Хлорида железа индуцированной собак сонной артерии тромбоза: Большой животных модель сосудистых повреждений

Резюме

Здесь мы представляем изменения, необходимые для хорошо изученных и часто используемых малых животных хлорное индуцированной (₃FeCl) сонной артерии травмы модели для использования в модели крупных животных сосудистых повреждений. Результирующая модель может использоваться для доклинических суда оценки как профилактических, так и тромболитической фармакологических и механических вмешательств.

Аннотация

Окклюзионные артериальный тромбоз, ведущих к церебрального ишемического инсульта и инфаркта миокарда способствует ~ 13 миллионов смертей каждый год во всем мире. Здесь мы перевели модель сосудистых повреждений от мелких животных на крупных животных (собак), с незначительными изменениями, которые могут быть использованы для доклинических скрининг профилактического и тромболитической агентов. В дополнение к хирургические методы измененный Протокол описывает шаг за шагом методы для оценки сонной артерии канализации, ангиография, подробные инструкции для обработки мозга и сонной артерии для гистологического анализа для проверки сонной артерии канализация и кровоизлияние в мозг и конкретные параметры для завершения оценки течению тромбоэмболических событий, используя магнитно-резонансной томографии (МРТ). Кроме того обсуждаются конкретные процедурные изменения от ранее устоявшихся малые животной модели, необходимо перевести на крупных животных (собак) сосудистых повреждений.

Введение

Терапия инсульта во многом моделируется после лечения болезни коронарной артерии, главным образом потому, что вмешательство в сердечно-сосудистых заболеваний также откликнулись наркотиков терапии и эндоваскулярных вмешательств¹. Однако, эти процедуры не успешно переведены к ишемии миокарда. Трудности с текущей лечение инсульта, что рекомбинантных активатор плазминогена ткани (rTPA) не может быть отменено, и что администрация несет значительный 6,4% риск геморрагических преобразования^{2,3, 4}. полученный заболеваемости и смертности, ограничивает его использование для малых, часто недостижимой окна⁵. Кроме того часто после первоначального тромболизис, вспять первоначальное улучшение неврологической происходят рестеноза и окклюзии. В резюме пациентов, которые страдают ишемических цереброваскулярных оскорбления существует узкое временное окно распоряжаться rTPA, что исключает подавляющее большинство (~ 90%).

Роль внутривенного антитромбоцитарной терапии показал обещание в лечении ишемического инсульта с реканализации улучшение судна, выживание и результат². К сожалению эти препараты имеют предсказуемые побочный эффект внутри черепной и экстра черепной кровоизлияния, главным образом потому, что нет никакой возможности адекватно вспять или контролировать их деятельность². Во время эффективного предотвращения агрегации тромбоцитов риск кровоизлияния и неспособности прекратить их деятельность помешали их использования в рутине ухода за пациентов, перенесших инсульт. Таким образом, существует необходимость, мощной антитромботической наркотиков, которые действуют самостоятельно или в комбинации, чтобы предотвратить и лизируют сгустки еще имеют профиль безопасности, что позволит использовать в закрытых, низкий объем пространства например мозга, где плохо переносится кровоизлияния.

