Análise de Toeprinting de formação do complexo iniciação tradução de mRNAs mamíferos

Resumo

Toeprinting visa medir a capacidade de in vitro transcrito de RNA para formar complexos de iniciação de tradução com ribossomas sob uma variedade de condições. Este protocolo descreve um método para mamíferos RNA toeprinting e pode ser usado para estudar a tradução tanto cap-dependente e IRES-driven.

Resumo

Iniciação da tradução é a etapa limitante da síntese de proteínas e representa um ponto-chave na qual células regulam a produção de proteína. Regulação da síntese de proteínas é a chave para a resposta de estresse celular e desregulação é central para muitos Estados de doença, como o câncer. Por exemplo, embora o estresse celular leva para a inibição da tradução global pela atenuante cap-dependente iniciação, certas proteínas de estresse-resposta seletivamente são traduzidas em uma forma independente de cap. Discreto do RNA dos elementos reguladores, tais como sites de entrada celular Ribossoma interno (IRESes), permitem a tradução destes mRNAs específicos. Identificação de tais mRNAs e a caracterização dos seus mecanismos reguladores, tem sido uma área-chave em biologia molecular. Toeprinting é um método para o estudo da estrutura do RNA e função no que tange a iniciação da tradução. O objetivo do toeprinting é avaliar a capacidade do in vitro transcrito de RNA para formar complexos estáveis com ribossomas sob uma variedade de condições, a fim de determinar quais sequências, elementos estruturais ou acessórios fatores estão envolvidos no Ribossoma ligação — um pré-cursor para a iniciação da tradução eficiente. Ao lado de outras técnicas, tais como análise ocidental e polysome de perfil, toeprinting permite uma caracterização robusta de mecanismos para a regulação da iniciação da tradução.

Introdução

Como tradução consome energia mais celular, faz sentido que a tradução é fortemente regulamentado¹. Por outro lado, a desregulação da tradução- e as consequentes alterações na saída de proteína-é frequentemente observada nos Estados-resposta ao estresse e doenças, como câncer,^1,2. Uma grande vantagem do controle de translação é a velocidade com que as células podem alterar sua saída de proteína para responder a vários estímulos³. Regulamento de tradução, portanto, representa um importante mecanismo que pode influenciar a sobrevivência da pilha e morte^1,2,3. As etapas da tradução, a iniciação é o mais altamente regulamentado e complexo³. Brevemente, mais eucarióticos mRNAs contêm uma 5' m⁷G tampa que quase sempre é essencial para a sua tradução. Cap-dependente iniciação requer iniciação eucariótico fatores eIF4E, eIF4A e eIF4G (o complexo cap-reconhecimento) para interagir com a extremidade 5' do mRNA. 43S preinitiation ribosome complexo, que contém o limite eIF2 iniciador tRNA e eIF3, é recrutado à extremidade 5' do mRNA através de uma interação de eIF4G com eIF3. A complexo de pré-iniciação é pensada para fazer a varredura do mRNA, auxiliado por eIF4A (um RNA helicase) até que o códon de início (AUG) está localizado. A complexo de iniciação 48S posteriormente é formada e tRNA é entregue para o P-site do ribosome. Finalmente, as subunidades 60S e 40S do Ribossoma são Unidas para formar o início dos anos 80 complexo, seguido de tradução alongamento^1,3,4. Em contraste, sites de entrada interno Ribossoma (IRESes) contornar a exigência de uma 5' cap, recrutando a subunidade ribossomal 40S diretamente para o codão de iniciação³. Condições de estresse fisiológico atenuam global tradução de mRNA devido a modificações dos fatores chave geral iniciação eucariótico (eIFs). No entanto, mecanismos de iniciação da tradução não-canônicos permitam tradução seletiva de certos mRNAs que muitas vezes codificam proteínas de estresse-resposta, e desregulação da iniciação da tradução não-canônicos está implicada em doenças como o câncer ^{1 , 2}. elementos reguladores de RNA discreto, tais como IRESes celular, permitam a tradução de tais mRNAs^2,3.

Um aspecto particularmente interessante de controle de translação é compreender os mecanismos da canonical versus não-canônicos tradução de um mRNA determinado. Toeprinting é uma técnica que permite o estudo detalhado e mecanicista de iniciação da tradução de RNAs específicos in vitro. O objectivo geral de toeprinting é para avaliar a capacidade de um RNA de interesse de nucleada a formação de um início de tradução complexa com o ribossoma sob uma variedade de condições, a fim de determinar quais sequências, elementos estruturais ou acessório fatores são necessários para a iniciação da tradução eficiente. Por exemplo, recrutamento de Ribossoma pode ser prejudicado na ausência de um cap 5' mas estimulado pela presença de um IRES.

