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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Kennung der physikalischen Wechselwirkungen zwischen Genen und regulatorische Elemente ist anspruchsvoll aber erfassen Bezahlungsmethode Chromosom Konformation erleichtert worden. Diese Modifikation des 4C-Seq-Protokolls mildert PCR Bias durch Minimierung der Überverstärkung PCR-Vorlagen und maximiert die Mappability von Lesevorgängen durch den Einbau eines Zusatz Restriktionsenzym verdauen Schritt.

Zusammenfassung

Die Identifizierung regulatorischer Elemente für ein bestimmtes Zielgen stellt eine große technische Herausforderung aufgrund der Variabilität in der Positionierung und Wirkung Größen regulatorischer Elemente zu einem Zielgen. Mit bioinformatischen Vorhersage der Existenz und Funktion des proximalen epigenetische Veränderungen verbunden mit aktivierten Genexpression mit konservierten Transkription Faktor Bindungsstellen sind einige Fortschritte erzielt worden. Chromatin Konformation erfassen Studien revolutionierten unsere Fähigkeit, körperliche Chromatin Kontakte zwischen Sequenzen und sogar innerhalb eines gesamten Genoms zu entdecken. Kreisförmige Chromatin Konformation Erfassung gepaart mit Next Generation Sequencing (4C-FF), insbesondere soll alle möglichen physischen Chromatin Interaktionen für eine bestimmte Sequenz von Interesse (Aussichtspunkt), entdecken wie ein Zielgen oder eine behördliche Enhancer. Aktuelle 4C-Seq-Strategien direkt Sequenz von innerhalb der Sicht aber erfordern zahlreiche und vielfältige Sichtweisen gleichzeitig sequenziert werden, um die technischen Herausforderungen der Uniform zu vermeiden mit Plattformen der nächsten Generation Sequenzierung base aufrufen (Imaging). Dieses Volumen von Experimente möglicherweise nicht praktisch für viele Labors. Hier berichten wir über einen modifizierten Ansatz des 4C-Seq-Protokolls, das beinhaltet eine zusätzliche Restriktionsenzym verdauen und qPCR-basierte Verstärkung Schritte, mit denen eine größere Aufnahme des vielfältigen Abfolge lautet erleichtern und verringern das Potenzial für PCR-bias, beziehungsweise. Unsere modifizierte 4C Methode ist geeignet, um die standard molekularbiologischen Labor zur Beurteilung von Chromatin Architektur.

Einleitung

Die Identifizierung regulatorischer Elemente für die Genexpression wurde durch die Enzyklopädie von DNA-Elemente (ENCODE) Projekt erleichtert, die funktionelle Aktivität für 80 % des menschlichen Genoms1,2umfassend kommentiert. Die Identifizierung der Standorte für in Vivo Transkription Faktor Bindung, DNaseI Überempfindlichkeit und epigenetischen Histon und DNA-Methylierungänderungen in einzelnen Zelltypen ebnete den Weg für die Funktionsanalysen des Kandidaten regulatorischen Elemente für Ziel-gen-Expression. Bewaffnet mit diesen Erkenntnissen, stehen wir vor der Herausforderung, zur Bestimmung der funktionellen Interkonnektivität zwischen regulatorische Elemente und Gene. Speziell, was die Beziehung zwischen einem bestimmten Zielgen und seine Enhancer(s) ist? Die Chromatin Konformation Capture (3C)-Methode-Adressen direkt diese Frage durch identifizierende körperliche und wahrscheinlich funktional, Interaktionen zwischen einer Region of Interest und Kandidat Interaktion Sequenzen durch aufgezeichneten Ereignisse in festen Chromatin3 . Da unser Verständnis von Chromatin Interaktionen zugenommen hat, ist es jedoch klar, dass die Untersuchung der vorausgewählten Kandidaten Loci nicht ausreicht, um ein vollständiges Verständnis der Gen-Enhancer Interaktionen zur Verfügung zu stellen. Zum Beispiel ENCODE Hochdurchsatz-chromosomalen Konformation Capture-Kopie (5C)-Methode verwendet, um einen kleinen Teil des menschlichen Genoms (1 %, pilot set 44 Loci) untersuchen und komplexe Vernetzung der Loci berichtet. Gene und Geschmacksverstärker mit identifizierten Interaktionen durchschnittlich 2 – 4 verschiedenen Interaktionspartnern, von die viele Hunderte von Kilobases entfernt in linearen Raum4waren. Darüber hinaus Li Et Al. Chromatin-Interaktions-Analyse durch Paired-End Tag Sequenzierung (ChIA-PET) zur Vollständiggenom Promotor Interaktionen zu analysieren und festgestellt, dass 65 % der RNA-Polymerase II Bindungsstellen an Chromatin Interaktionen beteiligt waren. Einige dieser Interaktionen führte zu großen, Multi-gen komplexe umfasst hunderte von Kilobases der genomischen Distanz und mit durchschnittlich 8-9 Gene jeweils5. Zusammen, unterstreichen diese Ergebnisse die Notwendigkeit für unvoreingenommene Vollständiggenom Methoden zur Abfrage von Chromatin Interaktionen. Einige dieser Methoden sind im Schmitt Et al.überprüft. 6.