Понимание механизма артериальный тромбоз и ре стеноза и оценке Тромболитиков и лекарств, которые препятствуют ре стеноза, требует больших и малых животных моделей как часть развития доклинических наркотиков. Хлорида железа индуцированной сосудистых повреждений является широко используется способ быстро и точно вызвать образование тромбов в открытых сосудах мышки, крыски, морские свинки и кролики^{6,,78, 9 , 10 , 11 , 12}. Эти меньше видов предлагают несколько преимуществ, включая простоту генетических манипуляций, недорогой покупки животных и низкий, суточные расходы на жилье. К сожалению небольшие эксперименты на животных отменяет несколько крови ничьих во время операции доступа реактивность тромбоцитов, анализ газа крови и воспалительной реакции. Что еще более важно крупных животных гораздо более тесно имитировать человека тромбоцитов физиологии^6,13. FeCl₃ сонной артерии травмы модель играет доминирующую роль в изучении патофизиологии тромбоза, в проверке Роман анти коагулянта и анти-тромбоцитарный лекарств и в открытие потенциальных Тромболитиков^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12}. предыдущие модели мышей, крыс, морских свинок и кроликов обеспечивают простоту и гибкость для генетической манипуляции, но переводимых доклинических моделей имеют решающее значение для пациента дозирования и токсичность исследования потенциальных терапевтических средств^{6 ,13}. Хотя были разработаны несколько моделей тромботических расстройств у мышей, большие животные модели тромбоза, которые применимы к заболевания периферических сосудов, инсульт и инфаркт миокарда являются несколько и далеко. Первые модели тромбозы в обезьян, собак и свиней сосредоточена на стеноз, применение hemostats и позднее цилиндры для судов, часто, что приводит к циклической потока сокращений^14,,1516. Вместо окклюзионной тромба на сайте эндотелиального повреждения как модель хлорное тромб в этих моделях привели к циклических тромбоза, дистальная эмболизации и вернуться к нормальной крови поток. В сравнении хлориду модель изменения здесь в больших животных, результаты в окклюзионной тромба на месте травмы стабилизировалась и проверены ангиографии до тромболитической лечения. Условии, что следователь имеет достаточно средств для каждого diem и покупку клыки и адекватного хирургического опыта, мы подробно здесь больших собак модель сосудистых повреждений, чтобы позволить лаборатории для изучения тромбоза используя хирургические, обработки изображений и гистологические методы.

протокол

Расследований описал соответствовать руководящим принципам для ухода и использования лабораторных животных национальных институтов здоровья и были одобрены Огайо государственного университета институциональных животное уход и использование Комитетом (#2015A00000029). Все хирургические манипуляции выполнялись под глубокой анестезии и животных не испытывали боль на любой стадии во время процедуры. Все эксперименты, в описанный были без восстановления.

1. Подготовка

1. Свеже Подготовьте 50 мл хлорида железа (₃FeCl) на 50% (w/v) разводят в деионизированной воде.
2. Пупочную ленты нарезать 5,5 см и замочить в свежеприготовленный раствор 50% FeCl₃ 1 неделю перед процедурой.
   Примечание: Пупочной лента используется толстая и занимает некоторое время, чтобы покрыть 50% раствора FeCl₃ .
3. Быстро каждый собак на ночь перед операцией.
4. Ярлык криопробирки сбора мочи и плазмы, 50 мл стерильного пробирок для хранения всех органов и формалина 10% емкости для мозга и сонной артерии фиксации для H & E пятнать с идентификации животных, Дата рождения, Дата хирургии и лечения.
5. Подготовка 100 мл каждого решения для каждой процедуры, собак: параформальдегида 4% в фосфатный буфер (рН 7,4), 10% нейтральные буферизуются формалин и 2% 2,3,5-triphenyltetrazolium хлорида [TTC в PBS (рН 7,4), хранить в темноте].
6. Приобрести достаточно жидкого азота для всех криопробирки и 50 мл трубки ткани для flash замораживания на день процедуры.
7. Приобрести два ADP/коллагена картриджи для реактивность тромбоцитов PFA-100 (анализатор функции тромбоцитов) для каждого собак для каждой точки время интерес.
8. Приобрести один 4,5 мл натрия цитрата пробирка, для каждого тиража крови перед жертву, для разделения плазмы и хранения. В жертву Нарисуйте 16 пробирки для хранения плазмы. После каждой пробирки, спина на 4000 x g 30 s изолировать тромбоцитов богатой плазмы и передачи снять слой в криопробирки. Флэш-замораживание в жидком азоте до хранения при температуре-80 ° C.
9. Приобрести один 4,5 мл литий гепарин пробирка, для каждой точки время PFA-100, представляющих интерес для записи тромбоцитов реактивности. В каждом тираже крови ввести 800 мкл цельной крови от литий гепарин пробирки в каждом картридже ADP/коллагена без пузырьков воздуха следовать реактивность тромбоцитов.
10. Приобрести два ЭДТА K3 пробирки (1.8 мг безводный ЭДТА на 1 мл крови), общий анализ крови (CBC) на базовых и во время жертвоприношения.
    Примечание: Этот объем является достаточным для большинства основных объектов для запуска каждой дважды в случае механических ошибок. Хотя CBC выполнялся на базовой линии до травмы и в то время жертвоприношения, следователи можно добавить, что больше крови рисует утвержденная в их животных протоколы для дополнительного анализа. Проверьте с фондом относительно объемов и требования по доставке для их оборудования.
11. Подготовьте гепаринизированным шприц 2 мл, заполнив и покрытие шприц в день процедуры для анализа газов крови во время жертвоприношения.
    Примечание: Проверьте с фондом относительно объемов и требования по доставке для их оборудования.

