Eisenchlorid-induzierte eckzahn Halsschlagader Thrombosen: Eine große Tiermodell der Gefäßverletzung

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen die Änderungen notwendig, ein gut charakterisierten und häufig verwendete kleine Eisenchlorid-induzierte (FeCl₃) Halsschlagader Verletzungen Tiermodell für den Einsatz in einem großen Tier gefäßverletzung Modell. Das resultierende Modell sowohl präklinische Studie Bewertung der prophylaktischen und thrombolytischen pharmakologische und mechanische Eingriffe einsetzbar.

Zusammenfassung

Okklusive arterielle Thrombose führt zu zerebralen ischämischen Schlaganfall und Herzinfarkt trägt zur 13 Millionen Todesfälle pro Jahr weltweit. Hier haben wir eine gefäßverletzung Modell aus ein kleines Tier in ein großes Tier (Hund), mit geringfügigen Änderungen übersetzt, die für präklinische Screening von prophylaktischen und thrombolytischen Agenten verwendet werden kann. Neben den chirurgischen Methoden beschreibt das geänderte Protokoll die schrittweisen Methoden zur Beurteilung der Arteria carotis Kanalisation mittels Angiographie, detaillierte Anweisungen verarbeitet das Gehirn und die Halsschlagader zur histologischen Untersuchung zur Überprüfung der a. carotis Kanalisation und Hirnblutung und spezifische Parameter um eine Beurteilung der nachgeschalteten thromboembolische Ereignisse zu vervollständigen, durch die Verwendung von Magnet-Resonanz-Tomographie (MRT). Darüber hinaus sind bestimmte verfahrenstechnische Änderungen von bereits etablierten kleinen Tiermodell notwendig, in ein großes Tier (Hund) gefäßverletzung übersetzen diskutiert.

Einleitung

Schlaganfall-Therapie ist weitgehend nachempfunden Behandlung koronarer Erkrankungen, vor allem, weil die Eingriffe in die Herz-Kreislauf-Krankheit auch auf Drogen-Therapie und endovaskulären Interventionen¹reagiert haben. Diese Behandlungen sind jedoch nicht erfolgreich, Hirninfarkt übersetzt. Die Schwierigkeiten mit der aktuellen Schlaganfallbehandlung sind, dass recombinant Tissue Plasminogen Activator (Rtbpa) rückgängig gemacht werden kann und Verwaltung birgt ein erhebliches Risiko von 6,4 % von hämorrhagischen Umwandlung^{2,3, 4}. resultierende Morbidität und Mortalität schränkt seine Verwendung zu einem kleinen, oft unerreichbar Fenster⁵. Auch auftreten Restenose und Okklusion oft nach anfänglichen Thrombolyse, Rückwärtsfahren anfängliche neurologische Verbesserung. Zusammenfassend lässt sich sagen ist ein enges zeitliches Fenster Rtbpa verwalten, die ausschließt, die große Mehrheit (ca. 90 %) der Patienten mit ischämische zerebrovaskuläre Beleidigungen.

Die Rolle der intravenösen gerinnungshemmende Therapie hat Versprechen gezeigt, bei der Behandlung von ischämischen Schlaganfall mit verbesserten Schiff Rekanalisation, überleben und Ergebnis². Leider diese Medikamente haben eine vorhersehbare Nebenwirkung von Intra kranialen und extra kranialen Blutungen, vor allem, weil es keine Möglichkeit, angemessen rückgängig zu machen oder ihre Aktivität²zu kontrollieren. Während wirksam bei der Verhinderung der Thrombozytenaggregation haben das Risiko von Blutungen und die Unfähigkeit, ihre Tätigkeit zu stornieren ihren Einsatz in der Routine Pflege von Schlaganfall-Patienten ausgeschlossen. Ein Bedarf besteht daher für potente antithrombotische Medikamente, die handeln, allein oder in Kombinationen zu verhindern und Blutgerinnsel aufzulösen, aber haben ein Sicherheitsprofil, mit denen die Verwendung in einem geschlossenen, in geringen Mengen Raum wie dem Gehirn, wo die Blutung schlecht toleriert wird.