Neuere Methoden zur Chromatin Konformation erfassen Studien gepaart mit Next-Generation Sequenzierung (Hi-C und 4C-Seq) ermöglichen die Entdeckung des unbekannten Sequenzen, die Interaktion mit einer Region von Interesse6. Kreisförmigen Chromosom Konformation Aufnahme mit Next Generation Sequencing (4C-Seq) wurde speziell für Loci, die Interaktion mit einer Abfolge von Interesse an eine unvoreingenommene Weise7 durch Sequenzierung von DNA aus aufgenommenen Chromatin proximal zu identifizieren die Region des Interesses im 3D-Raum. Kurz gesagt, ist Chromatin befestigt bewahren seine native Protein-DNA-Wechselwirkungen, mit einem Restriktionsenzym gespalten und anschließend ligiert verdünnte Bedingungen biologisch relevante "Verwicklungen" interagierenden Loci (Abbildung 1) zu erfassen. Die Querverbindungen sind umgekehrt, um das Protein, wodurch die DNA für zusätzliche Spaltung mit einem zweiten Restriktionsenzym entfernt. Eine endgültige Verbindung erzeugt kleinere Kreise der interagierenden Loci. Primer an die Reihenfolge des Interesses werden dann verwendet, um eine verstärkte Bibliothek von unbekannten Sequenzen aus circularized Fragmente, gefolgt von nachgelagerte Sequenzierung der nächsten Generation zu generieren.

Das Protokoll hier vorgestellten, dessen Schwerpunkt Probenvorbereitung macht zwei wichtige Änderungen an bestehenden 4C-Seq Methoden8,9,10,11,12. Zunächst wird eine qPCR basierende Methode um empirisch zu bestimmen, die optimale Anzahl der Verstärkung Zyklen für 4C-Seq Bibliothek Vorbereitungsschritte und mindert somit das Potenzial für PCR-Bias aus Überverstärkung Bibliotheken. Zweitens wird einen zusätzliche Einschränkung Digest Schritt in dem Bemühen um die Einheitlichkeit der bekannten "Köder" Sequenzen zu reduzieren, die behindert genaue Basis-Aufruf durch das Instrument der Sequenzierung und somit maximiert die einzigartigen, informative Reihenfolge bei jedem Lesevorgang. Andere Protokolle umgehen dieses Problem durch die Bündelung von vielen (12-15)8 4 C-Seq Bibliotheken mit verschiedenen Köder Sequenzen bzw. Restriktionsschnittstellen, ein Volumen von Experimente, die von anderen Labors nicht erreicht werden kann. Die hier vorgestellten Änderungen erlauben eine kleine Anzahl von Experimenten, Proben, und/oder repliziert werden indiziert und gebündelt in einer einzigen Spur.

Protokoll

(1) Restriktionsenzym Auswahl

  1. Identifizieren eine Region of Interest (zB., gen-Promotor, Einzel-Nukleotid Polymorphie (SNP), Enhancer) und erhalten die DNA-Sequenz von Repositories wie National Center für Biotechnology Information (NCBI).
  2. Der Kandidat Restriktionsenzyme (REs) zu identifizieren, für die erste Beschränkung Enzym Verdauung (RE1) schneiden, die nicht in der Reihenfolge des Interesses, die produzieren klebriger Ends (DNA-Termini mit Überhängen) nach RE Verdauung und deren Aktivitäten sind nicht gehemmt durch CpG Methylierung.
    Hinweis: Die Auflösung der Daten richtet sich nach RE1. Ein Enzym mit einer erkennungssequenz 6 Basenpaaren (bp) produziert im Durchschnitt etwa 4 Fragmente Kilobases (kb) in der Länge, während ein Enzym mit einer 4 bp erkennungssequenz Fragmente etwa 250 bp in der Länge, so dass eine genauere produziert Kennung der interagierenden Sequenzen.
  3. Wählen Sie eine RE1 aus der Kandidat Enzyme identifiziert in Schritt 1.2, die eine "Viewpoint" Beschränkung Fragment mindestens 500 bp lange produziert, die die Region von Interesse oder alternativ einer benachbarten Region enthält.
    Hinweis: Das Enzym ausgewählt muss Grundierung zugänglich gestalten (siehe Schritt2).
  4. Identifizieren Sie für die zweite Verdauung ein Restriktionsenzym (RE2) mit einer 4 bp erkennungssequenz, die produziert klebrige enden (DNA-Termini mit Überhängen) nach RE Verdauung, deren Tätigkeit nicht durch CpG Methylierung gehemmt, und Kürzungen in der Einschränkung Fragment erzeugte RE1, 250 – 500 bp Köder Fragment (Abbildung 1) zu produzieren.
    Hinweis: Das Enzym ausgewählt muss Grundierung zugänglich gestalten (siehe Schritt2).