O princípio da técnica é in vitro transcrever um RNA de interesse, incube-lo na presença de extratos celulares contendo componentes de tradução (ou os componentes purificados) para permitir que transcrevem complexos de iniciação ao formulário e para reverter o RNA com um primer específico. Complexos estáveis de RNA-Ribossoma causará a transcrição reversa de empatar na extremidade 3' do Ribossoma, o so-called 'toeprint'^5,6,7.

No presente protocolo, subunidades ribossomais, eIFs, os tRNAs e IRES trans-fatores de atuação (ITAFs) são convenientemente contribuídos por Reticulócito coelho lisado (RRL). Outra vantagem deste protocolo é o uso de um primer fluorescente-etiquetadas e Imageador de fluorescência com base em gel, ao invés de um primer radiolabeled. Isso elimina etapas extras, incluindo radioativos o primer, bem como a secagem do gel e expô-lo a uma intensificação da tela. As bandas fluorescentes são registadas em tempo real, como a execução de gel, permitindo a maior resolução. Destampada ligada ao X inibidor da apoptose RNA de IRES de proteína (XIAP) é usado como exemplo aqui, apesar de mRNAs tampados também podem ser analisados por esta técnica⁸.

Ao contrário da análise ocidental, que mede a saída final do processo de tradução em lisados celulares, toeprinting é uma abordagem in vitro para medir a formação do complexo tradução iniciação em um RNA. Esta abordagem reducionista permite o estudo altamente detalhado de substratos ou fatores que regulam a iniciação da tradução (EG., tampadas ou un-tampado mRNA, IRES estrutura, presença ou ausência de cauda poli-A, disposição de fatores específicos da proteína, etc.). Daí, toeprinting pode ser usado para estudar os diferentes modos de tradução⁸ ou os efeitos das estruturas de mRNA, tais como IRESes, na síntese de proteína^9,10.

Protocolo

Nota: O RNA é altamente suscetível à degradação por ribonucleases (RNases). Tome precauções padrão para manter o RNA intacto. Luvas mudam com frequência. Utilize pontas de pipetas filtrada, plasticware nuclease-free e livre de nuclease produtos químicos em todas as etapas do protocolo. Utilização livre de nuclease ou pyrocarbonate de dietilo (DEPC)-tratamento de água para todas as soluções.

1. preparação de soluções

1. Preparar o tampão de Toeprinting: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), KOAc, 2.5 mM Mg(OAc)₂, 5% (p/v) de sacarose, espermidina ditiotreitol (DTT) e 0,5 mM de 2 mM a 100 mM.
   1. Loja TDT e espermidina em alíquotas de uso único, a-20 ° C para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
      Nota: TDT e espermidina devem ser adicionados para o buffer de toeprinting, imediatamente antes do uso. Uma solução sem TDT e espermidina pode ser armazenada a-20 ° C.
2. Prepare alíquotas de 85 mM 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) e 91 mM trifosfato de adenosina (ATP). Armazenar as alíquotas a-20 ° C.
3. Preparar 450 mL de mistura de gel de 6% poliacrilamida - 7m ureia: 67,5 mL de acrylamide:bis de 40%-acrilamida (19:1), 189 g de ureia, 112,5 mL de 5 x TBE (Tris/borato/thylenediaminetetraacetic ácido (EDTA)) e 120 mL de água. Dissolva a ureia por aquecimento em banho maria a 37 ° C ou em um prato quente com agitação. Filtrar a solução (por exemplo., 0,2 μm filtro de vácuo de nitrocelulose).
   Nota: A solução pode ser armazenada a 4 ° C, durante pelo menos um mês.
   Cuidado: Acrilamida monomérica é uma neurotoxina que pode ser absorvida através da pele. Tome muito cuidado para evitar o contacto com a pele (i. e., um jaleco, luvas e proteção do olho). Poliacrilamida também deve ser manipulada com cuidado, como polimerização não pode proceder à realização de 100%.
4. Preparar o formamide tintura de carregamento: 95% formamida, 18 mM EDTA, 0.025% (p/v) Dodecil sulfato de sódio (SDS), 0.025% (p/v) de azul de bromofenol, xileno cianol de 0.025% (p/v). Loja a-20 ° C.
5. Dissolva 1 nmol de primer (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' fim-etiquetadas com 800 IRDye) em 100 μL de água para uma concentração de trabalho de 10 pmol/μL. Armazenar a-20 ° C em alíquotas de uso único (cerca de 10 µ l), protegido da luz.

