Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Zusammenfassung

Toeprinting zielt darauf ab, die Möglichkeit der in-vitro- Messung transkribierte RNA zu Form Übersetzung Einleitung komplexe mit Ribosomen unter den unterschiedlichsten Bedingungen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für Toeprinting Säugetieren RNA und kann zur GAP-abhängige und IRES-driven Übersetzung zu studieren.

Zusammenfassung

Übersetzung Einleitung ist der Rate-limiting Schritt der Proteinsynthese und ist einen wesentlichen Punkt, bei dem Zellen ihre Protein-Produktion regulieren. Verordnung der Proteinsynthese ist der Schlüssel zur zellulären Stressantwort und Dysregulation ist zentral zu vielen Krankheitszuständen, wie z. B. Krebs. Obwohl zellulären Stress zu die Hemmung der globalen Übersetzung durch mildernde GAP-abhängige Initiation führt, sind bestimmte Stressantwort Proteine beispielsweise selektiv auf GAP-unabhängige Weise übersetzt. Diskrete RNA regulatorische Elemente, wie z. B. zelluläre interne Ribosom Eintrag Websites (IRESes), ermöglichen die Übersetzung dieser spezifischen mRNAs. Identifizierung von solchen mRNAs und die Charakterisierung ihrer regulatorischen Mechanismen wurden ein wichtiger Bereich in der molekularen Biologie. Toeprinting ist eine Methode für die Untersuchung von RNA-Struktur und Funktion betrifft Übersetzung Einleitung. Das Ziel des Toeprinting ist zur Beurteilung der Fähigkeit von in-vitro- transkribierte RNA bilden stabile komplexe mit Ribosomen unter verschiedensten Bedingungen, um festzustellen, welche Sequenzen, Strukturelemente oder Zubehör Faktoren im Ribosom beteiligt sind verbindlich – ein Vorläufer für effiziente Übersetzung Einleitung. Neben anderen Techniken, wie westliche Analyse und Polysome profiling ermöglicht Toeprinting eine robuste Charakterisierung der Mechanismen zur Regulierung der Übersetzung Einleitung.

Einleitung

Wie die Übersetzung die zelluläre Energie verbraucht, ist es sinnvoll, dass Übersetzung streng regulierte¹ist. Umgekehrt, Dysregulation der Übersetzung- und den daraus resultierenden Änderungen in Protein-Ausgabe-oft in Stress-Reaktion und Krankheit Staaten, z. B. Krebs^1,2eingehalten wird. Ein großer Vorteil der translational Control ist die Geschwindigkeit, mit der Zellen ihre Protein-Produktion verändern können, um auf verschiedene Reize³reagieren. Übersetzung-Verordnung stellt somit einen wichtigen Mechanismus, der Zelle überleben und Tod^1,2,3beeinflussen können. Von den Stufen des Übersetzung ist Initiation die meisten hoch regulierten und komplexen³. Kurz, enthalten die meisten eukaryontischen mRNAs eine 5' m⁷G Mütze, die fast immer für ihre Übersetzung unerlässlich. GAP-abhängige Initiation erfordert eukaryotic Initiation Faktoren eIF4E, eIF4A und eIF4G (GAP-Anerkennung Komplex), mit 5'-Ende der mRNA zu interagieren. 43 preinitiation Ribosomen Komplex, enthält eIF2 gebundene Initiator tRNA und eIF3, wird eingestellt, um die 5'-Ende der mRNA durch eine Wechselwirkung von eIF4G mit eIF3. Die komplexen Preinitiation wird gedacht, um mRNA, unterstützt von eIF4A Scannen (ein RNA-Helikase) bis der Start-Codon (AUG) befindet. Die 48er Einleitung komplexer entsteht anschließend und tRNA wird in der P-Seite von dem Ribosom geliefert. Schließlich sind die 60er und 40er Ribosomen-Untereinheiten vereint bilden die 80er Jahre Einleitung Komplex, gefolgt von Übersetzung Dehnung^1,3,4. Im Gegensatz dazu umgehen interne Ribosom Eintrag Websites (IRESes) die Voraussetzung für eine 5' Kappe durch die Rekrutierung der 40er Jahre ribosomalen Untereinheit direkt an die Einleitung Codon³. Physiologischen Spannungszustände dämpfen globale mRNA Übersetzung aufgrund von Änderungen der wichtigsten allgemeinen eukaryotischen Einleitung Faktoren (WDVS). Jedoch nicht-kanonischen Übersetzung Einleitung Mechanismen erlauben selektive Übersetzung bestimmter mRNAs, die oft Stressantwort Proteine codieren und Dysregulation der nicht-kanonischen Übersetzung Initiation ist bei Krankheitszuständen wie Krebs verwickelt ^{1 , 2}. diskret RNA regulatorische Elemente, wie z. B. zelluläre IRESes zu ermöglichen, für die Übersetzung von solchen mRNAs^2,3.