2. собачий сонной артерии окклюзии

1. Вес взрослого (> 18 месяцев) Бигл собак и предварительно лекарства с внутримышечным acepromazine (0,025-.2 мг/кг) следуют первоначальный внутрибрюшинной инъекции кетамин (5-20 мг/кг) и мидазоламом (0,01-.25 мг/кг). Вызвать глубокий наркоз с 1-5% изофлюрановая, основанный на частоты сердечных сокращений, дыхания и челюсть тон.
   Примечание: Точное анестезии определяется вес и утвержденных животных протокол. Хотя инъекции может привести к боли для животных, продолжительность этого дискомфорта будет минимальным (менее 3 s).
2. До принятия животное в хирургии таблицу, удалите волосы, отсечения. Примените смазочные глазная мазь на наркотизированных животное глаза для предотвращения сухости.
3. Поместите животное в лежачем положении, с использованием системы позиционирования и прикрепить электрокардиография (ЭКГ) приводит к ноге колодки. Интубации через трахеи с эндотрахеальной трубки манжетой 6,5 мм, механически проветривать в 14 вдохов/мин и поддерживать каждый собака с непрерывной ингаляции 1-5% изофлюрановая (зависит от утвержденных животных протокол).
4. Чтобы определить степень канализации сонной артерии и длина окклюзионной тромба, выполняют ангиографии до травмы, перед Исследованием и во время жертвоприношения (дополнительные инструкции см. ниже).
5. Вставьте бедренной оболочка артериальной и катетера и зафиксируйте с свободно 0-Шелковый шов. Временно закройте оболочкой и катетер во время транспортировки и обработки изображений исследования. Увидеть собак ангиографии дополнительные инструкции ниже.)
6. Для крови ничьих вставьте 16 g x 45 мм внутривенного катетера через неповрежденную кожу дистальной бедренной оболочка артериальной вырубают сайта. Продвигать катетер в хирургического воздействия и визуализировать его, как он вступает в подвергаются бедренной вены, непосредственно примыкающем к оболочке артерий. После того, как полностью вставлена в Вену, снять иглу, крышка катетер с 3-way краном и промойте его с 2 мл стерильного 0,9% физиологического раствора. Закрепите катетер на кожу с 0-Шелковый шов.
7. Сделать надрез 8-10 см кожи непосредственно на верхней правой общей сонной артерии региона и вскрыть фасции, чтобы изолировать судна от окружающих тканей.
8. Осторожно ввести пинцет между сонной артерии и блуждающего нерва для разделения. Не дотрагивайтесь до сонной артерии, больше, чем необходимо, как это может вызвать сужение судна.
9. Сухие области подвергаются артерии с стерильной марли, чтобы избежать разбавления раствора FeCl₃ .
10. Место Doppler потока зонд вокруг сонной артерии, позволяя иноходь пространства обернуть пупочной ленту вокруг сонной артерии не касаясь потока зонд и начать запись скорость кровотока и продолжаться на протяжении всей процедуры (Рисунок 1 сверху). Записи базового потока для ~ 5 мин до применения пуповинной ленты.
    Примечание: Базовый поток перед FeCl₃ пупочной лента размещения обычно в среднем около 250 мл/мин.
11. Перенос подготовленных FeCl₃ пупочной ленту вокруг сонной артерии, используя кровоостанавливающий непосредственно под датчик потока без касатьться на 15 мин, удалить и удалить.
    Примечание: Непроходимость обозначается как нулевой потока мл/мин.
12. Стабилизируйте окклюзионной thrombus для 45 мин добавить дополнительные физиологического раствора для зонда, необходимо поддерживать сигнал.