2. preparação do mRNA

1. Modelos de DNA para a síntese de mRNA pela reação em cadeia do polymerase (PCR) de modelos apropriados de amplificar (i. e., DNA genômico ou Plasmídeo, conforme o caso). Usar uma alta fidelidade DNA polimerase de acordo com as instruções do fabricante, com as seguintes condições de reação (35 ciclos): derreter, 98 ° C, 10 s; recoze, 53 ° C, 20 s; estender, 72 ° C, 30 s.
   Nota: O primer para a frente (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) incorpora a sequência do promotor T7 para permitir a transcrição do RNA; o primer reverso (5' T₅₁GAATTCGGATCCGACCGTGG) inclui 51 resíduos de timina para fornecer uma cauda poli-A para o RNA transcrito. Observe que o RNA também pode ser em vitro transcrito do ADN do plasmídeo.
2. Uso um kit apropriado transcrição in vitro transcrever IRES contendo RNA ou ARN tampado partir do modelo de DNA. Siga as instruções do fabricante. Prepare a amostra de RNA em volumes de reação padrão 20 μL. Tratar o RNA recém sintetizado com 2 unidades de DNase RNase-livre por 30 min a 37 ° C.
3. Diluir o RNA DNase-tratada para 110 µ l com água livre de nuclease adicionar ácido fenol µ l 110, vórtice 5 s e centrífuga para 3 min a 20.000 x g à temperatura ambiente. Remover a 100 µ l da fase aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicionar 10 µ l de acetato de sódio 3M e vórtice 2 s. Add, 3 volumes de 100% de etanol, vórtice 5 s e precipitar o RNA a-20 ° C durante a noite.
4. Centrifugar a > 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Lave o pellet com 500 µ l de etanol a 70% (v/v) gelada e repita a centrifugação. Aspirar o máximo do líquido sobrenadante possível e deixe secar naturalmente a pelota para 5-10 min. tenha cuidado para não deslocar o pellet.
5. Ressuspender o RNA no volume adequado de água livre de nuclease para produzir uma trabalho de concentração de 0.5 μg/μL. Isto pode ser armazenado a-80 ° C ou usado imediatamente.

3. Toeprinting reação

1. Mix 15 μL de coelho lisado Reticulócito (RRL, nuclease não-tratados), 1 μL (40 unidades) de inibidor de RNase, 1 µ l de 91 mM ATP (1,82 mM final) e 1 μL de 85mm GMP-PNP (final de 1,7 mM) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Incube a 30 ° C por 5 min.
   Nota: O RRL deve ser aliquotada para uma única utilização evitar o congelamento-descongelamento repetitiva. Um controle crítico é uma reação que falta RRL, a fim de elucidar as pausas naturais da transcrição reversa devido a estrutura secundária do RNA. Adicione toeprinting reserva para substituir RRL para este controle.
2. Adicionar 0,5 µ g (1 µ l) de RNA e incubar a 30 ° C por 5 min.
3. Adicione 22 µ l de tampão de Toeprinting e incubar a 30 ° C por 3 min.
4. Adicionar 0,5 µ l (5 pmol) de primer IRDye-etiquetadas e incubar no gelo por 10 min.
5. Adicionar 2 µ l de dNTPs 25 mM (concentração final: 1 mM cada), 2 µ l de Mg(OAc)₂a 100 mM, 1 µ l de aviária Myeloblastosis vírus Transcriptase reversa (AMV-RT) e 3,5 µ l de tampão de Toeprinting. O volume final é 50 μL.
6. Incube a reação a 30 ° C, durante 45 min.
7. Adicionar 200 µ l de água livre de nuclease e extrair imediatamente com 250 µ l de 25:24:1 fenol: clorofórmio: isoamílico álcool (pH aproximadamente 8.0). Vórtice 5 s e centrifugar 20.000 x g por 3 min à temperatura ambiente. Retirar a fase aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, adicionar 3 volumes de 100% de etanol, vórtice 5 s e precipitar a-20 ° C durante a noite.
8. Centrifugar a > 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante. Lave o sedimento de DNA com 500 µ l de etanol a 70% (v/v) gelada. Centrifugar a > 20.000 x g durante 15 minutos a 4 ° C. Aspirado de sobrenadante, tanto quanto possível e ar seco que a pelota de 5-10 min. tenha cuidado para não deslocar o pellet.
9. Dissolva a pelota em 6 μL de água livre de nuclease e adicionar 3 μL de formamida tintura de carregamento.

