Kennzeichnung von Arzneimitteln in die aquatische Umwelt mittels HPLC-ESI-Q-TOF-MS und Beseitigung von Erythromycin durch Foto-induzierte Degradation

Zusammenfassung

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für ungezielte Analyse mit Zeit des Fluges Massenspektrometrie als ein perfektes Werkzeug, um Arzneimittel in Gewässern zu identifizieren. Wir demonstrieren die Anwendung der UV-Bestrahlung für deren Beseitigung. Analyse mit Bestrahlung, zusammengesetzte Isolierung, Identifizierung und kinetische Modellierung der Abbau Profile wird dargestellt.

Zusammenfassung

Überwachung von Arzneimitteln in den Wasserkreislauf wird immer wichtiger für die aquatische Umwelt und schließlich für die menschliche Gesundheit. Gezielte und nicht gezielte Analyse sind heute das Mittel der Wahl. Obwohl gezielte Untersuchung, die in der Regel mit Hilfe von einem triple Quadrupol Massenspektrometer empfänglicher sein kann, erkennen Sie nur Verbindungen, die zuvor ausgewählt. Die mächtigste ungezielte Analyse erfolgt durch die Zeit des Fluges Massenspektrometer (TOF-MS) verlängert von einem Quadrupol-Masse-Analysator (Q), wie in dieser Studie verwendet. Festphasenextraktion und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) vorangestellt, die ungezielte Ansatz erlaubt es, um alle ionizable Substanzen mit hoher Empfindlichkeit und Selektivität zu erkennen. Unter voller Ausnutzung der Q-TOF-MS Instrument, tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) Experimente beschleunigen und erleichtern die Identifizierung, während eine gezielte MS-Methode die Empfindlichkeit erhöht, sondern stützt sich auf Referenzstandards zu Identifizierungszwecken. Die Identifizierung von vier Arzneimitteln aus Rhein Flusswasser wird demonstriert. Der Rhein entspringt im Tomasee, Graubünden, Schweiz und mündet in die Nordsee in der Nähe von Southern Bight, Niederlande. Seine Länge beträgt 1232,7 km. Da es von erstklassigen Interesse für Arzneimittel aus den Wasserkreislauf effektiv zu beseitigen ist, wird die Effekt UV-C-Bestrahlung im Labormaßstab demonstriert. Diese Methode ermöglicht schnelle Abbau von Arzneimitteln, die exemplarisch für die Makrolid-Antibiotikum Erythromycin angezeigt wird. Mit der oben genannten HPLC-Q-TOF-MS-Methode sind Konzentration-Zeit-Diagramme für die übergeordneten Droge und deren Photodegradation Produkte erhalten. Nach der Gründung der Gleichungen für die sequentielle Reaktionen erster Ordnung, ermöglicht rechnerische Anpassung die Bestimmung der kinetischen Parameter, die Bestrahlung Zeiten und Bedingungen, wenn potenziell als vierte Stufe innerhalb Vorhersagen helfen könnte Abwasserbehandlung.

Einleitung

Arzneimittel werden regelmäßig in die aquatische Umwelt^1,2,3,4,5gefunden. Eine wichtige Quelle sind Abwässer aus Abwasser Behandlung Pflanzen (Ara)^6,7,8,9. Das Auftreten von Arzneimitteln in der in den Wasserkreislauf ist exemplarisch in der Turia Flussbecken¹⁰untersucht worden. Unter anderem Antibiotika stellen eine bestimmte gefährliche Klasse von Medikamenten, da sie oft die biologische Stufe der Kläranlagen bestehen unverändert und kann dazu führen, dass bakterielle Resistenzen in der Umwelt^11,12,13 . Makrolide sind eine Klasse von Antibiotika, die sowohl in der Human-als auch in der Veterinärmedizin angewendet werden. Ihre Vertreter fanden in Konzentration bis 1 µg/L in Abwässer^{14,15,16,17,18,19}. Einer von ihnen ist Erythromycin (Ery)^20,21. In Gewässern, Erythromycin ist oft begleitet von Anhydroerythromycin A (Ery A - H₂O), ein dehydrieren^22,23. Wasser-Beseitigung von Erythromycin ist durch saure Instabilität. Das Verhältnis von Erythromycin vs. Anhydroerythromycin hängt von der pH^24,25,26,27.