    Примечание: В зависимости от возраста, пола и тип собак, дополнительные места размещения подготовленных FeCl₃ пупочной ленты могут быть необходимы для позволяя 30 мин для окклюзии произойти до повторного применения. Нет различия наблюдались в тромбоз хлориду приложением с пола в гончих. Это не было сочтено необходимым с этой моделью повторно свежие FeCl₃ пупочной ленты более чем один раз и никогда не отклонились от FeCl₃ пупочной ленты подготовки протокола. Если лаборатория использует другой породы или возраст собак, FeCl,₃ пупочной ленты должны применяться первоначальной темы, чтобы убедиться, что протокол тромбоз не отступать, или группа клыки могут оказаться необходимыми для установления FeCl₃ время в приложения для этой породы или возраста в их конкретного исследования. Непроходимость раз, в этом эксперименте, в диапазоне от 8-30 мин после FeCl₃ пупочной ленты приложения.
13. Чтобы определить объем инсульта или кровоизлияние в дополнение к течению тромбоэмболических событий, которые могут возникнуть в результате фармакологического вмешательства, транспорт клыки с дополнительной кетамин инъекций на магнитно-резонансной томографии машину (см. ниже Дополнительная обработка).
14. Хотя все еще под глубоко хирургического плоскости анестезии от окончательного Ангиограмма/МРТ (см. ниже для визуализации протокола), указывается на отсутствие реакции на вредных раздражителей, сбору цельной крови, необходимые для последующего анализа, затем откройте грудь, резка через ребра начиная с грудины и акцизных сердце путем разрезания кровеносные сосуды (обескровливания).
    Примечание: В этом эксперименте, весь в крови (< 10 мл) было обращено на базовой линии, 5 мин после агента администрирования и 60 мин после вливания из бедренной оболочка и увидел не влияет на процесс тромболизиса. В жертву неограниченный объем могут быть составлены для хранения дополнительных плазмы, если одобрено в животных протокол. Анализировать, обрабатывать и хранить все цельной крови в течение 30 мин жертвоприношения. Убедитесь, что кровь не рисуется сверх утвержденных процент веса тела животного как подробно на утвержденных животных протокол. Все эксперименты, в описанный были без восстановления.
15. Промойте сердце с 0,9% физиологического раствора и вспышки заморозить образцов в жидком азоте при желании.
16. Перед удалением аорт, Измерьте длину сгусток, поместив правитель рядом с его и запись. Поместив маркер ткани на середине сгусток и в том же месте на контралатеральной сонной артерии для удобства в гистологии обрезки. Марк контралатеральную сонной артерии на той же длины.
    Примечание: Длина средний сгусток с этой модели составляет 1,75 см.
17. Удалите всю длину сгусток на обоих судах и исправить в формалина 10%. Удаление контралатеральной сонной артерии в пределах длины, помеченные маркером ткани. Пополам контралатеральной сонной артерии в середине сгусток. Вспышки заморозить половины контралатерального сонной артерии в жидком азоте для последующего анализа и исправить другая половина в формалина 10% для внедрения у потерпевшего сонной артерии для гистологического анализа ниже.
18. Удаления органов для любого желаемого анализа, промыть 0,9% физиологического раствора и флэш-замораживание в жидком азоте.
19. Удаление черепа с круговой пилой. Медленно извлеките черепа без повреждения мозга под.
20. После того, как мозг удаляется из черепа, промыть в холодной 0,9% физиологического раствора и вырезать две секции 4 мм от середины мозга, боково резки с острый скальпель. Поместите один из разделов 4 мм в 2% TTC ишемического демаркации (см. дополнительную обработку для мозга ТТС), а другой срез в формалина 10% на 7 дней для H & E окрашивание (см. дополнительную обработку для мозга H & E).