Verständnis des Mechanismus der arterielle Thrombose und Re-Stenose und Bewertung Thrombolytics und Medikamente, die verhindern, Re-Stenose dass, erfordert sowohl kleine als auch große Tiermodellen als Teil des prä-klinischen Medikamentenentwicklung. Eisenchlorid-induzierte gefäßverletzung ist eine häufig verwendete Technik, um schnell und präzise induzieren die Bildung von Thromben in exponierten Blutgefäße von Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, und Kaninchen^{6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12}. diese kleineren Arten bieten mehrere Vorteile, einschließlich einfache Genmanipulation, preiswerte Tier Kauf und niedrige Tagessatz Wohnkosten. Leider negieren kleine Tierversuche mehrere Blut zieht während der Operation zu Zugang Thrombozyten Reaktivität, Blut-Gas-Analyse und entzündliche Reaktion. Noch wichtiger ist, imitieren Großtiere viel enger menschlichen Thrombozyten Physiologie^6,13. FeCl₃ Halsschlagader Verletzungen Modell spielte eine herausragende Rolle in der Erforschung der Pathophysiologie von Thrombosen, bei der Validierung von neuartigen Anti-Thrombozyten und Antikoagulans Drogen und bei der Entdeckung der potenziellen Thrombolytics^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12}. frühere Modelle bei Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen zur Verfügung gestellt haben, Leichtigkeit und Flexibilität für die genetische Manipulation, wobei übersetzbare präklinische Modellen sind entscheidend für die Dosierung und Toxizität Patientenstudien potenzielle Therapeutika^{6 ,13}. Obwohl mehrere Modelle von thrombotischen Erkrankungen bei Mäusen, große Tiermodellen der Thrombose entwickelt wurden, die für die periphere arterielle Verschlusskrankheit sind sind Schlaganfall und Herzinfarkt nur wenige und weit. Die ersten Modelle der Thrombose bei Affen, Hunden und Schweinen konzentrierte sich auf Stenose, arterienklemmen und späteren Zylinder auf Schiffe, häufig resultierenden zyklischen Fluss Reduktionen^14,15,16anzuwenden. Anstelle einer okklusiven Thrombus an der Stelle des endothelschäden wie Eisenchlorid Modell der Thrombus in diesen Modellen führte zu zyklischen Thrombose, distale Embolisation und zurück zur normalen Blutfluss. Im Vergleich dazu ist das Eisenchlorid Modell hier in ein großes Tier, Ergebnisse in einer okklusiven Thrombus am Verletzung Aufstellungsort geändert und stabilisiert und durch Angiographie vor der thrombolytischen Behandlung überprüft. Sofern der Prüfer ausreichend gedeckt ist, denn pro Diem und Kauf von Eckzähnen und angemessene chirurgischem Know-how, wir hier ein großes eckzahn Modell der gefäßverletzung ermöglichen Labors zu Thrombose Nutzung der chirurgischen, imaging und histologische Studie ausführlich Techniken.

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Protokoll

Die beschriebenen Untersuchungen entsprechen den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health und wurden von der Ohio State University institutionelle Animal Care und Use Committee (#2015A00000029) genehmigt. Alle chirurgischen Manipulationen waren Tiefe Narkose durchgeführt und die Tiere nicht erleben Schmerzen in jedem Stadium während des Verfahrens. Alle beschriebenen Experimente waren Nichteinziehung.