Chemisch, Makrolide enthalten eine Macrocylic-lacton, welche verschiedene Zucker Moieties beigefügt sind, zB., Desosamine, Cladinose oder Mycaminose. Da Makrolide Naturprodukte aus Fermentationsprozessen chemisch verändert wurden, existieren sie oft als Mischungen. Die Spezies bezeichnet A, B, C, etc.., in der Zucker-Substituenten unterscheiden. Der Zucker Moieties und ihre Position an der lacton sind verantwortlich für die Wirkungsweise von Makroliden^28,29. Um die Gefahr für die Umwelt zu minimieren, ist es wünschenswert, die vollständig die Arzneimittel vor dem Eintritt in die aquatische Umwelt^27,30,31,32mineralisieren.

Der erste Teil dieser Studie beschäftigt sich mit der Erkennung von Pharma in Oberflächengewässern, die ist wichtig für die Überwachung der Abwässer und offenen Gewässern. Zur Suche nach einer Vielzahl von unbekannten Stoffen im Mikrogramm-Bereich in verschiedenen Matrizen ist Nichtziel-Analyse die Methode der Wahl^20,33,34,35. In bestimmten, Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Electrospray Ionisierung Quadrupol ist Zeit der Flug Massenspektrometrie (HPLC-ESI-Q-TOF-MS) von außerordentlichem Wert aufgrund seiner Spezifität und Sensitivität nachgewiesen worden. Nach der Identifikation des Stoffs, Empfindlichkeit kann weiter verlängert werden mit der gezielten MS Ansatz mit dem Quadrupol in Auswahlmodus betrieben und die Aufprallenergie innerhalb der Kollision Zelle auf NULL gesetzt. Daher kommen Ionen nicht fragmentiert am TOF-Detektor.

Der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit ist die Beseitigung von Erythromycin. Für die Beseitigung der Arzneimittel, so genannte erweiterte Oxidationsverfahren (AOPs) verwendet werden, zB., begann durch Bestrahlung mit UV Licht^36,37,38. Wichtig für den Abbau ist die Bildung von Hydroxyl-radikale aus dem Wasser durch VUV / UVC Bestrahlung nach GL. 1.

H₂O + hν(< 200 nm) → H₂O * → H^. + ^. OH (1)

Hydroxyl-Radikale besitzen ein hohes Oxidationspotential von 2,8 V, trägt positiv zum Abbau der Substanzen^36,37.

Hier wird der Abbau von Erythromycin mit Vakuum UV/UVC-Bestrahlung im Wasser beschrieben unter Berücksichtigung der Einflüsse des pH-Werts. Die Bildung von noch mehr gefährliche Produkte ist vermutlich ein Nachteil bei der Verwendung von AOPs^39,40. Daher ist es wichtig, bis vollständige Mineralisierung der Arzneimittel zu bestrahlen. Um besser abschätzen zu können die polymerisationszeit die kinetischen Modell der Reaktion sind die Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion und die Halbwertszeiten sowohl für das erste Medikament seiner Photodegradates bestimmt. Zu diesem Zweck wurden Konzentrationszeit (c-t) Grundstück von HPLC-ESI-Q-TOF-MS-Messungen abgeleitet und im Vergleich zu chemischen Kinetik Modellen mit MATLAB. Die Kinetik des Abbaus verlief nach erster Ordnung, und die Photodegradates wurden als Zwischenprodukte von einem aufeinanderfolgenden oder weiteren Follow-up-Reaktion^27,41beschrieben.

Protokoll

(1) Probenvorbereitung: Festphasenextraktion

1. Etwa 1 L Wasser für die Vorbereitung der Proben zu sammeln.
2. Filtern Sie die Probe über ein blaues Band-Filter mit einer Porengröße von 2 µm, grobe Partikel zu entfernen.
3. Equilibrate der SPE Patrone mit 3 mL Methanol und 3 mL Reinstwasser.
4. Wenden Sie das Filtrat (1 L) auf die SPE Patrone und erhöhen die Strömungsgeschwindigkeit mit moderaten Vakuum, zB., eine Membranpumpe.
   Hinweis: Mehrere SPE Kartuschen können parallel ausgeführt werden.
5. Waschen Sie die Probe mit 3 mL Reinstwasser.
6. Eluieren Sie Analyten aus der Patrone Kaliumsorbat mit 3 mL Methanol.
7. Konzentrieren Sie 3 mL Eluat Trocknen mit einem drehverdampfer.
8. Den Rückstand in 1 mL hochreines Wasser auflösen.
9. Filtern Sie die Lösung durch eine Spritze Filter und speichern Sie sie in ein Fläschchen für die ungezielte Analyse durch HPLC-ESI-Q-TOF-MS.