3. собачий ангиография

Примечание: Это показано на рисунке 2 и делается во время операции на время точек интереса.

1. Почувствовать пульс в правой паховой области и сделать 3-5 см брюшные Сагиттальный разрез.
2. Подвергать бедренной артерии и отделить его от окружающих тканей, с использованием тупых рассечение.
3. Используйте кровоостанавливающий углом 0-Шелковый шов вокруг дистального конца подвергаются артерии.
4. Галстук дистальной 0-Шелковый шов и применить небольшое напряжение к артерии, зажимные сыпучих 0-Шелковый шов концы для кожи с hemostats.
5. Разместите второй 0-Шелковый шов вокруг проксимальный конец сегмента подвергаются.
6. Прокол артерии на полпути между проксимальном и дистальном 0-Шелковый шов связей, с помощью иглы интродьюсер 18G пройти проволочный направитель в артерию.
7. Загрузите собрал 6Fr оболочка и расширитель на проволочный направитель, схватив провода, как он выходит из сборки.
8. Заранее через проволочный направитель расширитель и оболочкой. Убедитесь в том поддерживать твердое понимание провода, как она выступает из расширителя при продвижении Ассамблеи оболочки расширитель.
9. После полного вставки галстук проксимальной 0-Шелковый шов вокруг оболочкой для поддержания гемостаза на сайте артериальной проколов.
10. Одновременно удалите расширитель и проволочный направитель.
11. Откройте односторонний клапан проверить наличие пульсирующего кровотока и заподлицо с 3-5 мл физиологическим.
12. Подключите односторонний клапан оболочка доступа к жидкости заполнены выносной линии придают датчика давления на мониторинг и запись измерения инвазивных артериального давления.
13. Предварительная загрузка проволочный направитель 0,35" в 4Fr. Ангиографический катетер и подключитесь к Коллектор впрыска контраст с y адаптером туи.
14. Вытащить кончик проволоки руководство только внутри дистального наконечника катетера и очистить всю сборку с saline.
15. Вставьте Ангиографический катетер в гемостатический клапан оболочка и затем продвигать проволочный направитель около 5 см за дистальной катетера.
16. Под руководством рентгеноскопические и используя Ретроградная транс аортальный подход медленно продвиньте катетер в аорты.
17. Придать 2-3 мл контраст агент разводят 1:1 с физиологическим для идентификации взлета плечеголовной ствол.
18. Используйте проволочный направитель для прямой катетер в плечеголовной ствол, а затем выборочно в правой общей сонной артерии.
19. Извлеките проволочный направитель и придать 2-3 мл разбавленного контраст, чтобы убедиться, что катетер размещается в сонной артерии.
20. Придать 3-4 мл неразбавленного контраст во время записи ангиографические работает с использованием цифровой вычитание и стандартных ангиографические методов.
21. Повторите шаги 3.18-3.21 для повторных ангиографии в точках дополнительное время.

4. магнитный резонанс - диффузии взвешенных изображений (DWI) и Т2 взвешенных изображений (T2WI) собак мозга

Примечание: Это показано на рисунке 3A-3B.