2. Entwurf und Test-Primer für Inverse PCR und Verdauung Effizienz qPCR

  1. Verwenden Sie eine Grundierung-Design-Tool wie Primer3 (http://primer3.ut.ee), inverse Primer zu entwerfen, die die Enden des Fragments Köder nach außen gerichtet sind (dh., die 5'-Primer ist ein "Reverse" Grundierung, komplementär zu den plus-Strang, während der 3'-Primer ist ein " weiter zu"Primer, komplementär zu den minus-Strang) und wie nah an die Restriktionsschnittstellen wie möglich um die Verstärkung der nicht-informativen Köder zu minimieren Sequenz und maximieren Sie die Effizienz der PCR (Abbildung 2A).
    Hinweis: Primer sollten Minimale unspezifische Verstärkung aus genomischer DNA haben durch in Silico PCR Prognosen vorhergesagt werden und nicht an anderer Stelle im Genom außer ihrer beabsichtigten Ziel mit mehr als 16/18 Identität9ausrichten sollte. Wie Sequenzierung Adapter nicht in die inverse PCR-Primer integriert sind, ist die Website der Grundierung Bindung flexibler als in anderen Zubereitungsmethoden 4C; Primer sollte optimal Tempern innerhalb 50 bp vom Ende der entsprechenden Einschränkung Website.
    1. Bestätigen Sie die Besonderheit der inverse PCR Primer durch Amplifikation mit gereinigtem genomischer DNA (gDNA) als Vorlage.
    2. Optimalen Primer sollten nur wenige Produkte ergeben, wenn Sie gDNA als Vorlage zu verwenden (siehe Schritt 11.2 für die Beschreibung der erwarteten 4C-Produkte). Wenn erhebliche Verstärkung von gDNA auftritt, entwerfen Sie neue Primer. Wenn keine akzeptable Grundierung Sätze identifiziert werden, zurück zu Schritt 1, und wählen Sie einen neuen Köder durch die Auswahl neuer Restriktionsenzyme.
  2. Design qPCR Primer an die Fragmente 70 – 200 Nukleotide (nt) in der Länge um die Einschränkung Verdauung Effizienz (Abb. 2 b) überwachen verstärken.
    1. Entwerfen Sie ein paar Zündkapseln, über jede Einschränkung-Website (in Schritt 1 ausgewählt) zu verstärken, die die Köder-Sequenz zu definieren. Design der Zündkapseln für beide RE1 (siehe Schritt 6.5.6) und RE2-Websites (siehe Schritt 9.2).
    2. Entwerfen Sie eine Reihe von Grundierungen, die eine Region, die nicht mit den Standorten für entweder Restriktionsenzym als Normalisierung Kontrolle (ungeschnitten DNA) für RE1 und RE2 (siehe auch Schritt 6.5.6) verstärkt.

3. Sammlung von Zellen

  1. Verwenden eine geeignete Methode für die Gewebe- oder Kultur, erhalten Sie eine einzellige Suspension. Pellet-Zellen für 5 min bei 200 X g, überstand verwerfen und das Pellet in 500 µL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) pro 107 Zellen Aufschwemmen.

(4) Formaldehyd Vernetzung der Zellen, Chromatin Interaktionen zu bewahren

  1. Pro 107 Zellen hinzufügen 9,5 mL 1 % Elektronenmikroskopie (EM)-grade Formaldehyd (Methanol-frei) mit PBS-Puffer und inkubieren, während Trommeln auf Rocker (oder ähnliches), für 10 min bei Raumtemperatur (RT, 18-22 ° C).
    Hinweis: Die Fixierung Bedingungen müssen für jeden Zelltyp optimiert werden. Vorherige veröffentlichtes Werk in Mauszellen berichtet, dass optimale Fixation in mindestens 40 % der zugeordneten liest ausrichten auf dem Chromosom, die die Sicht-9 unter der Annahme einer nicht telomeric Region für eine durchschnittliche Größe Chromosom enthält Ergebnisse.
  2. Übertragen Sie die Reaktionsgefäße um Eis und eiskalte 1 M Glycin zu einer Endkonzentration von 0,125 M (1,425 mL) die Vernetzungsreaktion zu stillen. Durch sanfte Umkehrung mischen.
  3. Für 5 min bei 200 X g, 4 ° C zentrifugiert und den überstand vorsichtig entfernen. Speichern Sie die Zelle Pellet bei-80 ° C zu oder sofort zur Zell-Lyse.

(5) Zell-Lyse

  1. Aufschwemmen der Zelle Pellet aus Schritt 4.3 in 500 µL 5 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) zu waschen. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 min bei RT. verwerfen des Überstands.
  2. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 125 µL 5 mM EDTA mit 0,5 % Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) und 1 X Protease-Inhibitoren, wie ein cocktail mit 5 mg/mL Antipain, 10 mg/mL Chymostatin, 10 mg/mL Leupeptin und 10 mg/mL Pepstatin A. 100 x
    Hinweis: Waschmittel Konzentration müssen für jeden Zelltyp optimiert werden. Nicht genügend Reinigungsmittel Konzentrationen führt unvollständig Zelle Lysis, Chromatin unzugänglich für Restriktionsenzyme verlassen. Wenn Beschränkungsverdauung anhaltend niedrige im Schritt 6.5.6 ist und die Aktivität des Enzyms bestätigt wurde, möglicherweise zusätzliche Reinigungsmittel erforderlich. SDS-Konzentration in Schritten von 0,1 % zu erhöhen.
  3. Inkubieren Sie die Zellsuspension für 10 min auf Eis.
    Hinweis: Für primären menschlichen Keratinozyten war optimale Lyse mit eine 10 min Inkubation bei 65 ° C, gefolgt von einer 37 ° C über Nacht Inkubation in einem schütteln Heizblock mit Agitation (900 u/min) erreicht.
  4. Stellen Sie sicher, dass diese Zelle Lysis abgeschlossen ist.
    1. Mix 6 µL der Zellen mit 6 µL Trypan blau auf eine Folie und mit einem Deckglas abdecken. Unter dem Mikroskop betrachten.
      Hinweis: Nach erfolgreicher Lyse, das Innere der Zellen sollte blau erscheinen und UN-lysierten Zellen erscheint weiß.
    2. Wenn die Lyse der Zelle nicht ausreichend erscheint, pellet-Zellen bei 200 X g für 5 min und Speichern des Überstands. Das Pellet aufschwemmen und wiederholen Sie die Schritte 5.2 – 5,4 und/oder alternativ mit verschiedenen Inkubation Temperaturen (siehe Hinweis im Schritt 5.3).
    3. Kombinieren Sie neu lysierten Pellet mit der gespeicherten überstand und fortfahren.
      Hinweis: Sichtprüfung ist keine Garantie für ausreichende Lyse. Verdauung-Effizienz sollte wie in Schritt 6.5.6 Objektiv bestimmt werden.