(2) HPLC-ESI-Q-TOF-MS-Methode für ungezielte und gezielte Analyse und MS/MS

1. Übertragen Sie das Fläschchen auf der HPLC-ESI-Q-TOF-MS Autosampler.
2. Legen Sie alle relevanten Parameter (Tabelle 1) für die HPLC-ESI-Q-TOF-MS.
   Hinweis: Wenn eine endliche Kollision Energie verwendet wird, d. h.., Kollision Energie (CE) ≠ 0, Ionen fragmentiert werden. Dieser Modus entspricht die gezielte MS/MS-Methode.
3. Starten Sie die Messung.
4. Die daraus resultierende Chromatogramme und Massenspektren zu analysieren.

(3) UV-Bestrahlung-Experimente

1. Die antibiotische Substanz, z. B. Erythromycin (750 mg/L), Reinstwasser bei 20 mg/L Endkonzentration auflösen.
2. Füllen Sie die 1 L Photoreactor, eingewickelt in Alufolie, mit 750 mL der Lösung.
3. Stellen Sie die Lampe bietet 15 W der Macht in den Reaktor.
4. Gelten Sie Magnetrührer mit 500 u/min.
5. Stellen Sie den pH-Wert auf den gewünschten Wert 3-4, 6-7 oder 8-9 durch tropfenweise Zugabe von HCl (0,1 M) oder NH₃ (0,1 M) bei Bedarf. pH 6-7 wird als Beispiel verwendet.
6. 2 mL der Reaktionslösung als Probe zum Zeitpunkt 0 mit einer Spritze zu nehmen und in eine 2 mL-Glasflasche zu übertragen.
7. Schalten Sie die UV-Lampe und nachzuverfolgen Sie die ablaufende Zeit.
   Hinweis: Bestrahlung Zeiten von 10 min sind oft ausreichend. Vollständigkeit der Photoreaktion gewünscht, müssen eine zweite Experiment-Serie mit den Ergebnissen der ersten Serie aufgezeichnet werden.
   Achtung: UV-Bestrahlung kann zur Erblindung führen.
8. Zeichnen Sie einer 2 mL Probe aus der Lösung alle 30 s während der ersten 5 min. Dann nehmen Sie eine Probe alle 60 s bis zum Ende des Experiments. Übertragen Sie die Proben in 2 mL Fläschchen.
9. Speichern Sie die Fläschchen bis zur HPLC-ESI-Q-TOF-MS-Analyse bei-4 ° C.
10. Die 16 Proben mit HPLC-ESI-Q-TOF-MS mit der in Schritt 2 beschriebenen Methoden zu analysieren.

4. Kinetik Analyse

1. Bereiten Sie eine geeignete Software wie z. B. die Kurvenanpassung Toolbox von MATLAB R2016b.
2. Passen die Masse-Bereich vs. Zeitdaten der Foto-induzierte Degradation des übergeordneten Antibiotikums Verbindung nach ersten Auftrag Kinetik, siehe GL. 2^42,43
   (2)
   Die Konzentration bezieht sich auf die Ausgangskonzentration der das Edukt A, c_A , um die tatsächliche Konzentration über die Reaktionszeit t mit der Rate Konstante k₁ aus der ersten Reaktionsschritt A nach B.
3. Masse-Bereich vs. Zeitkurven der passen die degradates mit GL. 3 und 4, da sie als Zwischenprodukte in Folge oder weiteren Follow-up-Reaktion, dhbezeichnet werden können., Produkt B oder C nach der Reaktion Modell →B → C → d
   (3)
   (4)
   Die Konzentrationen c_B und c_C beziehen sich auf die Zwischenprodukte B und C; und k_2,k₃ , um die entsprechenden Geschwindigkeitskonstanten B, C, C, D.
4. Verwenden Sie EQ. 5 an die Daten anzupassen, wenn die Bestrahlungszeit nicht ausreichte, um den Abbau von einem Fotoprodukt zu beobachten. Diese Degradate kann als Endprodukt D mit der Konzentration C_D Geschwindigkeitskonstanten erhalten behandelt werden.
   (5)
   1. Berechnen Sie die Konzentration von B mit GL. 6 anstelle von GL. 3, wenn die Reaktion mit B endet. Wenn C das Endprodukt ist, berechnen Sie die Konzentration von C gemäß Gleichung 7 anstelle von GL. 4.
      (6)
      (7)
5. Verwenden Sie für die Bestimmung der Halbwertszeit t_1/2GL. 8.
   (8)

Ergebnisse

Als Ergebnis der Festphasenextraktion erhielt eine gelblich bis dunkel grüne Lösung in allen Fällen, die das Vorhandensein von Chlorophyll-haltigen Substanzen (Abbildung 1). Pharma in diese Wasserprobe enthaltenen führe nicht auf sichtbare Färbung seit ihre Konzentration und ihre Absorption wäre in der Regel zu niedrig. Stattdessen muss das Auftreten von Arzneimitteln mit HPLC und hochauflösende Massenspektrometrie analysiert werden.