1. Vorbereitung

1. Frisch bereiten Sie 50 mL Eisenchlorid (FeCl₃) bei 50 % (w/V) in entionisiertem Wasser verdünnt zu.
2. Schneiden Sie die Nabelschnur Band in 5,5 cm Stücke und genießen Sie die frisch zubereiteten 50 % FeCl₃ Lösung 1 Woche vor dem Eingriff.
   Hinweis: Die Nabelschnur Band ist dick und dauert einige Zeit, um die 50 % ige FeCl₃ Lösung zu absorbieren.
3. Fast jeder Hund über Nacht vor der Operation.
4. Beschriften Sie Cryovials für Plasma und Urin-Sammlung, 50 mL sterile Zentrifuge Rohre für alle Orgel-Speicher und 10 % Formalin Behälter für Gehirn und Carotis Fixierung für H & E Färbung mit Tierkennzeichnung, Geburtsdatum, Datum der Operation und Behandlung.
5. 100 mL jede Lösung für jede eckzahn Prozedur vorzubereiten: 4 % Paraformaldehyd in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (pH-Wert 7,4), 10 % neutral gepufferte Formalin und 2 % 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chlorid [TTC mit PBS-Puffer (pH-Wert 7,4), in der Dunkelheit Speichern].
6. Reichlich flüssigem Stickstoff für alle Cryovials und 50 mL Gewebe Rohre für Blitz einfrieren für den Tag des Eingriffs zu erwerben.
7. Erwerben Sie zwei ADP/Kollagen-Patronen für PFA-100 (Thrombozyten-Funktion Analyzer) Thrombozyten Reaktivität für jedem eckzahn für jeden Zeitpunkt von Interesse.
8. Erwerben Sie eine 4,5 mL Natriumcitrat blutsammelröhrchen, für jede Blutentnahme vor Opfer für Plasma-Abtrennung und -Speicherung. Ziehen Sie unter Opfern 16 Blutentnahmeröhrchen für die Plasma-Lagerung. Nachdem jedes blutsammelröhrchen voll, ist Spin bei 4.000 x g für 30 s zum Isolieren von Platelet rich Plasma und Übertragung klare Schicht in Cryovials. Flash-Einfrieren in flüssigem Stickstoff vor der Lagerung bei-80 ° C.
9. Erwerben Sie eine 4,5 mL Lithium Heparin blutsammelröhrchen, für jeden Zeitpunkt PFA-100 für Rekord Thrombozyten Reaktivität von Interesse. Führen Sie bei jeder Blutentnahme 800 µL Vollblut aus einer Lithium-Heparin-Blutentnahmeröhrchen in jede ADP/Kollagen-Patrone ohne Luftblasen, die Thrombozyten Reaktivität zu folgen.
10. Erwerben Sie zwei EDTA K3 Blutentnahmeröhrchen (1,8 mg wasserfreiem EDTA pro 1 mL Blut), für komplettes Blutbild (CBC) bei Studienbeginn und zur Zeit des Opfers.
    Hinweis: Dieses Volumen ist ausreichend für die meisten zentralen Einrichtungen jeweils zweimal im Falle eines mechanischen Fehlers ausgeführt. Obwohl ein CBC auf beide der Grundlinie vor Verletzungen und zum Zeitpunkt des Opfers ausgeführt wurde, können die Ermittler mehr Blut als genehmigten in ihrer tierischen Protokolle für zusätzliche Analysen zieht hinzufügen. Erkundigen Sie sich bei der Anlage hinsichtlich Volumen und Lieferbedingungen für ihre Geräte.
11. Bereiten Sie eine 2 mL heparinisierten Spritze füllen und Beschichtung der Spritze am Tag des Verfahrens für die Gasanalyse Blut zur Zeit des Opfers.
    Hinweis: Prüfen Sie mit der Anlage hinsichtlich Volumen und Lieferbedingungen für ihre Geräte.