4. reações de sequenciamento de

1. Use o modelo de DNA de 2.1 e o primer IRDye-rotulado de passo 3.4 para reações de sequenciamento padrão, usando dideoxynucleotides (ddNTPs) como terminadores de cadeia. Usar um kit de sequenciamento de DNA apropriado e siga as instruções do fabricante.
2. Mix 6 μL de cada reação de sequenciamento com 3 μL de formamida tintura de carregamento.

5. preparação do Gel e eletroforese de sequenciamento

Nota: Este protocolo usa um Imageador de fluorescência com base em gel e um 21 x 23 cm x gel de 0,2 mm, mas pode ser adaptado para outros sequenciadores ou gel-tamanhos, se necessário.

1. Limpe cuidadosamente os espaçadores de 0,2 mm, bem como o curto (23 x 25 cm) e tempo placas de vidro (30 × 25 cm) com 100% de etanol. Secar ao ar.
2. Misture 30 mL de gel de ureia de poliacrilamida - 7M 6% misturar com 200 μL de persulfato de amónio de 10% (p/v) (APS) e 20 μL de tempted (TEMED). Despeje o gel, com cuidado para evitar bolhas e inserir o ' tubarão ' gel de pente. Permitir que o gel polimerizar por 1h à temperatura ambiente.
3. Montar o aparelho de sequenciamento e encher os reservatórios com 1 x TBE.
4. Pre-executada por 15 min em 1500 V até que seja alcançada a temperatura ideal de 55 ° C.
5. Aqueça a mistura de corante de amostra/carregamento (a partir de passos 3.9 ou 4.2) a 85 ° C por 5 min. carga 1 μL para o gel de sequenciamento.
6. Funcione o gel em 1500 V em 8 h. A máquina vai ler as faixas em tempo real.
7. Desmontar o aparelho e elimine-o gel do acrilamido e buffer de execução.

Resultados

Descrevemos anteriormente a capacidade da IRES XIAP para apoiar a iniciação de tradução tampão-independente em vitro^8,10. Toeprinting foi a chave técnica para interrogar os detalhes mecanicistas da iniciação XIAP IRES complexo. Uma construção de DNA codificação um mRNA contendo o XIAP IRES (Figura 1A) estava em vitro transcritas e submetidas a análise de...

Discussão

Toeprinting é uma técnica poderosa para medir diretamente a capacidade de um RNA de interesse para apoiar a formação de complexos de iniciação da tradução em circunstâncias altamente controlados. Este protocolo descreve uma técnica simplificada para toeprinting mamíferos RNAs. Reticulócito coelho lisado (RRL) é usado como uma fonte conveniente de ribossomos, eIFs, iniciador tRNA e IRES trans-agindo fatores (ITAFs). O experimentador fornece seu RNA de escolha e também pode complementar a reação de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DEPC (Diethyl pyrocarbonate)	Sigma	D5758-100ML
TRIS base, Ultrapure	JT Baker	4109-01
KOAc (Potassium acetate)	Bio Basic	PB0438
Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate)	Bio Basic	MB0326
Sucrose, molecular biology grade	Calbiochem	573113-1KG
Spermidine	Sigma	85558
GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution	Sigma	G0635
ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution	Sigma	A6559
19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40%	Bio Basic	A0006
Urea	Bio Basic	UB0148
500mL bottle top filtration units, 0.2 µm	Sarstedt	83.1823.101
Formamide	Sigma	F9037-100ML
EDTA (disodium salt, dihydrate)	Bio Basic	EB0185
SDS	Bio Basic	SB0485
Bromophenol blue	Bio Basic	BDB0001
Xylene cyanol FF	Bio Basic	XB0005
MEGAshortscript T7 transcription kit	Ambion	AM1354
mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit	Ambion	AM1344
Acid Phenol:Chloroform (5:1)	Ambion	AM9722
25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol	Invitrogen	15593-049
Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated.	Green Hectares, USA		Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL)	Thermo Fisher	E00382
100 mM dNTPs	Invitrogen	56172, 56173, 56174, 56175	Mix equal parts for a stock of 25 mM each.
AMV-RT, 10 U/µL	Promega	M5101
Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit	Thermo Fisher	707701KT
Model 4200 IR2 DNA analyzer	LI-COR		Product has been discontinued
APS (Ammonium Persulfate)	Bio Basic	AB0072
TEMED	Bio Basic	TB0508
Phusion High Fidelity Polymerase	New England Biolabs	M0530
Turbo Dnase	Thermo Fisher	AM2238