Ungezielte Analyse benutzte eine HPLC-ESI-Q-TOF-MS wegen seiner herausragenden Massengenauigkeit ermöglicht die genaue Masse für jedes zusammengesetzte Ion zu erhalten. Die Masse erkannt Chromatogramm der durchgeführten Analyse wurde dargestellt, wie eine base Peak Chromatogramm (BPC), die die intensivste Höhepunkt jedes Massenspektrum zeigt im Verlauf die chromatographische Trennung erfasst. Das Beispiel in Abbildung 2 dargestellte präsentiert die BPC eine Wasserprobe vom Rhein.

Die BPC enthielt mehr als fünfundzwanzig Gipfeln spiegelt verschiedene m/Z Werte, daher verschiedene Verbindungen, von denen sieben in der BPC geprägt waren. Da die Stoffe a-prioriunbekannt waren, besteht der erste Schritt zu ihrer Identifizierung normalerweise die Summenformel ableiten. Dies geschieht durch genaue Masse und Isotopen Muster von TOF-Erkennung zur Verfügung gestellt, obwohl die isotopische Muster nicht in allen Fällen aufgrund der geringen Stichprobe Konzentrationen in Umweltproben beobachtet werden kann. Mit Hilfe der öffentlichen Datenbank, z. B. Arzneimittel in der Umwelt durch die deutschen Umweltbundesamtes (UBA), ca. 630 Verbindungen enthalten ist eine vorläufige Identifizierung von einer kleinen Gruppe von Kandidaten oft erfolgreich. Für einen endgültigen Beweis entweder im Vergleich zu handelsüblichen Referenzstandards durchgeführt werden kann oder MS/MS Fragmentierung Muster betrachtet werden können (Abbildung 3).

Vergleich zu Standards in Bezug auf die Verweildauer entfielen in dieser Arbeit die Identifizierung von Arzneimitteln, die sehr häufig in deutschen Gewässern zu finden. Diese Stoffe gehören Metoprolol, β-Blocker, Carbamazepin, Analgetikum, und die Makrolid-Antibiotikum Erythromycin A und seine Ableitung Anhydroerythromycin A. Erythromycin dient als Beispiel, die in dieser Studie weiter untersucht. Die untersuchte Rhein River Probe hatte einen pH-Wert von 7,6 und einer durchschnittlichen Temperatur von 16,5 ° C. Bei diesem pH Anhydroerythromycin auch dürften in der Wasserprobe anwesend zu sein. Für die detaillierte Analyse wurden die extrahierten Ion Chromatogramme (EIC) der Wasserprobe mit Referenzstandards (Abbildung 4) verglichen.

Der Vergleich zeigt gute Übereinstimmung zwischen die Retentionszeit für Metoprolol, Carbamazepin und Anhydroerythromycin und der beobachteten Analyten. Die EIC der Referenz-standard-Anhydroerythromycin angezeigt, zwei Spitzen, somit zwei Verbindungen wo Austrocknung an zwei unterschiedlichen Standorten von Erythromycin stattgefunden hatte. Jedoch wurde nur ein Anhydroerythromycin Isomer in der Rhein-River-Probe identifiziert. Erythromycin selbst war nur in Spuren vorhanden. Daher konnte kein MS/MS-Spektrum gewonnen werden. Die genaue Massen für das Antibiotikum und seine gelief sind in Tabelle 2angegeben. Mit EIC, also m/Z-Wert und Retention-Zeit, Metoprolol, Carbamazepin, konnten Erythromycin und Anhydroerythromycin in der Rhein-River-Probe identifiziert werden.

In Bezug auf die aquatische Umwelt ist es wichtig, Pharmazeutika aus Kläranlagen auf der Durchreise und Eingabe von Oberflächenwasser zu verhindern. Auf der Suche nach einer effizienten Beseitigung wurden UV-C Strahlung Experimente bei verschiedenen pH-Werten als Beispiel für Erythromycin durchgeführt. Konzentration-Zeit (c-t)-Diagramme wurden mit Masse-Bereich vs. Zeit Grundstücke abgeleitet EIC. Der Abbau wurde nach Gleichung 2 beschrieben. Erythromycin besteht aus Erythromycin A und B und Anhydroerythromycin A, mit zwei Isomere der letzteren. Die c-t -Kurven von Erythromycin A und deren rechnerische passt sind in Abbildung 5dargestellt. Bei pH 7 wurde beschleunigten Abbau beobachtet. Dies gilt für alle vier Verbindungen untersucht, Daten nicht angezeigt. Infolgedessen sollte um pH-neutralen Foto-induzierte Degradation von Erythromycin durchgeführt werden. Im Falle der Rhein River Probe war pH-Einstellung nicht erforderlich.