(2) Hunde Halsschlagader Okklusion

1. Gewicht ein Erwachsenen (> 18 Monate) Beagle Hunde und vorab mit intramuskulären Acepromazine behandeln (0,025-.2 mg/kg) gefolgt von einer anfänglichen intraperitoneale Injektion von Ketamin (5-20 mg/kg) und Midazolam (0,01-.25 mg/kg). Tiefer Narkose mit 1-5 % Isofluran basierend auf der Herzfrequenz, Atmungen und Kiefer Ton zu induzieren.
   Hinweis: Genaue Anästhesie wird durch das Gewicht und die genehmigten Tier Protokoll diktiert. Obwohl Injektionen Schmerzen für die Tiere verursachen könnten, wird die Dauer dieses Unbehagen minimal sein (weniger als 3 s).
2. Entfernen Sie vor der Einnahme des Tieres auf dem OP-Tisch die Haare durch Zuschneiden. Gelten Sie, Schmier-ophthalmologischen Salbe, um den narkotisierten Tier Augen Trockenheit zu verhindern.
3. Legen Sie das Tier in Rückenlage mit Hilfe eines Positioniersystems und befestigen Sie die Elektrokardiographie (EKG) führt zu Fuß Pads. Intubation durch die Luftröhre mit einer 6,5 mm gefesselt Endotrachealtubus, mechanisch mit 14 Atemzüge/min lüften und pflegen jeden Hund mit einer kontinuierlichen Einatmen von 1-5 % Isofluran (je nach dem genehmigten Protokoll der tierischen).
4. Um das Ausmaß der Kanalisierung der Carotis und die Länge der den okklusiven Thrombus zu ermitteln, führen Sie Angiographie vor Verletzungen, vor MRI und zur Zeit des Opfers (siehe unten für weitere Anweisungen).
5. Einsetzen einer femoralen arteriellen Hülle und einem Kunststoff-Katheter und sichern mit einer lose 0-Seide-Naht. Vorübergehend schließen Sie den Mantel und Katheter während des Transports und bildgebenden Verfahren. (Siehe eckzahn Angiographie unter Weitere Anweisungen).
6. Blut zieht legen Sie in einen 16 x 45 mm intravenöse Katheter durch die intakte Haut distal der femoralen arteriellen Mantel Website abgeholzt. Den Katheter in die chirurgische Exposition voraus und visualisieren, wie es in der exponierten femoral Ader unmittelbar neben der arteriellen Scheide tritt. Einmal vollständig in die Vene eingeführt, ziehen Sie die Nadel heraus, Kappe des Katheters mit einer 3-Wege-Hahn und spülen Sie es mit 2 mL steriler Kochsalzlösung 0,9 %. Sichern Sie den Katheter an der Haut mit einer 0-Seide-Naht.
7. Machen Sie einen ca. 8-10 cm Einschnitt der Haut direkt auf der Oberseite rechts gemeinsame Halsschlagader-Region und sezieren Sie die Faszien um das Schiff aus dem umgebenden Gewebe zu isolieren.
8. Führen Sie vorsichtig Zange zwischen der Arteria carotis und den Nervus Vagus zu trennen ein. Berühren Sie die Halsschlagader mehr als nötig, da es Verengung des Gefäßes führen kann.
9. Trocknen Sie den exponierten Bereich der Arterie mit steriler Gaze, FeCl₃ Lösung Verdünnung zu vermeiden.
10. Ort das Doppler Sonde um die Carotis Tölt Raum wickeln Sie die Nabelschnur Band rund um die Carotis ohne Berührung der Durchfluss-Sonde und starten Sie die Aufnahme der Blut-Geschwindigkeit fließen und während des gesamten Verfahrens (Abbildung 1 oben). Aufzeichnen der Grundlinie der Gesamtdurchfluss ~ 5 min vor dem Auftragen der Nabelschnur Bandes.
    Hinweis: Baseline Flow vor FeCl₃ Nabelschnur Band Platzierung beträgt in der Regel rund 250 mL/min.
11. Wickeln Sie das vorbereitete FeCl₃ Nabelschnur Band rund um die Carotis mit einer Gefäßklemme unmittelbar unterhalb der Durchfluss-Sonde ohne es zu berühren für 15 min, entfernen und entsorgen.
    Hinweis: Okklusion wird als NULL Strömung mL/min bezeichnet.
12. Stabilisieren Sie den okklusiven Thrombus für 45 min. hinzufügen zusätzliche Kochsalzlösung die Sonde wie notwendig, um ein Signal zu gewährleisten.