6. erste Beschränkungsverdauung

  1. Fügen Sie 30 μl 10 x Restriktionsenzym Puffer (vom Hersteller angegebenen) und 27 μL 20 % Triton x-100 (endgültige 1,8 %), die Aussetzung von Schritt 5.4. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 300 µL mit H2O.
    Hinweis: Die Zusammensetzung des Puffers Restriktionsenzym hängt von der RE in Schritt 1 ausgewählt.
  2. Entfernen einer 15 μl aliquoten als "Unverdaute Control" und bei 4 ° C.
  3. Das verbleibende Reaktionsgemisch 200 U RE1 hinzu und Inkubation über Nacht bei der Temperatur angemessen, das Enzym in einem schütteln Heizblock mit Agitation (900 u/min). Am nächsten Tag hinzufügen einer zusätzlichen 200 U RE1 und die Inkubation über Nacht weiter.
  4. Entfernen Sie ein 15 μl aliquoten als "Digested Kontrolle" und bei 4 ° c Lagern
  5. Effizienz der Verdauung zu bestimmen:
    1. 82,5 µL 10 mM Tris-HCl pH 7,5 bis 15 µL Proben aus Schritte 6.2 und 6.4 hinzufügen. Fügen Sie 2,5 µL Proteinase K (20 mg/mL) und 1 h bei 65 ° c inkubieren
    2. 100 µL Phenol-Chloroform und mischen Sie kräftig durch Umkehrung, restliche Protein Verunreinigungen zu entfernen. Zentrifuge für 5 min, 16.100 X g bei Raumtemperatur.
    3. Übertragung der wässrigen Phase zu einem neuen Schlauch. 6.66 µL 3 M Natrium Acetat pH 5,2, 1 µL von 20 mg/mL Glykogen und 300 µL 100 % Ethanol (EtOH) hinzufügen. Mischung sanft durch Umkehrung und Platz bei-80 ° C für 1 h.
    4. Zentrifuge für 20 min bei 16.100 X g bei 4 ° C. Entfernen Sie den überstand zu, fügen Sie 500 µL 70 % EtOH und Zentrifuge für 5 min bei 16.100 X g bei RT
    5. Den überstand zu entfernen und das Pellet bei Raumtemperatur zu trocknen, für 2 min. Aufschwemmen das Pellet in 50 µL Nuklease-freie H2O.
    6. Ermitteln Sie Digest-Effizienz durch qPCR13,14 mit der ∆∆Ct-Methode. Verwenden Sie die Grundierung nicht flankieren eine Einschränkung Website festgelegt (siehe Punkt 2.2.2) als Steuerelement der Normalisierung. Fortsetzen, wenn die Effizienz der Verdauung ist > 85 %. Andernfalls pellet-Zellen und wiederholen Sie die Schritte 5.2 – 6.5, die Inkubation bei 65 ° C im Schritt 5.3 weglassen.

7. erste Ligation

  1. Inaktivieren Sie Hitze-das Restriktionsenzym durch Inkubation 20 min bei 65 ° C. Alternativ, wenn das Enzym Hitze inaktiviert werden kann, Phenol-Chloroform extrahieren und Ethanol überstürzen sich die Probe.
    Hinweis: Empfohlen für einige Restriktionsenzyme Inaktivierung Temperaturen denaturieren die Proteine in der Chromatin und dies der probenqualität beeinträchtigen könnten. Darüber hinaus ist Phenol: Chloroform Extraktion nicht ideal, da es zum Verlust der Probe führt.
  2. Übertragen auf ein 50 mL konische Rohr und 6 mL Nuklease-freie H2O, 700 µL 10-fach Ligase Puffer (660 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM Magnesiumchlorid MgCl2, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 10 mM Adenosintriphosphat (ATP)), und 50 U T4-DNA-Ligase. Sanft durch Umschwenken mischen und über Nacht bei 16 ° c inkubieren
  3. Entfernen Sie eine Aliquote 100 µL der Probe als "Ligatur Control".
  4. Ligatur Effizienz zu bestimmen:
    1. Fügen Sie 2,5 µL Proteinase K (20mg/mL) und inkubieren 1 h bei 65 ° c
    2. Fügen Sie 100 µL Phenol-Chloroform und Mischung kräftig durch Umkehrung. Zentrifuge für 5 min, 16.100 X g bei RT.
    3. Übertragung der wässrigen Phase zu einem neuen Schlauch. Fügen Sie 6,66 µL 3 M Natrium Acetat pH 5,2, 1 µL von Glykogen und 300 µL 100 % EtOH. Mischung sanft durch Umkehrung und Platz bei-80 ° C ca. 1 h.
    4. Zentrifuge für 20 min bei 16.100 X g bei 4 ° C. Entfernen Sie den überstand zu, fügen Sie 500 µL 70 % EtOH und Zentrifuge für 5 min bei 16.100 X g bei 4 ° c
    5. Den überstand zu entfernen und das Pellet bei Zimmertemperatur trocknen. Aufschwemmen Sie das Pellet in 20 µL Wasser und laden Sie auf eine 0,6 % Agarose-Gel neben der "Verdauung Controls" aus Schritt 6.5.
      Hinweis: Eine gut aufgespaltenen Probe erscheint als relativ engen, hohen Molekulargewicht Band (Abbildung 3).
    6. Reicht der Ligatur, fahren Sie mit Schritt 8 fort. Andernfalls fügen Sie frische ATP (1 mM Endkonzentration) und neue Ligase; über Nacht bei 16 ° C inkubieren Sie und wiederholen Sie die Schritte 7,3-7,4.