1. Убедитесь, что собака находится под глубокой анестезии.
2. Убедитесь, что собаки физиологические параметры контролируются на протяжении всего изображений, включая ЭКГ, ЧСС.
3. Убедитесь, что собака лежит в лежачем положении с ее головой в двусторонних отверстий мозга катушки.
4. Включение магнита 3 Тесла (3Т).
5. Выполните Т2 взвешенных изображений (T2WI), основной импульс последовательностей в МРТ.
   Примечание: Последовательность использует различия в T2 времени релаксации тканей в различных патологических состояний.
6. Выполняют локализатор imaging для приобретения экспериментальных изображения собака мозга до анатомических изображений, используя T2-взвешенный градиента эхо изображений последовательности и определяют поле зрения (FOV), количество фрагментов и толшины чтобы полностью покрыть мозга.
7. Используйте следующие параметры T2: ломтик толщина = 3 мм, TR = 4000 мс, TE = 75 МС, ETL = 7, приобретение матрицы = 320 x 256, FA = 180ᵒ, ПЗ = 320 х 320 пикселей, разрешение изображения = 2.4615 пикселей на мм.
8. Выполните диффузии взвешенных изображений (DWI) с помощью эхо рубанок DTI последовательности 4 h после окклюзии MCA и непосредственно перед жертву.
9. Используйте следующие параметры DWI: b = 1500 s/мм², толшины = 3 мм, TR = 4600 МС, ET = 86 МС, ETL = 55, приобретение матрицы = 140 х 140, FA = 90ᵒ, ПЗ = 231 x 257, разрешение изображения = 0.9333 пикселей/мм (Таблица 1).

5. гематоксилином и эозином (H & E) пятная собак мозга

Примечание: Это показано в рисунке 3D.

1. После 7 дней в 10% формалина внедрите в разделах мозга 4 мм в парафин.
2. Трим парафиновые блоки до тех пор, пока они уровне с микротом, удаление любых дополнительных парафин из верхней части ткани мозга, а затем вырезать ткани мозга в 4 мкм и место одной секции мозга на каждый слайд дюйм 2 "x 3".
   Примечание: До окрашивания, место все решения в отдельных контейнерах, чтобы слайды могут быть перемещены из одного решения в другой без высыхания.
3. Де paraffinize каждый слайд мозга и увлажнения с водопроводной водой.
4. Место каждого слайда мозга в 560 гематоксилином 8 мин.
5. Промойте каждый слайд мозга в водопроводной воде.
6. Дифференцировать каждый мозг слайд с 1% кислоты спирта на 1 s три раза.
7. Промойте каждый слайд мозга в водопроводной воде.
8. Синий каждый мозг слайды с 1% Окисоводопод аммония 1 s.
9. Промойте каждый мозг слайд в проточной водой в течение 2 мин.
10. Обезвоживает каждый мозг слайд в 70% этанола (EtOH) для 1 s двенадцать раз.
11. Counterstain каждый мозг слайд эозина за 1 мин.
12. Обезвоживает каждый мозг слайд в 95% EtOH 1 s двенадцать раз.
13. Обезвоживает каждый мозг слайд в 100% EtOH.
14. Очистить каждый мозг слайд в ксилоле и затем применить coverslip дюйм 2 "x 3" на вершине мозга слайд, удаление пузырьков воздуха с смолистые монтажа СМИ.
    Примечание: Все решения используются повторно Кроме воды и этанола для нескольких дней окрашивания и несколько слайдов. Все обработки после секции мозга помещаются на слайды сделали в стекле, окрашивание баночки, но пластиковые контейнеры окрашивание коммерчески доступны также. Замените любое решение, когда он становится бесцветные и держать их плотно покрыты.

6. гематоксилином и эозином (H & E) окрашивание собак аорт

Примечание: Это показано на рисунке 1 (слева).