Ein besonders interessanter Aspekt von translational Control ist es, Mechanismen der kanonischen versus nicht-kanonischen Übersetzung von einem bestimmten mRNA zu verstehen. Toeprinting ist eine Technik, die der mechanistischen Detailstudie über Übersetzung Einleitung der spezifischen RNAs in Vitroermöglicht. Das Ziel des Toeprinting ist die Fähigkeit einer RNA von Interesse, die Bildung von einer Übersetzung Initiation Komplex mit dem Ribosom unter verschiedensten Bedingungen, um festzustellen, welche Sequenzen, Strukturelemente oder Accessoire Keimbildung zu bewerten Faktoren sind für effiziente Übersetzung Einleitung erforderlich. Beispielsweise könnte Ribosom Rekrutierung in Ermangelung eines 5'-Cap behindert aber angeregt durch die Anwesenheit von einer IRES.

Das Prinzip der Technik ist, in-vitro- transkribieren eine RNA von Interesse, es in Anwesenheit von Zellextrakten mit Übersetzung (oder die gereinigten Komponenten) ermöglichen Einleitung komplexe zu bilden, und umgekehrt zu transkribieren inkubieren die RNA mit einem speziellen Primer. Stabile RNA-Ribosom komplexe verursacht reversen Transkription zum Strömungsabriss am 3' Rand der Ribosom-die so genannte 'Toeprint'^5,6,7.

In diesem Protokoll der ribosomalen Untereinheiten, WDVS, tRNAs und IRES Trans-wirkenden Faktoren (ITAFs) werden bequem durch Kaninchen Retikulozytenzahl lysate (RRL) beigetragen. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von Primer eindringmittel beschriftet und Fluoreszenz Gel-basierte Imager, anstatt einer radioaktiven Grundierung. Dadurch entfallen zusätzliche Schritte, einschließlich enzymatische die Grundierung sowie das Gel Trocknen und setzen Sie sie auf eine Intensivierung Bildschirm. Die fluoreszierende Bänder werden in Echtzeit, als die Gel läuft, ermöglicht größere Auflösung aufgezeichnet. Entdeckelte X-chromosomal-Inhibitor von Apoptosis Protein (XIAP) IRES RNA wird hier, als Beispiel verwendet, obwohl angeschnittene Ärmel mRNAs auch mit dieser Technik⁸analysiert werden kann.

Im Gegensatz zu westlichen Analyse, die die endgültige Ausgabe des Übersetzungsprozesses in Zelle Lysates misst, ist Toeprinting ein in-vitro- Ansatz zur Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf einer RNA zu messen. Diese reduktionistische Ansatz ermöglicht es, für die sehr detaillierte Untersuchung von Substraten oder Faktoren, die Übersetzung Einleitung zu regulieren (zB., angeschnittene Ärmel oder UN-angeschnittene Ärmel mRNA, IRES-Struktur, Vorhandensein oder Fehlen von Poly-A Tail, Bestimmung von spezifischen Proteins Faktoren, ( usw.). Daher kann Toeprinting verwendet werden, verschiedene Modi der Übersetzung⁸ oder die Auswirkungen der mRNA Strukturen, z. B. IRESes, am Protein Synthese^9,10zu studieren.

Protokoll

Hinweis: RNA ist sehr anfällig gegen Abbau durch Ribonuclease (RNases). Vorkehrungen Sie treffen, standard, die RNA intakt zu halten. Ändern Sie häufig Handschuhe. Verwenden Sie gefilterte Pipettenspitzen, Nuklease-freie Plastikware und Nuklease-freie Chemikalien in allen Schritten des Protokolls. Nuklease-freie Nutzung oder Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC)-behandeltes Wasser für alle Lösungen.