    Hinweis: Je nach Alter, Geschlecht und die Art der Hunde, zusätzliche Praktika des vorbereiteten FeCl₃ Nabelschnur Bandes notwendig dafür, dass 30 min für die Okklusion auftreten, bevor eine Anwendung möglicherweise. Keine Unterschiede wurden mit dem Geschlecht in Beagles in Thrombose von Eisenchlorid Anwendung beobachtet. Es wurde nicht gefunden mit diesem Modell erneut eine frische FeCl₃ Nabelschnur Band mehr als einmal und haben nie abgewichen FeCl₃ Nabelschnur Band Vorbereitung Protokoll notwendig. Wenn das Labor verwendet wird, eine andere Rasse oder Alter der Hunde, die FeCl₃ Nabelschnur Band auf die ursprünglichen Themen um sicherzustellen, dass die Thrombose-Protokoll nicht abweichen, oder eine Gruppe der Eckzähne erforderlich sein kann, FeCl₃ etablieren angewendet werden soll Anwendungszeit für diese Rasse oder Alter in ihrer spezifischen Studie. Die Okklusion Zeiten in diesem Experiment, reichen von 8-30 min nach dem FeCl₃ Nabelschnur Klebeband auftragen.
13. Um den Schlaganfall oder Blutungen Volumen neben der nachgeschalteten thromboembolische Ereignisse bestimmen, welche aus pharmakologischen Interventionen ergeben können, transportieren Sie Eckzähne mit zusätzlichen Ketamin Injektion mit einer Magnet-Resonanz-Tomographie-Maschine (siehe weiter unten zusätzliche Verarbeitung).
14. Noch unter einem tief chirurgische Flugzeug der Narkose von einem endgültigen Angiogramm/MRI (siehe unten für imaging-Protokoll), gekennzeichnet durch einen Mangel an Reaktion auf Schmerzreize, Vollblut gewünscht für eine spätere Analyse zu sammeln, dann öffne die Truhe durch Durchtrennung der Rippen Beginnend am Brustbein und Verbrauchsteuern Herzen durch die Blutgefäße (Entbluten) schneiden.
    Hinweis: In diesem Experiment ganz Blut (< 10 mL) wurde an der Grundlinie, 5 min nach Agent-Administration und 60 Minuten nach der Infusion aus der femoralen Scheide gezogen und sah keinen Einfluss auf den Prozess der Thrombolyse. Unter Opfern kann ein unbegrenztes Volumen für zusätzliche Plasma Lagerung gezogen werden, wenn im tierischen Protokoll genehmigt. Analysieren Sie, verarbeiten Sie und speichern Sie alle Vollblut innerhalb von 30 min des Opfers. Stellen Sie sicher, dass Blut auf dem genehmigten Tier Protokoll nicht mehr als den zugelassenen Prozentsatz des Körpergewichts des Tieres als detaillierte gezeichnet wird. Alle beschriebenen Experimente waren Nichteinziehung.
15. Das Herz mit 0,9 % Kochsalzlösung spülen und Blitz einfrieren Proben in flüssigem Stickstoff, wenn gewünscht.
16. Vor dem Entfernen der Halsschlagadern, Messen Sie die Gerinnsel Länge indem man ein Lineal neben es und aufzeichnen. Positionieren Sie die Gewebe-Markierung in der Mitte des gerinnsels und an der gleichen Stelle auf der kontralateralen a. carotis zur einfachen Histologie trimmen. Markieren der kontralateralen a. carotis auf die gleiche Länge.
    Hinweis: Die durchschnittliche Gerinnsel mit diesem Modell beträgt 1,75 cm.
17. Entfernen Sie die gesamte Länge des gerinnsels auf beide Schiffe und 10 % Formalin fixieren. Die kontralaterale Halsschlagader innerhalb der Länge gekennzeichnet durch die Gewebe-Markierung zu entfernen. Halbieren Sie die kontralaterale Halsschlagader in der Mitte des gerinnsels. Flash Einfrieren, die Hälfte die kontralaterale Halsschlagader in flüssigem Stickstoff für die spätere Analyse und die andere Hälfte in 10 % Formalin, neben dem verletzten Carotis für histologische Analyse unten einbetten zu beheben.
18. Entfernen Sie Organe für jede gewünschte Analyse zu, spülen Sie mit 0,9 % Kochsalzlösung und Flash-Einfrieren in flüssigem Stickstoff.
19. Entfernen Sie den Schädel mit einem kreisförmigen Knochensäge. Entfernen Sie langsam den Schädel ohne Beschädigung des Gehirns unter.
20. Nachdem das Gehirn aus dem Schädel entfernt wurde, in kalten 0,9 % Kochsalzlösung spülen Sie, und schneiden Sie zwei Abschnitte von 4 mm aus der Mitte des Gehirns, seitlich mit einem scharfen Skalpell schneiden. Legen Sie eine der in den Abschnitten 4 mm 2 % TTC für ischämische Abgrenzung (siehe zusätzliche Verarbeitung für Gehirn TTC), während die andere Scheibe für 7 Tage für H & E Färbung (siehe zusätzliche Verarbeitung für Gehirn, H & E) in 10 % Formalin gelegt.