1. После 24-72 h в 10% формалина, пополам потерпевшего сонной артерии в середине сгусток и внедрить ~ 1 см раненых сонной артерии и ~ 1 см контралатеральной управления в том же кассету парафина.
   Примечание: Сгусток крови внутри сонной артерии является хрупкой. Подождите, пока судно было зафиксировано в формалина 10% до резки так что сгусток не нарушается. Встраивание раненых и контролировать сонных артерий в том же парафин блок позволит резки в то же время в том же месте в кровеносный сосуд.
2. Трим парафиновые блоки до уровня с микротом, удаление любых дополнительных парафина. Затем вырежьте секций на 4 мкм на 25 мм x 75 мм x 1 мм слайдов без поворота блока парафин, так что контралатеральной сонной секции размещены в верхней части слайда.
   Примечание: Три сонные секции были помещены на каждый слайд, но можно добавить зависимости пятна интерес.
3. Де paraffinize каждый слайд, сонных и гидратов в водопроводной воде.
   Примечание: В отличие от мозга слайд, который должен быть обработан индивидуально, сонных слайды могут обрабатываться навалом, поместив в банки, которые соответствуют несколько слайдов в то время, не касаясь друг друга.
4. Пятно каждый сонной слайд гематоксилином за 8 мин.
5. Промойте каждый сонной слайд в водопроводной воде.
6. Дифференцировать каждый сонной слайд с 1% кислоты спирта на 1 s три раза.
7. Промойте каждый сонной слайд в водопроводной воде.
8. Синий каждый сонной слайд с 1% Окисоводопод аммония 1 s.
9. Промойте каждый сонной слайд в проточной водой в течение 2 мин.
10. Обезвоживает каждый сонной слайд в 70% EtOH 1 s двенадцать раз.
11. Counterstain каждый сонной слайд эозином или 1 мин.
12. Обезвоживает каждый сонной слайд в 95% EtOH 1 s x 12.
13. Обезвоживает каждый сонной слайд в 100% EtOH.
14. Очистить каждый сонной слайд в ксилоле и добавить coverslip 24 x 50 мм с смолистые монтажа СМИ для удаления пузырьков воздуха.

7. 2,3,5-илидами-2H-tetrazolium хлорид (TTC) пятная собак мозга

Примечание: Это показано в рисунке 3 c.

1. Место другой раздел 4 мм удалены из середины мозга немедленно проксимальнее H & E секции в ранее подготовленных 2% TTC (окклюзия сонной артерии). Инкубируйте в темноте при 37 ° C для по крайней мере 20 минут, переворачивая секции мозга для даже пятнать каждые 5 мин.
   Примечание: После 20 мин, Секция должна быть вишневый с обеих сторон. Может потребоваться дополнительное время, основанные на TTC свежесть и толщина ткани секции.
2. Удаление решения TTC и заменить его с параформальдегида 4% в PBS, рН 7,4 оптимизировать цветовой контраст.
3. Когда контраст между белой и красной окраски является оптимальным, место ломтики TTC мозга между прозрачные пластиковые листы, сухой лишней жидкости и сканирование с высоким разрешением для трассировки ишемического регионов.
   Примечание: Секции могут храниться бессрочно в растворе параформальдегида, но окрашивание будет исчезать.

Результаты

После подробных процедур здесь приведет к разработке модели, который может использоваться для оценки профилактических или тромболитических окклюзионной артериальной вмешательств. Рисунок 1A показывает базовой скорости потока и результирующей скоро...

Обсуждение

FeCl₃ искусственных сосудистых повреждений модель широко используется для изучения тромбоза в мелких домашних животных и легко переводить на крупных животных, доклинические модель с множеством преимуществ. Незначительные изменения для адаптации протокол в собак допускается исп?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/8” umbilical tape	Jorgensen Laboratories Inc.,	#J0025UA	for ferric chloride application
4% paraformaldehyde in PBS	Alfa Aesar	AAJ61899AP
10% neutral buffered formalin	Richard-Allan Scientific	5701
2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4)	Sigma Aldrich	T8877
ADP/Collagen cartridges	Siemens Diagnostics	B417021A
4.5 ml 3.2% sodium citrate blood vacutainer	Becton Dickinson	BD 369714
4.5 ml lithium heparin vacutainer	Becton Dickinson	BD 368056
EDTA K3 vacutainers	Becton Dickinson	BD455036
Doppler flow probe	Transonic Systems Inc	MA2.5PSL
Hematoxylin 560	Surgipath	3801570
Eosin	Surgipath	3801602
LabChart Software	ADInstruments Inc.
Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet	Siemen's Diagnostics
Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe)	NovaPlus	402525D
HUG-U-VAC positioning system	DRE Veterinary	1320