1. Vorbereitung der Lösungen

1. Toeprinting Puffer vorzubereiten: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM KOAc, 2,5 mM Mg(OAc)₂, 5 % (w/V) Saccharose, 2 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,5 mM Spermidine.
   1. Speichern Sie DVB-t und Spermidine in Einweg-Aliquote bei-20 ° C, wiederholte Frost-Tau-wechseln zu vermeiden.
      Hinweis: DVB-t und Spermidine sollte in den Puffer Toeprinting unmittelbar vor der Anwendung hinzugefügt werden. Eine Lösung ohne DVB-t und Spermidine kann bei-20 ° c gelagert werden
2. Bereiten Sie Aliquote von 85 mM-5'-Guanylyl-Imidodiphosphate (GMP-PNP) und 91 mM Adenosintriphosphat (ATP). Speichern der Aliquote bei-20 ° C.
3. 450 mL 6 % Polyacrylamid - 7M Harnstoff Gel Mischung vorbereiten: 67,5 mL 40 % Acrylamide:bis-Acrylamid (19:1), 189 g Harnstoff, 112,5 mL 5 x TBE (Tris/Borat/Thylenediaminetetraacetic Säure (EDTA)) und 120 mL Wasser. Lösen Sie den Harnstoff durch Erwärmung im Wasserbad 37 ° C oder auf einer Heizplatte unter Rühren auf. Filtern Sie die Lösung (zB., 0,2 μm Nitrozellulose Vakuumfilter).
   Hinweis: Die Lösung kann bei 4 ° C für mindestens einen Monat aufbewahrt werden.
   Achtung: Monomere Acrylamid ist ein Nervengift, das durch die Haut absorbiert werden kann. Achten sehr darauf, Kontakt mit der Haut zu vermeiden (zB., tragen Sie Handschuhe, einen Laborkittel und Augenschutz). Polyacrylamid sollte auch mit Sorgfalt, behandelt werden, wie Polymerisation nicht 100 % vollständig erfolgen kann.
4. Formamid laden Farbstoff vorbereiten: 95 % Formamid, 18 mM EDTA, 0,025 % (w/V) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS), 0,025 % (w/V) Bromophenol Blue, Xylol Cyanol 0,025 % (w/V). Shop bei-20 ° C.
5. 1 Nmol Grundierung (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' Ende beschriftet mit IRDye 800) in 100 μl Wasser für eine arbeiten-Konzentration von 10 Pmol/μL auflösen. Bei-20 ° C in Einweg-Aliquote (ca. 10 µL), vor Licht geschützt aufbewahren.

2. Vorbereitung der mRNA

1. DNA-Templates für die Synthese von mRNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus entsprechende Vorlagen zu verstärken (i.e., genomische DNA oder Plasmid DNA, je nach Bedarf). Verwenden Sie ein High-Fidelity-DNA-Polymerase gemäß den Anweisungen des Herstellers, mit den folgenden Reaktionsbedingungen (35 Zyklen): Schmelzen, 98 ° C, 10 s; Tempern, 53 ° C, 20 s; verlängern, 72 ° C, 30 s.
   Hinweis: Der forward Primer (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) beinhaltet die T7 promotorsequenz für RNA-Transkription ermöglichen; die rückwärts-Primer (5' T₅₁GAATTCGGATCCGACCGTGG) umfasst 51 Thymin Rückstände um ein Poly-A-Rute für die transkribierten RNA zu bieten. Beachten Sie, dass RNA auch in Vitro von Plasmid DNA transkribiert werden kann.
2. Einsatz eines entsprechenden Transkription-Kit zur in-vitro- Transkription IRES-haltigen RNA oder angeschnittene Ärmel RNA aus der DNA-Vorlage. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Die RNA-Probe in 20 μL Reaktion Standardvolumes vorbereiten. Behandeln Sie die neu synthetisierten RNA mit 2 Einheiten von RNase-freie DNase für 30 min bei 37 ° C.
3. Verdünnen Sie die DNase-behandelten RNA auf 110 µL mit Nuklease-freies Wasser hinzufügen 110 µL Säure Phenol, Wirbel 5 s und Zentrifuge für 3 min bei 20.000 x g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie 100 µL der wässrigen Phase zu einem neuen 1,5 mL Microfuge Schlauch zu, fügen Sie 10 µL 3 M Natriumacetat und Vortex 2 s. hinzufügen, 3 Bände von 100 % Ethanol, Wirbel 5 s und überstürzen Sie sich die RNA bei-20 ° C über Nacht.
4. Zentrifugieren bei > 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C und der Überstand verwerfen. Waschen Sie die Tablette mit 500 µL eiskalte 70 % (V/V) Ethanol und wiederholen Sie die Zentrifugation. Aspirieren Sie so viel des Überstands wie möglich und trocknen Sie das Pellet für 5-10 min. vorsichtig nicht zu die Pellets zu verdrängen sein.
5. Aufschwemmen der RNS in das entsprechende Volumen der Nuklease-freies Wasser um eine arbeiten-Konzentration von 0,5 μg/μL zu erzielen. Dies kann bei-80 ° C gelagert oder sofort verwendet werden.