3. Hunde Angiographie

Hinweis: Dies ist in Abbildung 2 dargestellte und erfolgt während der Operation zu Zeitpunkten von Interesse.

1. Das Gefühl für einen Impuls in der rechten Leiste Region und machen einen ventralen sagittalen Schnitt 3-5 cm.
2. Setzen Sie die Femoral Arterie und trennen Sie ihn aus dem umliegenden Gewebe mit stumpfe Dissektion.
3. Verwenden Sie einen rechten Winkel Gefäßklemme um eine 0-Seide Naht um das distale Ende der exponierten Arterie platzieren.
4. Binden Sie die distalen 0-Seide-Naht und gelten Sie leichten Spannung auf die Arterie durch Spannen der lose 0-Seide Fadenenden auf der Haut mit arterienklemmen.
5. Legen Sie eine zweite 0-Seide Naht um das proximale Ende des Segments ausgesetzt.
6. Punktion der Arterie in der Mitte zwischen der proximalen und distalen 0-Seide Naht fesselt mit einer 18G Einführhilfe Nadel ein Führungsdraht in die Arterie zu übergeben.
7. Geladen Sie eine montierte 6Fr Mantel und Dilatator auf den Führungsdraht, greifen den Draht aus der Assembly.
8. Förderung der Dilatator und Mantel über den Führungsdraht. Achten Sie darauf, einen guten Überblick über den Draht zu erhalten, wie es von den Dilatator ragt bei der Förderung der Dilatator Scheide Versammlung.
9. Nach dem vollständigen einsetzen binden Sie die proximale 0-Seide Naht um die Scheide zur Blutstillung bei der arteriellen Punktionsstelle zu pflegen.
10. Gleichzeitig entfernen Sie den Dilatator und den Führungsdraht.
11. Öffnen Sie das Einwegventil zu überprüfen das Vorhandensein von pulsierender Blutfluss und mit 3-5 mL normale Kochsalzlösung spülen.
12. Verbinden Sie das Zugang Scheide Einwegventil zu einer Flüssigkeit gefüllten Hilfslinie an einem Druckaufnehmer zu überwachen und aufzeichnen invasive Blutdruckmessung befestigt.
13. Vorab laden ein 0,35" Führungsdraht in einem 4Fr. angiographischen Katheter und Kontrast Einspritzung Krümmer set mit einer Tuohy-y-Adapter anschließen.
14. Ziehen Sie die Spitze des Führungsdrahtes nur innerhalb der distalen Spitze des Katheters und spülen Sie die gesamte Baugruppe mit Kochsalzlösung.
15. Die blutstillende Ventil des Mantels stecken Sie den angiographischen Katheter und dann den Führungsdraht ca. 5 cm über der distalen Katheterspitze.
16. Unter Röntgendurchleuchtung Anleitung und mit einem retrograden Trans-aortalen Ansatz langsam vorwärts den Katheter in den Aortenbogen.
17. Injizieren Sie 2-3 mL Kontrast Mittel verdünnt 1:1 mit normalen Kochsalzlösung, der Start des Brachiocephalic Stammes zu identifizieren.
18. Den Führungsdraht verwenden, um den Katheter in den Kofferraum Brachiocephalic leiten und dann selektiv in der rechten gemeinsame Halsschlagader.
19. Entfernen Sie den Führungsdraht und Spritzen Sie 2-3 mL verdünnten Kontrast um sicherzustellen, dass der Katheter in die Halsschlagader gelegt wird.
20. 3-4 mL der unverdünnten Kontrast während der Aufnahme angiographischen läuft mit digitalen Subtraktion und angiographischen Standardtechniken zu injizieren.
21. Wiederholen Sie die Schritte 3.18-3.21 für die wiederholte Angiographie zu zusätzlichen Zeitpunkten.

(4) Magnet-Resonanz - Diffusion gewichteten Imaging (DWI) und T2 gewichtet (T2WI) des Hunde-Gehirns imaging

Hinweis: Dies ist dargestellt in Abbildung 3A-3 b.

1. Stellen Sie sicher, dass der Hund in Tiefe Narkose.
2. Stellen Sie sicher, dass physiologische Parameter des Hundes während der Bildgebung einschließlich EKG und Herzfrequenz überwacht werden.
3. Stellen Sie sicher, dass der Hund in der Rückenlage mit dem Kopf in die bilaterale Öffnungen der Spule Gehirn liegt.
4. Aktivieren des 3-Tesla (3 t) Magnet.
5. Durchführen Sie T2-gewichtete Bildgebung (T2WI), eine grundlegende Pulssequenzen in der MRT.
   Hinweis: Die Reihenfolge verwendet die Unterschiede in der T2-Relaxationszeit der Gewebe bei verschiedenen pathologischen Zuständen.
6. Führen Sie Localizer imaging um zu erwerben, pilot-Images von einem Hund Gehirn vor der anatomischen Bildgebung mit T2-gewichteten gradient Echo Sequenz imaging und bestimmen Sie das Sichtfeld (FOV), Anzahl der Scheiben und Schnittstärke auf das Gehirn vollständig zu bedecken.
7. Verwenden Sie die folgenden T2-Parameter: Schneiden Sie Dicke = 3 mm, TR = 4.000 ms, TE = 75 ms, ETL = 7, Erwerb Matrix = 320 x 256, FA = 180ᵒ, FOV = 320 x 320 Pixel, Auflösung = 2,4615 Pixel pro mm.
8. Führen Sie gewichtet Diffusionsbildgebung (DWI) mit Echo Hobel DTI Sequenz 4 h nach MCA Okklusion und unmittelbar vor dem Opfer.
9. Verwenden Sie die folgenden Parameter DWI: b = 1.500 s/mm², Scheibendicke = 3 mm, TR = 4.600 ms, ET = 86 ms, ETL = 55, Erwerb Matrix = 140 x 140, FA = 90ᵒ, FOV = 231 x 257, Bildauflösung = 0.9333 Pixel/mm (Tabelle 1).

5. Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung des Hunde-Gehirns

Hinweis: Dies ist in Abbildung 3Ddargestellt.

1. Betten Sie nach 7 Tagen 10 % Formalin die 4 mm-Gehirn-Abschnitte in Paraffin ein.
2. Schneiden Sie die Paraffin-Blöcke bis Ebene mit einem Mikrotom, entfernen alle zusätzlichen Paraffin von der Spitze des Hirngewebes, dann schneiden Sie das Gehirngewebe an 4 µm und einem Gehirn Abschnitt auf jeder Zoll Folie 2 "x 3".
   Hinweis: Vor der Färbung, legen Sie alle Lösungen in getrennten Behältern so dass Folien aus einer Lösung zu einem anderen verschoben werden können, ohne auszutrocknen.
3. De-paraffinize jedes Gehirn Dia und Hydrat mit Leitungswasser.
4. Legen Sie jedes Gehirn Folie in Hämatoxylin 560 für 8 Minuten.
5. Jedes Gehirn Dia in Leitungswasser abspülen.
6. Unterscheiden jedes Gehirn Dia mit 1 % Säure Alkohol für 1 s dreimal.
7. Jedes Gehirn Dia in Leitungswasser abspülen.
8. Blau jedes Gehirn Folien mit 1 % Ammonium Hydroxid für 1 s.
9. Spülen Sie jedes Gehirn Dia in fließendem Leitungswasser für 2 min.
10. Entwässern jedes Gehirn Dia in 70 % Ethanol (EtOH) für 1 s zwölfmal.
11. Jedes Gehirn Dia in Eosin für 1 min counterstain.
12. Entwässern jedes Gehirn Dia in 95 % EtOH für 1 s zwölfmal.
13. Entwässern jedes Gehirn Folie in 100 % EtOH.
14. Klar jedes Gehirn Dia in Xylol und dann ein 2 "x 3" Zoll Deckglas auf der Gehirn-Folie, Entfernen von Luftblasen mit harzigen Montage Medien anwenden.
    Hinweis: Alle Lösungen sind für mehrere Tage der Färbung und mehrere Folien außer Wasser und Ethanol wiederverwendet. Alle Verarbeitung nach Gehirn Abschnitte auf Folien liegen in Glas Gläser Färbung gemacht sind, aber Färbung Kunststoffbehälter sind auch im Handel erhältlich. Ersetzen Sie jede Lösung zu, wenn es verfärbt wird und halten sie fest abgedeckt.

6. Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung der eckzahn Halsschlagadern

Hinweis: Dies ist in Abbildung 1 (links) angezeigt.

1. Nach 24-72 h in 10 % Formalin, dem verletzten Carotis halbieren in der Mitte des gerinnsels und Einbetten ~ 1 cm des verletzten Carotis und ~ 1 cm von der kontralateralen Kontrolle in der gleichen Paraffin-Kassette.
   Hinweis: Das Blutgerinnsel innerhalb der Carotis ist zerbrechlich. Warten Sie, bis das Schiff in 10 % Formalin vor dem Schnitt korrigiert hat, so dass das Gerinnsel nicht gestört wird. Einbettung der verletzten und Halsschlagadern zu kontrollieren in der gleichen Paraffin Block ermöglicht schneiden zur gleichen Zeit am gleichen Ort in den Blutgefäßen.
2. Trimmen Sie Paraffin-Blöcke bis Level mit einem Mikrotom, entfernen alle zusätzlichen Paraffin. Dann schneiden Sie Abschnitte bei 4 µm auf 25 x 75 mm x 1 mm-Dias ohne paraffinblock zu drehen, so dass der kontralateralen a. carotis Abschnitte am oberen Rand der Folie platziert werden.
   Hinweis: Drei Karotis Abschnitte wurden auf jeder Folie platziert, aber man kann hinzufügen, je nach Flecken von Interesse.
3. De-paraffinize jede Karotis Folie und Hydrat im Leitungswasser.
   Hinweis: Im Gegensatz zu der Gehirn-Folie, die einzeln verarbeitet werden sollen, können Carotis Folien verarbeitet werden in loser Schüttung indem man in Gläser, die mehrere Folien gleichzeitig passen, ohne einander zu berühren.
4. Jede Arteria Folie Hämatoxylin für 8 min. Fleck.
5. Spülen Sie jede Arteria Folie in Leitungswasser.
6. Unterscheiden jede Karotis Folie mit 1 % Säure Alkohol für 1 s dreimal.
7. Spülen Sie jede Arteria Folie in Leitungswasser.
8. Blau jede Karotis Folie mit 1 % Ammonium Hydroxid für 1 s.
9. Spülen Sie jede Arteria Folie in fließendem Leitungswasser für 2 min.
10. Entwässern jede Karotis Folie 70 % EtOH für 1 s zwölfmal.
11. Jede Arteria Folie Eosin oder 1 min counterstain.
12. Entwässern jede Karotis Folie 95 % EtOH für 1 s X 12.
13. Entwässern jede Karotis Folie 100 % EtOH.
14. Klar, jede Karotis Folie in Xylol und fügen Sie ein 24 mm x 50 mm-Deckglas mit harzigen Montage Medien um die Luftblasen zu entfernen.