8. machen Sie Vernetzung rückgängig zu und zu isolieren Sie Chromatin

  1. Fügen Sie 15 µL Proteinase K (20 mg/mL) und inkubieren Sie über Nacht bei 65 ° C, Querverbindungen rückgängig zu machen.
  2. Fügen Sie 30 µL RNase A (10 mg/mL) und inkubieren 45 min bei 37 ° c
  3. 7 mL Phenol-Chloroform und Mischung kräftig durch Umkehrung hinzugeben. Zentrifuge 15 min, 3.300 X g bei RT.
  4. Die wässrige Phase auf eine neue 50 mL Tube übertragen und 7,5 mL Nuklease-freie H2O (zum Verdünnen der DVB-t in der Ligase Puffer, die sonst mit der DNA Ausscheidungen vorhanden), 1 mL 3 M Natrium Acetat pH 5,6, 7 µL von Glykogen (20 mg/mL) , und 35 mL 100 % EtOH. Mischen und bei-80 ° C für 1 h inkubieren.
  5. Zentrifuge 20 min, 3.900 X g bei 4 ° C. Entfernen den überstand (Pellet möglicherweise schwer zu erkennen), waschen Sie die Tablette mit 10 mL eiskaltes 70 % EtOH und Zentrifuge 15 min, 3.300 X g bei 4 ° C.
  6. Entfernen Sie den überstand zu und kurz trocknen Sie das Pellet in RT auflösen das Pellet in 150 µL 10 mM Tris-HCl pH 7,5 bei 37 ° C. Bei-20 ° C lagern oder fahren Sie mit Schritt 9 fort.

9. zweite Beschränkungsverdauung: Trimmen die Kreise

Hinweis: Diese Schritt erstellt kleinere Kreise um die Überrepräsentation kleiner aufgenommenen Fragmente durch PCR Voreingenommenheit in nachgeschalteten Verstärkung Schritte zu minimieren.

  1. Die Probe aus Schritt 8.6 hinzufügen 50 µL 10 x Restriktionsenzym Puffer (vom Hersteller angegebenen), 300 µL Nuklease-freie H2O und 50 U Restriktionsenzym RE2. Inkubieren Sie über Nacht die Temperatur für das gewählte Enzym geeignet.
  2. Entfernen Sie eine Aliquote 15 µL der Probe als "Verdauung Control". Effizienz der Verdauung zu bestimmen, wie in Schritt 6.5 beschrieben.

10. zweite Ligation und DNA-Reinigung

  1. Deaktivieren Sie das Restriktionsenzym, wie vom Hersteller empfohlen. Wenn das Enzym Hitze inaktiviert werden kann, entfernen Sie das Enzym mit einem spaltenbasierten Reinigung-Kit.
    Hinweis: Da dies zum Verlust der Probe führt, ist Spalte Reinigung nicht ideal.
  2. Übertragen Sie die Probe auf eine 50 mL-Tube und 12,1 mL Nuklease-freie H2O, 1,4 mL 10 x Ligatur-Puffer (10 mM DTT, 660 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2; 10 mM ATP) und 100 U T4-DNA-Ligase. Inkubation über Nacht bei 16 ° C.
  3. Hinzufügen von 467 µL 3 M Natrium Acetat pH 5.6, 233 µL Nuklease-freie H2O, 7 µL Glykogen (20 mg/mL) und 35 mL 100 % EtOH. Gut mischen und bei-80 ° C 1 h inkubieren.
  4. Zentrifuge 45 min, 3.900 X g bei 4 ° C. Den überstand zu entfernen, fügen Sie 10 mL kaltem 70 % EtOH und Zentrifuge 15 min, 3.300 X g bei 4 ° C.
  5. Den überstand zu entfernen und kurz das Pellet bei Zimmertemperatur trocknen. Fügen Sie 150 µL 10 mM Tris-HCl pH 7,5 und Inkubation bei 37 ° C, das Pellet aufzulösen.
  6. Reinigen Sie die Proben mit einem Kieselsäure spaltenbasierten PCR Reinigung Kit, nach den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie 1 Spalte pro 3 x 106 Zellen, basierend auf der ursprünglichen Anzahl der Zellen. Eluieren Sie Spalten mit 50 µL 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 und bündeln Sie die Proben zu.
  7. Messen die Konzentration von Fluorimetry oder Spektrophotometrie über die Absorption bei 260 nm. Die 4C-Vorlage ist nun bereit für die Inverse PCR. Bei-20 ° C lagern Sie oder gehen Sie direkt zu Schritt 11.