3. Toeprinting Reaktion

1. Mix 15 μl der Kaninchen Retikulozytenzahl Lysate (RRL, nicht Nuklease behandelt), 1 μl RNase-Inhibitor, 1 µL 91 mM ATP (1,82 mM final) und 1 μL von 85 mM GMP-PNP-(1,7 mM final) in einer 1,5 mL Microfuge Röhre (40 Einheiten). Bei 30 ° C für 5 min inkubieren.
   Hinweis: Die RRL regelmäñig für den einmaligen Gebrauch, sich wiederholende Einfrieren Auftauen zu vermeiden sollte. Eine kritische Kontrolle ist eine Reaktion fehlt RRL, um die natürlichen Pausen der reversen Transkription durch die sekundäre Struktur der RNA aufzuklären. Fügen Sie Toeprinting Puffer um RRL für dieses Steuerelement zu ersetzen.
2. Fügen Sie 0,5 µg RNA (1 µL) und bei 30 ° C für 5 min inkubieren.
3. Fügen Sie 22 µL Toeprinting-Puffer und bei 30 ° C für 3 min inkubieren.
4. Hinzufügen von 0,5 µL (5 Pmol) mit der Bezeichnung von IRDye Grundierung und inkubieren Sie für 10 min auf Eis.
5. Fügen Sie 2 µL 25 mM dNTPs (Endkonzentration: 1 mM), 2 µL 100 mM Mg(OAc)₂, 1 µL des Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transkriptase (AMV-RT) und 3,5 µL Toeprinting-Puffer. Der letzte Band ist 50 μL.
6. Inkubieren Sie die Reaktion bei 30 ° C für 45 min.
7. 200 µL Nuklease-freies Wasser hinzufügen und sofort mit 250 µL 25:24:1 Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (pH-Wert ca. 8.0) zu extrahieren. Vortex 5 s und Zentrifuge bei 20.000 x g für 3 min bei Raumtemperatur. Entfernen der wässrigen Phase zu einem neuen 1,5 mL Microfuge Schlauch, 3 Bände von 100 % Ethanol, Wirbel 5 s hinzufügen und über Nacht bei-20 ° C Niederschlag.
8. Zentrifugieren bei > 20.000 x g für 30 min bei 4 ° C und der Überstand verwerfen. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 500 µL eiskaltes Ethanol 70 % (V/V). Zentrifugieren bei > 20.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Aspirat soviel überstand als möglich und mit Luft trocknen das Pellet für 5-10 min. nicht zu verdrängen das Pellet vorsichtig sein.
9. Das Pellet in 6 μL der Nuklease-freies Wasser auflösen und 3 μl Formamid laden Farbstoff hinzufügen.

4. Sequenzierung Reaktionen

1. Verwenden Sie der DNA-Vorlage von 2.1 und die IRDye beschriftet Grundierung aus Schritt 3.4 für standard-Sequenzierung Reaktionen, mit Dideoxynucleotides (DdNTPs) als Kette Terminatoren. Verwenden Sie eine entsprechende DNA-Sequenzierung Kit und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
2. Mix 6 μL jeder Sequenzierung Reaktion mit 3 μl Formamid Farbstoff beladen.

5. Vorbereitung der Sequenzierung Gel und Elektrophorese

Hinweis: Dieses Protokoll verwendet eine Fluoreszenz-Gel-basierten-Imager und eine 21 cm x 23 cm x 0,2 mm Gel, sondern kann bei Bedarf für andere Sequenzer oder Gel-Größen angepasst werden.