(7) 2,3,5-Triphenyl-2H-Tetrazolium-Chlorid (TTC) Färbung des Hunde-Gehirns

Hinweis: Dies ist in Abbildung 3gezeigt.

1. Platz Abschnitt andere 4 mm von der Mitte des Gehirns sofort proximalen Abschnitt H & E in zuvor entfernt vorbereitet 2 % TTC (Arteria carotis Okklusion). Im Dunkeln bei 37 ° C für mindestens 20 min, umdrehen im Gehirn Abschnitt Färbung auch alle 5 min inkubieren.
   Hinweis: Nach 20 min sollte der Abschnitt kirschrot auf beiden Seiten. Basierend auf TTC frische und Dicke des Gewebes Abschnitt kann mehr Zeit erforderlich sein.
2. Entfernen Sie die TTC-Lösung und ersetzen Sie es mit 4 % Paraformaldehyd mit PBS-Puffer, pH 7,4, die Farbkontrast zu optimieren.
3. Wenn der Kontrast zwischen den weißen und roten Färbung ist optimal, TTC Gehirnscheiben zwischen klaren Kunststoffplatten, trocken von überschüssiger Flüssigkeit und Scannen mit hoher Auflösung für die Ablaufverfolgung von ischämischen Regionen zu platzieren.
   Hinweis: Abschnitte können gespeichert werden auf unbestimmte Zeit in Paraformaldehyd Lösung, aber Färbung verschwindet.

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Ergebnisse

Nach dem detaillierten Verfahren hierin führt zu die Entwicklung eines Modells, die für prophylaktische oder thrombolytischen Beurteilung der arteriellen Verschlusskrankheit Interventionen genutzt werden kann. Abbildung 1A zeigt Grundlinie Strömungsgeschwindigkeit und die daraus resultierenden Strömungsgeschwindigkeit Blut vor, während und nach der Behandlung durch eine kommerzielle Software aufgezeichnet. Daten aus dieser Aufnahme können verwendet werd...

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Diskussion

Das FeCl₃ induzierte gefäßverletzung Modell ist weit verbreitet, Thrombosen bei Kleintieren zu studieren und ist einfach zu übersetzen, ein großes Tier, präklinischen Modell mit einer Vielzahl von Vorteilen. Geringfügige Änderungen an das Protokoll eines Hundes anzupassen erlauben die Nutzung der beiden Magnetresonanztomographie Schlaganfälle und Blutungen Volumen nach eine pharmakologische Intervention und Angiographie Schiff Kanalisierung vor, bewerten bewerten bei, und nach der Behandlung. Anderen t...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/8” umbilical tape	Jorgensen Laboratories Inc.,	#J0025UA	for ferric chloride application
4% paraformaldehyde in PBS	Alfa Aesar	AAJ61899AP
10% neutral buffered formalin	Richard-Allan Scientific	5701
2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4)	Sigma Aldrich	T8877
ADP/Collagen cartridges	Siemens Diagnostics	B417021A
4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer	Becton Dickinson	BD 369714
4.5 ml lithium heparin vacutainer	Becton Dickinson	BD 368056
EDTA K3 vacutainers	Becton Dickinson	BD455036
Doppler flow probe	Transonic Systems Inc	MA2.5PSL
Hematoxylin 560	Surgipath	3801570
Eosin	Surgipath	3801602
LabChart Software	ADInstruments Inc.
Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet	Siemen's Diagnostics
Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe)	NovaPlus	402525D
HUG-U-VAC positioning system	DRE Veterinary	1320