11. die PCR verstärken unbekannte interagierende Sequenzen durch Inverse PCR

  1. Bestimmen des linearen Bereichs der Verstärkung durch eine PCR mit Vorlage Verdünnungen von 12.5, 25, 50 und 100 ng 4C Vorlage durchführen. Falls gewünscht, verstärken von gDNA parallel direkt Produkte vergleichen, um unspezifische Verstärkung zu identifizieren. Laufen Sie PCR-Reaktionen mit einer anfänglichen Denaturierung bei 94 ° C für 2 min; 30 Zyklen, bestehend aus einer Denaturierung Schritt bei 94 ° C für 10 s, ein Glühen Schritt bei 55 ° C für 1 min und eine Verlängerung Schritt bei 68 ° C für 3 min; und eine letzte Verlängerung bei 68 ° C für 5 Minuten.
  2. Trennen Sie 15 µL der einzelnen PCR-Produkte auf einem 1,5 % Agarose-Gel Lineare Verstärkung zu bestätigen und bewerten Vorlage Qualität (Abbildung 4). Verstärkung aus 4C Vorlage sollte diskret Bündchen an geringen DNA-Konzentrationen und ein Abstrich bei höheren Konzentrationen ergeben. Das Vorhandensein der Abstrich bedeutet erhöhte Komplexität der verstärkten 4C Verbindlichkeiten.
  3. Wenn Sie zufrieden sind mit der Qualität und Quantität des inverse PCR Produktes generiert, richten Sie eine qPCR zu bestimmen, die optimale Anzahl von Zyklen für Verstärkung verwenden:
    1. Richten Sie die Reaktionen mit SYBR und ROX Farbstoffe mit dem Reaktionsgemisch in Tabelle 2. Es sei denn, die Verstärkung nicht linear in hohen Konzentrationen in Schritt 11.2, Einsatz 100 ng der Vorlage pro Reaktion ist.
      Hinweis: Die Zugabe von ROX erleichtert die Normalisierung der Fluoreszenzsignal von Brunnen zu Brunnen und Zyklus zu Zyklus.
    2. Laufen Sie die PCR-Reaktionen mit einer anfänglichen Denaturierung bei 94 ° C für 2 min; 40 Zyklen, bestehend aus einer Denaturierung Schritt bei 94 ° C für 10 s, ein Glühen Schritt bei 55 ° C für 1 min und eine Verlängerung Schritt bei 68 ° C für 3 min; und eine letzte Verlängerung bei 68 ° C für 5 Minuten.
    3. Bestimmen Sie die Spitze (Endpunkt) Fluoreszenz der Reaktionen mit der Verstärkung Plot. Bestimmen Sie den Zyklus unter dem Reaktionen 25 % der Peak-Fluoreszenz (Abbildung 5 erreichen).
      Hinweis: Dies ist die Anzahl der Zyklen, die verwendet wird, um die 4 C-Bibliotheken zu verstärken (siehe Schritt 11,4).
  4. Richten Sie Inverse PCR wie in Tabelle 3 unbekannte Sequenzen ligiert auf den Köder aus der 4 C-Vorlage zu verstärken. Teilen Sie in 16 Reaktionen von 50 µL vor der Ausführung. Führen Sie PCR-Reaktionen mit einer anfänglichen Denaturierung bei 94 ° C für 2 min und Zyklen, bestehend aus einer Denaturierung Schritt bei 94 ° C für 10 s, ein Glühen bei 55 ° C für 1 min step und ein Verlängerung Schritt bei 68 ° C für 3 min. verwenden die Anzahl der Zyklen, die in Schritt 11.3.3 bestimmt.
  5. Sammeln Sie und bündeln Sie die Reaktionen. Reinigen Sie mit einem Kieselsäure spaltenbasierten PCR-Reinigung-Kit. Verwenden Sie mindestens 2 Spalten pro 16 Reaktionen. Bündeln Sie die gereinigten PCR-Produkte.
  6. Bestimmen Sie die Probenmenge und Reinheit durch Spektralphotometrie. Typische Erträge sind zwischen 10 und 20 μg mit A260/A280 ~ 1,85. Wenn die Absorption Verhältnisse suboptimal sind, wieder zu reinigen und die Probleme während der Sequenzierung zu vermeiden.
  7. Bewerten Sie die Komplexität der Bibliothek durch die Trennung von 300 ng des gereinigten PCR-Produkt auf einem 1,5 % Agarose-Gel.
    Hinweis: Verstärkte Produkt sollte, die aus Schritt 11.2 ähneln.

12. dritte Beschränkungsverdauung: Schneiden Sie Köder Sequenzen

Hinweis: Diese Schritt entfernt-informative Köder Sequenzen aus die inverse PCR-Produkte, informative aufgenommene Sequenzen in den nachgelagerten Sequenzierung Schritten zu maximieren. Um Digest Effizienz zu überwachen, ist eine "Digest Monitor"15 parallel mit entsprechenden DNA- und Enzym-Konzentration verdaut. Wenn RE1 und RE2 für gleichzeitige Verdauung nicht kompatibel sind, muss zum Beispiel durch verschiedene optimale Inkubation Temperaturen oder Reaktion Puffer, als eine sequentielle Digest dies (das ist nicht ideal).

  1. Erhalten Sie einen RE-Digest-Monitor und testen Sie die Verdauung in 50 µL Reaktion zu.
    Hinweis: Dies ist ein Molekül von DsDNA (z. B. ein Plasmid, PCR Amplifikate oder synthetische DNA), die den RE-Websites enthält. Die einzige Voraussetzung ist, dass es leicht zu schneiden von unbeschnittenen Monitor auf ein Agarosegel zu unterscheiden sein sollte. Optimize RE Monitor Masse und Enzym-Konzentration bei Bedarf.
  2. Digest 1 µg der gereinigten inverse PCR-Produkt aus Schritt 11,6 und parallel den RE-Monitor aus Schritt 12.1.
    Hinweis: DNA sowie Enzym Konzentration und Inkubationszeit, sollte die gleiche wie bei der Test-Digest im Schritt 12.1 für sowohl die inverse PCR-Produkt und den Monitor-Übersichten. Passen Sie das Reaktionsvolumen nach Bedarf an.
  3. Führen Sie die verdaute RE Monitor auf ein Agarosegel der Konzentration für die erwarteten Fragmente geeignet. Verdauung wird als ausreichend erachtet wenn < 10 % der DNA bleibt ungeschnitten (Abbildung 6).
  4. Reinigen Sie das verdaute inverse PCR-Produkt auf einem Kieselsäure spaltenbasierten DNA-Reinigung-Kit. Wenn sequenzielle Übersichten erforderlich sind, wiederholen Sie die Schritte 12.1-12.4 mit dem zweiten Enzym.