1. Reinigen Sie 0,2 mm spacer sowie die kurzen (23 × 25 cm) und lange (30 × 25 cm) Glasplatten mit 100 % igem Ethanol gründlich. An der Luft trocknen.
2. Mischung 30 mL 6 % Polyacrylamid - 7M Harnstoff Gel zu mischen, mit 200 μl 10 % (w/V) Ammonium Bleichen (APS) und 20 μL der Tetramethylethylenediamine (TEMED). Gießen Sie Gel, kümmert sich um die Vermeidung von Luftblasen, und fügen Sie den "Hai-Zahn" Gel Kamm. Lassen Sie das Gel für 1 h bei Raumtemperatur zu polymerisieren.
3. Die Sequenzierung Apparat zusammenbauen und füllen Sie den Behälter mit 1 X TBE.
4. Bereits für 15 min bei 1500 V laufen Sie, bis die optimale Temperatur von 55 ° C erreicht wird.
5. Erhitzen Sie den Probenaufnahme/Farbstoff-Mix (aus Schritte 3,9 oder 4.2) auf 85 ° C für 5 min. Last 1 μL auf die Sequenzierung Gel.
6. Führen Sie das Gel bei 1500 V für 8 h. Das Gerät liest die Bands in Echtzeit.
7. Zerlegen Sie das Gerät zu, und entsorgen Sie die Acrylamid-Gel und laufenden Puffer.

Ergebnisse

Zuvor haben wir die Möglichkeit der XIAP IRES zur Unterstützung von GAP-unabhängige Übersetzung Einleitung in-vitro-^8,10beschrieben. Toeprinting war der Key-Technik, die mechanistischen Details der komplexen XIAP IRES Einleitung zu befragen. Ein DNA-Konstrukt Codierung eine mRNA mit XIAP IRES (Abb. 1A) wurde in Vitro transkribiert und Toeprinting Analyse unterzog...

Diskussion

Toeprinting ist eine leistungsstarke Technik, die Möglichkeit einer RNA von Interesse, die Bildung von Übersetzung Einleitung komplexen unter sehr kontrollierten Bedingungen unterstützen direkt zu messen. Dieses Protokoll beschreibt eine vereinfachte Technik für Toeprinting Säugetieren RNAs. Kaninchen Retikulozytenzahl lysate (RRL) dient als bequeme Quelle von Ribosomen, WDVS, Initiator tRNA und IRES Trans-wirkenden Faktoren (ITAFs). Der Experimentator bietet ihre RNA der Wahl und kann auch die Toeprinting ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC (Diethyl pyrocarbonate)	Sigma	D5758-100ML
TRIS base, Ultrapure	JT Baker	4109-01
KOAc (Potassium acetate)	Bio Basic	PB0438
Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate)	Bio Basic	MB0326
Sucrose, molecular biology grade	Calbiochem	573113-1KG
Spermidine	Sigma	85558
GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution	Sigma	G0635
ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution	Sigma	A6559
19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40%	Bio Basic	A0006
Urea	Bio Basic	UB0148
500mL bottle top filtration units, 0.2 µm	Sarstedt	83.1823.101
Formamide	Sigma	F9037-100ML
EDTA (disodium salt, dihydrate)	Bio Basic	EB0185
SDS	Bio Basic	SB0485
Bromophenol blue	Bio Basic	BDB0001
Xylene cyanol FF	Bio Basic	XB0005
MEGAshortscript T7 transcription kit	Ambion	AM1354
mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit	Ambion	AM1344
Acid Phenol:Chloroform (5:1)	Ambion	AM9722
25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol	Invitrogen	15593-049
Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated.	Green Hectares, USA		Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL)	Thermo Fisher	E00382
100 mM dNTPs	Invitrogen	56172, 56173, 56174, 56175	Mix equal parts for a stock of 25 mM each.
AMV-RT, 10 U/µL	Promega	M5101
Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit	Thermo Fisher	707701KT
Model 4200 IR2 DNA analyzer	LI-COR		Product has been discontinued
APS (Ammonium Persulfate)	Bio Basic	AB0072
TEMED	Bio Basic	TB0508
Phusion High Fidelity Polymerase	New England Biolabs	M0530
Turbo Dnase	Thermo Fisher	AM2238