Photodegradates der Medikamente waren auch identifizierten an allen drei pH-Werte. Tabelle 3 enthält ein Überblick über diese Photodegradates mit ihren entsprechenden Struktur-Vorschläge. Für die kinetische Analyse des Photodegradates, das Produkt mit m/Z = 720 dient als Beispiel. Photodegradates können oft als Reaktion Zwischenprodukte beschrieben werden. Daher wurden die Photodegradates in Bezug auf Aconsecutive und anschließende Follow-up-Reaktion beschrieben. Die Entscheidung zwischen den entstehenden Zwischenprodukte basiert auf die Güte der Anpassung berechnet mit passender Software, wo der Bestimmungskoeffizient (R²) und der Mean-squared Restfehler (RMSE) als Kriterium aufgenommen wurden. Aufgrund der Tatsache, dass Erythromycin Säure-instabil ist, degradates wie bei der Bestrahlung auftreten würde anwesend vor Bestrahlung waren. Der daraus resultierende Effekt auf Gleichungen 3 und 4 war eine endliche ab Konzentration. Daher wurde ein Faktor der Gleichungen hinzugefügt. Abbildung 6 zeigt experimentelle Daten und passt berechnet nach Gleichung 3 und 4.

In diesem Beispiel eines Zwischenprodukts demonstriert die Erhöhung der Konzentration mit einem sigmoidale Anstieg gefolgt von einer exponentiellen Zerfall. Dies ist bezeichnend für eine anschließende Follow-up-Reaktion zwischen. Ein Zwischenprodukt der aufeinander folgenden Reaktion zeigt nicht die Erhöhung der sigmoidale. Statistischen Qualitätsparameter zeigte auch die leicht überlegene Vereinbarung fit nach dem anschließenden Follow-up-Reaktionsmodell. Der Koeffizient der Entschlossenheit R² der aufeinander folgenden Reaktion war 0.9898 und somit niedriger als die der die anschließende Follow-up-Reaktion wird 0.9976. Daher war der untersuchten Produkt als Zwischenprodukt einer anschließenden Follow-up-Reaktion interpretiert. Die k-Werte ergaben sich aus der rechnerischen Passform sowie, die Halbwertszeit war berechnete folgende Gleichung 5. Alle relevanten kinetische Parameter sind in Tabelle 3gesammelt.

Der schnellste Abbau wurde beobachtet bei pH 7, gefolgt von pH 9, während die langsamste Verschlechterung für pH 3 (Abbildung 5) gefunden wurde. Diese Feststellung galt auch für die Bildung und den Abbau von der Photoproducts. Drei Photodegradates wurden beobachtet. Ihre m/Z-Werte waren 750.46 entsprechend Ery F, 720.45, Ery C und 192.12, DPEry192, ein glycosidically gebundenen Zucker der Erythromycin-Struktur (Abbildung 7). Keine Verschlechterung der das Produkt könnte für DPEry192 bei pH 3 und 9 und für Ery F werden bei pH 9 beobachtet. In diesen Fällen war die Bestrahlungszeit nicht ausreichend lange, totale Zerstörung des Zwischenprodukts zu beobachten. Dennoch könnte die Bildung Rate konstant mit Gleichung 5, das entspricht einem Endprodukt bestimmt werden.