13. Vorbereitung der Sequenzierung Bibliothek

  1. Verbinden Sie den Adapter mit der jeweiligen Plattform für die Sequenzierung der nächsten Generation kompatibel.
    1. Entwerfen Sie die Adapter für jede RE1 und RE2, sodass nach dem Glühen der Oligos jeden RE-Adapter den jeweiligen 1-seitig Überhang hat.
      Hinweis: zum Beispiel, wenn HindIII verwendet wird, sollte der geglühten Adapter "AGCT" Überhangs 5' phosphoryliert enthalten. Alternativ, wenn T-Überhang Standardadapter verwendet werden, Ende-Reparatur und A-Tail der Bibliothek vor Adapter Ligatur.
    2. Tempern Sie die jeweiligen Adapter RE Oligos. Aufschwemmen Sie der Oligos glühen Puffer (10 mM Tris, pH 7.5, 50 mM Natriumchlorid (NaCl), 1 mM EDTA), äquimolaren Mengen bis 50 µM, Hitze bis 95 ° C einrühren Sie und langsam auf 25 ° c abkühlen lassen
    3. Führen Sie die Ligatur Reaktion. 1 x Ligase Puffer wieder verdaut 4 C-Bibliothek mit einem insgesamt 5 bis 10 fache molaren Überschuß der geglühten Adapter (Schritt 13.1.2; 50: 50-Verhältnis für jeden RE-Adapter verwendet) unterrühren und 6U DNA Ligase hinzufügen. Inkubieren Sie nach Anweisungen des Herstellers.
    4. Entfernen Sie überschüssige Adapter durch die Reinigung mit einem Low-Elution Volumen Silica-basierten Spalte-Kit.
  2. Größe auswählen.
    Hinweis: Größenauswahl kann auch mit einem Wulst basierende Bereinigung Kit durchgeführt werden und wird auch nach Spalte Reinigung empfohlen.
    1. Werfen Sie eine 2 % Agarosegel mit einem hochauflösenden Agarose, Hinzufügen eines nicht-UV-Fleckes vor dem Gießen. Sicherstellen Sie, dass Wasserverlust durch Verdunstung während der Erwärmung durch Wiegen der Flasche oder Kolben vor und nach der Heizung und Zugabe von Wasser zur Wiederherstellung der verlorenen Mass ersetzt wird.
    2. Führen Sie die Adapter ligiert Bibliotheken auf dem Gel, verlassen leere Gassen zwischen den Proben.
    3. Verbrauchssteuern Sie die Gel-Scheiben entsprechend der Größe Auswahl 150 bp auf 1 kb mit einem sauberen Skalpell oder einer Rasierklinge.
    4. Reinigen Sie die Bibliotheken aus dem Gel mit einem Gel Extraction Kit. Zur Minimierung von GC Voreingenommenheit bei der Beitreibung von DNA lösen Sie Gel Scheiben bei Raumtemperatur mit Rotation auf.
  3. Bestimmen Sie die Anzahl der Zyklen für PCR Verstärkung von qPCR mit dem Reaktionsgemisch in Tabelle 4. PCR-Reaktionen mit einer anfänglichen Denaturierung bei 98 ° C für 2 min laufen und 40 Zyklen, bestehend aus einer Denaturierung Schritt bei 98 ° C für 10 s, ein Glühen Schritt bei 60 ° C für 1 min und eine Verlängerung Schritt bei 72 ° C für 3 Minuten.
    Hinweis: Der Zyklus mit dem Fluoreszenz 25 % des Maximums erreicht ist die Anzahl der Zyklen, die verwendet wird, um die Bibliothek, wie in Schritt 11.3 verstärken.
  4. Verstärken Sie die Bibliotheken mit dem Reaktionsgemisch in Tabelle 5. Führen Sie PCR-Reaktionen mit einer anfänglichen Denaturierung bei 98 ° C für 2 min und Zyklen, bestehend aus einer Denaturierung Schritt bei 98 ° C für 10 s, ein Glühen Schritt bei 60 ° C für 1 min und eine Verlängerung Schritt bei 72 ° C für 3 Minuten. Die Anzahl der Verstärkung Zyklen für jede Bibliothek zu verwendende wurde in Schritt 13.3 ermittelt.
  5. Verstärkte Bibliotheken mit einem Low-Elution Volumen Silica-basierten Spalte Kit zu reinigen.

14. die Sequenzierung und Analyse von Daten-Sequenzierung

  1. Bestimmen Sie die Konzentrationen von verstärkten Bibliotheken mit einem Antikörper-Assay. Verdünnen Sie die Bibliotheken auf die entsprechende Konzentration für die Sequenzierung (Fragen Sie den Sequenzierservice oder Kern für ihre Empfehlung).
  2. Bestimmen Sie die Qualität der Bibliotheken mit Hilfe einer mikrofluidischen Nukleinsäure-Analyse-Plattform.
    Hinweis: Die Größe Profil der Bibliothek sollte auf die Größe Auswahl Gel Schritt 13.2 gesehen spiegeln und die Konzentration der Probe bestimmt in diesem Schritt für die Sequenzierung verwendet werden soll.
  3. Pool indiziert Bibliotheken um mindestens 3 Millionen mal gelesen (mindestens 50 bp lesen; Single [1 X 50] oder gekoppelten Ende [2 X 50]) pro Probe zu erhalten. Eine qualitativ hochwertige Bibliothek erfordert mindestens 1 Million abgebildet liest9, aber es werden einige Abrieb während des Mappings. Beispielsweise kann eine Sequenzierung-Plattform, die rund 150 Millionen Lesevorgänge pro Bahn ergibt bis zu 50 Proben in einer einzigen Spur aufnehmen.

