCFDA à l’intensité de la coloration n’est pas saturé.
      Remarque : Une fois que ces paramètres sont définis, ne les modifiez pas pendant toute la durée de l’imagerie pour ce jour-là.
   3. Un seul plan de l’intestin (3 à 4 images par ver) en 1024 x 1024 pixels images à l’aide d’un 60 X lentille de grossissement.
      Remarque : Le spectre d’émission de cDCFDA à worms produira un seul pic important à 520 nm coïncidant avec sa fluorescence déclarés spectre²⁰, fournissant une lecture du signal spécifique qui se distingue de l’autofluorescence intestinale (Figure 3).
   4. Export image confocale raw (fichiers .lsm) sous forme de fichiers .tiff pour chaque canal.
   5. Ensuite, ouvrez ImageJ et cliquez sur fichier | Ouvrez pour ouvrir le fichier image à quantifier. Une fois le chargement de l’image, utilisez l’outil de sélection de forme ovale en ImageJ pour sélectionner une région d’intérêt (ROI).
   6. Par la suite, cliquez sur Analyze | Mesure pour quantifier l’intensité de fluorescence pour ce retour sur investissement. Sélectionnez les 4 – 5 différents lysosomes de mise au point par l’image et calculer l’intensité de la fluorescence relative moyenne de chaque région d’intérêt (ROI).
   7. Pour chaque image, mesurer l’intensité de fluorescence de fond dans une région de l’intestin entre lysosomes. Soustraire les valeurs d’intensité de fluorescence fond depuis les valeurs d’intensité de fluorescence lysosomal.
   8. Au total, recueillent environ 30 à 50 valeurs normalisées individuels pour cDCFDA intensité (animaux de 6 à 10) pour chaque souche testée. Utilisez ces valeurs pour tracer un tracé boîte et moustaches à l’aide de n’importe quel logiciel de statistique appropriée.
      NOTE : La coloration peut varier considérablement selon des facteurs comme la température, le temps d’incubation et la santé globale/âge des animaux tels que les comparaisons d’intensité de fluorescence n’est pertinentes dans les processus d’échantillons dans la même expérience de coloration. Il est donc important de traiter les commandes dans chaque expérience de coloration. Calculer des différences statistiques (t-tests) à l’aide de n’importe quel logiciel de statistique appropriée.
   9. Image de toutes les souches de la même expérience (teintée le jour même) dans l’ordre, en prenant soin de ne pas pour changer les paramètres d’imagerie.

Résultats

cDCFDA taches lysosomes de manière dépendante du pH, et sa faible pKa et capture de prêt dans les lysosomes rend un pH idéal capteur²¹. cDCFDA intensité de coloration est inversement proportionnel au pH lysosomal (c'est-à-dire la coloration des augmentations comme pH diminue d’intensité)^18,22. cDCFDA signaux sont toujours faibles dans les lysosomes des animaux traités avec 20 mM de la chl...

Discussion

Une variété d’événements cellulaires et moléculaires contribuent au vieillissement, influencé par les caractéristiques du cycle vital et de facteurs génétiques. Notre récente étude²² suggère que le cycle de la reproduction joue un rôle important dans le contrôle de l’aptitude du soma en régulant la dynamique pH lysosomal. Nous avons montré que cette protéolyse médiée par les lysosomes est encouragée tandis que les animaux se reproduire activement par l’augmentation de la ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
OP50 (E. coli)	Caenorhabditis Genetics Center		Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50
5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate	ThermoFisher	C369	Commonly known as cDCFDA
9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron	ThermoFisher	L7528	Commonly known as Lysotracker Red
Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)
ImageJ			Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LB Broth powder	ThermoFisher	22700041
Bacto Agar	Sigma	A5306-1KG
NaCl	Sigma	S9888
Bacto Peptone	Fisher Scientific	S71604
Cholesterol powder	Sigma	C3045
CaCl2	Sigma	449709
MgSO4	Sigma	M7506
K3PO4	Sigma	P5629
Sodium Azide	Sigma	S2002
DMSO	Sigma	D8418
Microscope Slides	VWR	48311-703
Cover Slips	ThermoFisher	3406
Agarose	Sigma	A6013
Incubator
Mirror or other smooth flat surface