Abbildung 1 . Vergleich der Proben vom Rhein nach SPE (links) und hochreinen water(right). Die grüne Färbung ist bezeichnend für Substanzen, die Chlorophyll enthalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 . BPC einer Wasserprobe nach SPE mit HPLC-ESI-Q-TOF-MS. gemessen Alle Chromatogramme wurden auf den höchsten Gipfel normalisiert. Illustrative m/Z-Werte kennzeichnen wir wie aus dem entsprechenden MS-Spektrum zu erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 . Q-TOF-MS-Spektrum von Erythromycin A (unten) und MS/MS-Spektrum der Ionen m/Z = 734.4689 (oben). Der Spektren zeigen die quasi-Molekulare Ionen von Erythromycin A mit seinen Isotopen Muster und die Fragmente bei einer angewandten Kollision Energie von 30 eV. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 . Normalisiert die EIC (A) Metoprolol, Carbamazepin (B), (C) Erythromycin A und (D) Anhydroerythromycin A in einer Rhein Fluss Probe (blau) und Reinstwasser aus Referenzverbindungen (rot). Die Retentionszeiten der Referenzverbindungen und diejenigen von Arzneimitteln in der Wasserprobe sind identisch. Das Signal-Rausch-Verhältnis von Metoprolol (A) und Anhydroerythromycin (D) sind höher als die von Carbamazepin (B) und Erythromycin (C), was darauf hindeutet, dass Letzteres nur in Spuren vorhanden waren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 . Konzentration-Zeit-Verläufe der Photodegradation von Erythromycin A bei pH 3 (rot), pH-Wert 7 (grün) und pH 9 (blau) normalisiert. Lösungen wurden 10 min. lang bestrahlt. Bei pH 7 war Erythromycin vollständig aus der Probe entfernt. Die Konzentration-Zeit-Verläufe könnte durch kinetische Gleichungen erster Ordnung beschrieben werden. Die kinetische Geschwindigkeitskonstanten waren 0,10 (pH 3), 0,59 (pH 7) und = 0,21 (pH 9). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 . Vergleich der passt der Konzentrationszeit Kurven von der Photoprodegradates von Erythromycin mit m/Z = 720 bei pH 9 folgende Gleichungen 3 (A) und 4 (B). Das Bestimmtheitsmaß von aufeinander folgenden Reaktion (A): R² = 0.9898, RMSE = 4.645E + 04, und der späteren Follow-up-Reaktion (B): R² = 09976, RMSE = 2.366E + 04. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7 . Struktur von Erythromycin A, Erythromycin B und Anhydroerythromycin und Photdegradation. Diese Zahl wurde von Voigt Et al.modifiziert. ²⁷. die Produkte wurden nach 10 min der UVC-Bestrahlung gebildet und durch HPLC-Q-TOF-MS und MS/MS. identifiziert Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Liquid Chromatography
Spalte:	umgekehrt-Phase C-18
Spalte:	CoreShell Spalte;
Spalte:	Abmessungen 50 x 2,1 mm, 2,6 µm Partikelgröße
Säulentemperatur	40 ° C
Injektionsvolumen:	5 ΜL
Durchfluss:	0,3 mL/min
Mobile Phase:	Lösungsmittel A: Wasser mit 0,1 % Ameisensäure
	Lösungsmittel B: Methanol mit 0,1 % Ameisensäure
Gradient-Programm:
Zeit/min	0	1	10	11.1	11.2	12
Umlenkern Lösungsmittel Verhältnis	99:1	70: 30	25: 75	1:99	1:99	99:1
Massenspektrometrie
Quelle:	Dual AJS ESI (positiv-Modus)
Gas- und Quelle
Gastemperatur:	300 ° C
Trocknungsgas:	8,0 L/min
Vernebler:	14 psig
Gastemperatur Mantel:	300 ° C
Scheide Gas Flow:	8 L/min
Messe-Angebot:	100 - 1000 m/Z
Abtastrate:	1 Spektrum/s
Erfassungszeit:	1000 ms/Spektrum
Transiente / Spektrum	10014
Für gezielte MS-Methode
Aufprallenergie (CE):	0 eV
Bevorzugte Masse - Tabelle	734.4685
Für MS/MS (in der Regel Auto-MS/MS-Modus)
Aufprallenergie (CE):	30 eV
Absolute Schwelle	3000 zählt
Relative Schwelle	0,01 %
Messe-Angebot:	100 - 100 m/Z
Abtastrate:	1 Spektrum/s
Erfassungszeit:	1000 ms/Spektrum
Transiente / Spektrum	9964
Für gezielte MS/MS-Methode
Bevorzugte Masse - Tabelle	734.4685

Tabelle 1. Voraussetzungen und Rahmenbedingungen für die HPLC-ESI-Q-TOF-MS-Analyse von Arzneimitteln in Wasser Matrizen verwendet. Es ist ratsam, einen Spülung Schritt zwischen die chromatographische läuft durch eine Stichprobe von reinen Reinstwasser zwischen zwei Analysen ausgeführt oder durch Verlängerung der Laufzeit der chromatographische Methode um alle Stoffe zu eluieren einzuführen.