15. Analyse von Sequenzdaten

  1. Demultiplex die Daten mithilfe von Index-Sequenzen der liest ihre entsprechenden Proben zuweisen.
    Hinweis: Abhängig von der Vertrautheit können Benutzer nachgelagerte computergestützte Analysen von raw FASTA/FASTQ-Sequenz-Dateien, die über grundlegende Kommandozeilen-Schnittstelle oder alternativ die benutzerfreundliche, webbasierte Galaxy grafische Schnittstelle (GUI)16 durchführen .
  2. Schneiden Sie Adapter-Sequenzen und Köder-Sequenz infolge unvollständiger RE Verdauung in Schritt 12, zum Beispiel, mit dem schnell-X-Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/).
  3. Angemessenen Genom von Interesse demultiplexed liest zuordnen (zB., UCSC mm10, hg19) mit Burrows-Wheeler Aligner (BWA)17 oder anderen Alignment-Software, was SAM Ausgabedateien. Bei Bedarf, SAM-Dateien konvertieren, BAM über Samtools18 (siehe Schritt 15,4).
  4. Verwenden Sie eine 4C-Seq Analyse Pipeline oder Basic4Cseq19, 4 C-Ker-20, FourCSeq21, FourSig22 , um die Daten analysieren und identifizieren die Wechselwirkungen.
    Hinweis: Daten-Analyse und die Bewertung ihrer Qualität sollte entsprechend der ausgewählten Software-Paket-Referenz-Handbuch durchgeführt werden. Pakete erstellen Bett Ausgabedateien außer anders angegeben. Kurz, Basic4CSeq19 eine Eingabedatei SAM (Schritt 15,3) verwendet, um die Wechselwirkungen (Txt, Tiff, Bett und Perücke Ausgabedateien) zu visualisieren und bewertet die Qualität der Daten anhand der Kriterien des van de Büromaschinenhersteller Et Al. 9 -4 C-Ker-20 (Eingang getrimmt FASTQ, Schritt 15,2) und FourCSeq21 (Eingang BAM, Schritt 15,3) identifizieren differenzielle Interaktionen zwischen Bedingungen. FourSig22 (Eingang SAM) auch signifikante Wechselwirkungen identifiziert und priorisiert die reproduzierbar sein dürften. Werkzeuge wie die genomische regulatorischen Bereicherung der Anmerkungen Werkzeug (große)23oder Integration mit ENCODE Datensätze können auch verwendet werden, um vorherzusagen, die biologische Funktion von Wechselwirkungen entdeckt von 4 C-f

Ergebnisse

Primären menschlichen Keratinozyten wurden isoliert von 2 – 3 ausrangierte neonatale Vorhäute, gebündelt und kultiviert in KSFM ergänzt mit 30 µg/mL bovine Hypophyse extrahieren, 0,26 ng/mL rekombinanten menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor und 0,09 mM-Kalzium-Chlorid (CaCl2 ) bei 37 ° C, 5 % aus Kohlendioxid. Die Zellen wurden in zwei Fläschchen aufgeteilt, und eine Flasche wurde durch die Zugabe von CaCl2 um eine Endkonzentration von 1,2 mM für 72 h. ...

Diskussion

4C Ergebnisse haben das Potenzial, Chromatin-Interaktionen, die bisher unbekannte regulatorischen Elemente identifizieren können und/oder Zielgene, die wichtig sind in einem bestimmten biologischen Kontext24,25,26zu offenbaren. Technische Hürden schränken jedoch die Daten aus diesen Experimenten. PCR-Bias aus Überverstärkung Vorlage in 4 C Protokolle ist wahrscheinlich. Dieses Protokoll behebt dieses Problem durch die Verwe...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch NIAMS (R01AR065523) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
HindIIINEBR0104S
CviQINEBR0639S
DNA oligonucleotide primersIDTTo be designed by the reader
50 mL conical centrifuge tubesFisher Scientific06-443-19
1.7 mL microcentrifuge tubesMidSciAVSS1700
Phosphate buffered salineThermo Fisher14190-136
Formaldehyde, methanol freeElectron Microscopy Sciences15710
NutatorVWR15172-203
GlycineJT Baker4059-00
Benchtop centrifuge
Refrigerated microcentrifuge
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichED2SS
20% SDS solutionSigma-Aldrich05030
Trypan BlueThermo Fisher15250061
Glass slidesFisher Scientific12-550-143
Cover slipsVWR16004-094
Light microscope
Triton X-100Alfa AesarA16046
Shaking heat block
2 M Tris-HClQuality Biological351-048-101
Proteinase KNEBP8107S
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)Sigma-AldrichP2069
Sodium acetateSigma-AldrichM5661
20 mg/mL glycogenThermo FisherR0561
EthanolFisher Scientific04-355-223
Nuclease-free waterFisher ScientificMT-46-000-CM
qPCR cyclerThermo Fisher4453536
qPCR platesThermo Fisher4309849
ThermocyclerThermo Fisher4375786
PCR strip tubesMidSciAVSST-FL
1 M Magnesium chlorideQuality Biological351-033-721
DithiothreotolSigma-Aldrich43815
Adenosine triphosphateSigma-AldrichA2383
T4 DNA LigaseNEBM0202S
AgaroseSigma-AldrichA6013
RNase AThermo FisherEN0531
Qiaquick PCR purification kitQiagen28104
MinElute PCR Purification kitQiagen28004
Spectrophotometer
Expand Long Template PCR SystemSigma-Aldrich11681834001
dNTP mixThermo FisherR0191
SYBR Green ISigma-AldrichS9430
ROXBioRad172-5858
Sodium chlorideSigma-AldrichS5886
End-It DNA End-Repair KitLucigenER0720
LigaFast Rapid DNA Ligation SystemPromegaM8221
SYBR SafeThermo FisherS33102
Taq PolymeraseNEBM0267S
UltraSieve AgaroseIBI ScientificIB70054
Qiaquick Gel Extraction KitQiagen28704

Referenzen

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