Tabelle 2: Pharma in den Rhein River Probe mit ihre Retentionszeit, theoretische gefunden und beobachtet [M + H]⁺ und deren Struktur. Der ESI-Modus eingestellt wurde zu positiv, so dass [M + H]⁺-Ionen wurden erkannt. Die Verweilzeit kann minimal üblichen experimentellen bekannten Gründen variieren.

	pH 3	pH 3	pH 7	pH 7	pH 7	pH 7	pH 7	pH 7	pH 9	pH 9	pH 9	pH 9
Produkt	k1 [min-1]	t1/2 [min] (k1)	k1 [min-1]	k2 [min-1]	k3 [min-1]	t1/2 [min] (k1)	t1/2 [min] (k2)	t1/2 [min] (k3)	k1 [min-1]	k2 [min-1]	t1/2 [min] (k1)	t1/2 [min] (k2)
Ery A	0.1	6.81	0,59	-	-	1.18	-	-	0.21	-	3.37	-
Ery B	0.05	14,23	0.66	-	-	1.04	-	-	0,22	-	3.21	-
Ery A – H2Oa	0,11	6.53	0,59	-	-	1.17	-	-	0,19	-	3.72	-
Ery A – H2Ob	0,15	4,76	1.11	-	-	0,63	-	-	0.21	-	3.35	-
Ery F	nicht eingehalten	-	0,89	0,35	-	0.78	1,98	-	1.09*	-	0.64	-
Ery C	nicht bestimmt	-	0,74	5.27	0.78	0,94	0.13	0,89	0,17	0.18	4.04	3.92
DPEry192	0.35*	1.97	nicht eingehalten	-	-	-	-	-	0.30*	-	2.34	-
* Keine weiteren Abbau beobachtet

Tabelle 3. Kinetische Geschwindigkeitskonstanten und entsprechenden Halbwertszeit für den Abbau von Erythromycin und seine Photodegradates, adaptiert von Voigt Et Al. ²⁷ . Erythromycin besteht aus Erythromycin A, Erythromycin B und zwei Formen des Anhydroerythromycin. Drei Photodegradates wurden beobachtet. Es werden als Ery F, Ery C und DEry192 bezeichnet.

Diskussion

Beispiel für eine ungezielte Analyse in diesem Bericht vorgestellten demonstriert die Identifizierung von Arzneimitteln in Oberflächenwasser mit HPLC-ESI-Q-TOF-MS, MS/MS und Vergleich mit Referenz Standards als der endgültige Beweis. Die Stärke der ungezielte Analyse mit TOF-MS basiert auf der Erkennung aller Ionen an einer bestimmten Verweildauer und die Hohe Massengenauigkeit führt zu die Vorhersage der vorläufige Molekulare Formel. Als Alternative zu einem TOF Massenspektrometer wurde die Anwendung von einem orbital Ionenfallen für Schadstoff-Analysen im Wasser⁴⁴beschrieben. Die Summenformel Vorhersage diente als Ausgangspunkt zum schnellen Referenzstandards auswählen. Die Anwendung der gezielten MS Methode des Q-TOF-MS Instruments erlaubt die Erkennung von bestimmten Verbindungen, da nur vorgewählte Ionen der Quadrupol-Filter übergeben. Im Allgemeinen wird die gezielte Analyse mit triple Quadrupol-Massenspektrometer auch in Wasser Analyse⁴⁵durchgeführt. Um die Abweichung von der theoretischen Masse durch instrumentale Mängel auszugleichen, könnte ein chromatographischer Vergleich mit einer Referenz-standard durchgeführt werden. Die gezielte MS/MS-Methode kann auch zur Identifizierung Analyse gewählt werden. Hier werden Ionen ausgewählt, fragmentiert und deren Bruchstücke erkannt. Da MS/MS weniger empfindlich als MS ist, war die Konzentration von Arzneimitteln in den untersuchten Wasserproben zu niedrig, um sinnvolle Fragmente ergeben. Wenn Fragmente erkannt werden, können Verbindungen mit mehr Zuversicht identifiziert werden. Die unzureichende Sensitivität könnte durch die Konzentration einer größeren anfängliche Wasser Probenvolumen überwunden werden. Darüber hinaus sollte die Messung werden so bald wie möglich nach der Probenahme wegen möglicher Bioabbau^46,47,48,49durchgeführt. Andernfalls sollten Proben bei-20 ° C, zusammengesetzte Abbau oder Reaktion auszuschließen gelagert werden.

Manchmal erscheinen die gleichen m/Z-Werte bei unterschiedlichen Aufbewahrungszeiten. Dies ist möglicherweise aufgrund, dass die Isomere verschiedene analytische Techniken erfordern. Es kann auch vorkommen, dass keine Verbindungen möglicherweise überhaupt erkannt werden, die nicht unbedingt ihre Abwesenheit beweisen. Sie können einfach nicht Form Ionen oder unterhalb der Nachweisgrenze auftreten. Die Art des Wassers übt auch einen Einfluss auf das Vorhandensein von Arzneimitteln. Arzneimittel geben Sie selten Quellwasser und Grundwasser im Vergleich zu Abwasser und Abwasser von Abwasser Behandlung Pflanzen^{48,50,51,52,53}.

Für die Abbau-Experimente sollte die Bestrahlung Quelle im Voraus geprägt sein, da das Photon Flux oder Photon Fluence Rate der Lampe erheblich zum Abbau und der Mechanismus der Schädigung beiträgt. Für erste Versuche, eine VUV/UVC Lampe reicht wahrscheinlich eine Niederdruck Quecksilber-Lampe. Im allgemeinen beschleunigt die Zugabe von Wasserstoffperoxid H₂O_2, den Abbau^27,36,37,54. Wenn eine andere Lampe, zB. eine UVA-Lampe verwendet, die Bildung von Hydroxyl-radikale sollte sichergestellt werden, zB., durch die Zugabe von Titandioxid- ^{23,24,30, 31}. aus vielen Verbindungen, wie z. B. Erythromycin, OH-radikale als Foto-Reaktivität der pharmazeutischen Industrie selbst²⁷Arten sind die Abbau-induzierende.

Für die Ermittlung der kinetischen Parameter ist das Gebiet der Signale in die Masse erkannt Chromatogramme, Konzentration, vertreten im Vergleich zur Bestrahlungszeit aufgetragen. Um die Daten passen, ist es ratsam, entsprechende Software verwenden. Hier wurde die Kurve Fitting Tool von MATLAB verwendet ermöglichte es, um schnell berechnen und passen die Daten mit den korrekte Gleichungen. Die kinetische Zwischenprodukte komplexer Gleichungen bestimmt. Die Qualitätsparameter für die Passform, dh., R² und RMSE, wurden ohne weiteres auch erhalten.

Diese Studie zeigte die Analyse von Flusswasser zur Detektion und Identifizierung von pharmazeutischen Schadstoffe und die Photodegradation von Erythromycin in Reinstwasser. In ökologischen Gewässern, wie z. B. Oberflächenwasser würden unterschiedliche Abbau Geschwindigkeiten und Geschwindigkeitskonstanten wegen lichtabsorbierende Stoffe wie Humins ermittelt werden. Nach Erfahrung der Autoren erfolgt Abbau oft mehr langsam, manchmal aber auch bei vergleichbaren Preisen^41,56.

Das weltweite Problem von Arzneimitteln, insbesondere Antibiotika, in der aquatischen Umwelt und die daraus resultierenden Gefahren noch weiter¹wachsen. Aufgrund der Vielzahl und Vielfalt von Chemikalien, Metaboliten, und degradates, ungezielte Analyse werden die wichtigsten analytischen Waffe für ihre Entdeckung in der Umgebung-⁵⁷. Für die effektive Beseitigung, neue Stadien in Kläranlagen werden basierend auf fortgeschrittenen Oxidationsprozesse entworfen muss, kann die UV-Bestrahlung Teil sein.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methanol for liquid chromatography LiChrosolv	Merck	1060181000
formic acid	Fluka	94318
HCl	Riedel-de Haen
NH3	Riedel-de Haen
Simplicity 185 Water Purification System	EMD Millipore		for producing MilliQ-water
Erythromycin	BioChemica AppliChem	A2275,0005
Filter Rotilabo-filter, Typ 113A	Roth	AP78.1
SPE-Cartridges Oasis HLB 3cc (60mg)	Waters	WAT094226
BAKER SPE-12G	J.T. Baker
membrane pump PC3001 VarioPro	Vacuubrand
rotary evaporator; Laborota 4000 efficient	Heidolph Instruments
syringe, 2 mL	Terumo
Nylon Syringe Filters Target2	Thermo Scientific	10301345
C-18 CoreShell column 50 mm x 2.1 mm dimensions, 2.6 μm particle size	Thermo Scientific
HPLC 1200	Agilent
ESI-Q-ToF-MS 6530	Agilent
photoreactor, UV Labor Reactor System 3	Peschl Utraviolet GmbH
VUV/UVC-lamp, TNN 15/32, 15 W	Heraeus
pH-meter, pHenomenal pH 1100L	vwr	662-1657
magnetic stirrer	Heidolph Instruments
MassHunter Workstation B.06.00	Agilent
MATLAB R2016b	Mathworks