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요약

유전자와 규제 요소 간의 물리적 상호 작용의 식별 도전 이지만 염색체 구조 캡처 방법에 의해 촉진 되었습니다. 4 C-seq 프로토콜이 수정이 PCR 템플릿-증폭을 최소화 하 여 PCR 바이어스를 완화 하 고 또한 금지 효소 다이제스트 단계를 통합 하 여 읽기의 mappability을 극대화.

초록

주어진된 대상 유전자에 대 한 규제 요소 식별 규제 요소 대상 유전자의 위치 및 효과 크기 가변성 때문는 상당한 기술에 도전 포즈. 존재의 bioinformatic 예측 및 보존된 전사 인자 바인딩 사이트를 사용 하 여 활성화 된 유전자 발현과 관련 된 근 후 성적인 수정의 기능 일부 진행이 했다. Chromatin 구조 캡처 연구 실제 chromatin 연락처 시퀀스 사이 고 심지어는 전체 게놈 안에서 발견 하는 우리의 능력을 혁명 있다. 원형 chromatin 구조 캡처 다음-세대 시퀀싱 (4 C-seq)과 함께 특히, 설계 관심 (관점)의 특정된 시퀀스에 대 한 가능한 모든 물리적 chromatin 상호 작용 발견 대상 유전자 또는 규제 등 증강입니다. 현재 4 C-seq 전략 직접 관점 내에서 시퀀스 하지만 수많은 요구와 동시에 유니폼의 기술 문제를 피하기 위해 시퀀스 수를 다양 한 관점 다음 세대 시퀀싱 플랫폼 호출 (영상) 기지. 실험의이 볼륨 많은 실험실에 대 한 실용적 되지 않을 수 있습니다. 여기, 우리는 추가 금지 효소 다이제스트 및 가능성을 완화 하 고 다양 한 시퀀스 읽기의 큰 캡처를 용이 하 게 설계 된 정량 기반 증폭 단계 통합 4 C-seq 프로토콜 수정된 접근 보고 PCR 편견, 각각. 우리의 수정 4 C 방법은 의무가 chromatin 아키텍처를 평가 하기 위한 표준 분자 생물학 실험실입니다.

서문

유전자 발현에 대 한 규제 요소의 id 인간 게놈1,2의 80% 기능 활동을 포괄적으로 주석 백과 사전의 DNA 요소 (인코딩) 프로젝트에 의해 촉진 되었습니다. 녹음 방송 요인 바인딩 vivo에서 , DNaseI 과민성 및 epigenetic 히스톤 DNA 메 틸 화 수정 개별 셀에 대 한 사이트의 식별 후보 규제의 기능 분석에 대 한 방법을 포장 대상 유전자 발현에 대 한 요소입니다. 이러한 결과와 무장, 우리 규제 요소와 유전자 간의 기능 상호 결정의 도전으로 직면 된다. 특히, 주어진된 대상 유전자와 그것의 enhancer(s) 사이 관계는 무엇 인가? 염색 질 구조 캡처 (3 C) 메서드는 직접 식별 물리적, 그리고 가능성이 기능, 상호 작용을 통해 관심 영역 및 시퀀스 고정된 chromatin3에에서 캡처된 이벤트를 통해 상호 작용 하는 후보 사이이 질문을 해결 . 그러나 Chromatin의 상호 작용에 대 한 우리의 이해 증가로, 그것은 분명 미리 후보 loci의 조사 유전자 증강 상호 작용의 완전 한 이해를 제공 하는 부족 한 것입니다. 예를 들어 인코딩 높은 처리량 염색체 구조 캡처 탄소 복사 (5 C) 방법을 사용 하는 인간 게놈 (1%, 파일럿 44 loci의 설정)의 작은 부분을 검사 하 고 보고는 loci의 복잡 한 상호. 유전자와 확인 된 상호 강화 평균 2-4 다른 상호 작용 파트너는 많은 수백 kilobases 선형 공간4에서 멀리 했다. 또한, 리튬은 외. 전체 게놈 발기인 상호 작용을 분석 하 여 RNA 중 합 효소 II 바인딩 사이트의 65 %chromatin 상호 작용에 참여 했다 발견 Chromatin 상호 작용 분석 쌍 끝 태그 시퀀싱 (ChIA 애완 동물)를 사용. 이러한 상호 작용 중 일부 결과 kilobases 게놈 거리 및 포함 하는, 평균,의 수백에 걸쳐 큰, 다중 유전자 복합물에 8-9 유전자 각5. 함께,이 발견 심문 chromatin 상호 작용에 대 한 편견된 전체 게놈 방법에 대 한 필요성을 강조 표시 합니다. 슈미트 외에 이러한 방법 중 일부를 검토 한다. 6.

Chromatin 구조 캡처 연구에 대 한 더 많은 최근 방법 관심6의 지역 상호 작용 하는 알 수 없는 시퀀스의 발견 다음-세대 시퀀싱 (Hi-C와 4 C-seq) 활성화와 결합. 특히, 다음-세대 시퀀싱 (4 C-seq) 원형 염색체 구조 캡처 loci 캡처된 chromatin에 인접에서 DNA 시퀀싱 하 여 공평한 방식으로7 의 시퀀스와 상호 작용을 식별 하기 위해 개발 되었다 합니다 3D 공간에 대 한 관심의 영역입니다. 간단히, chromatin의 기본 단백질 DNA 상호 작용, 제한 효소로 죽 습 및 상호 작용 loci (그림 1)의 생물학 관련 "엉 킴"을 잡으려고 희석 조건 이후 출혈을 보존 하기 위해 고정 됩니다. 따라서 두 번째 제한 효소로 DNA 분열을 추가 사용할 수 떠나는 단백질을 제거 하는 크로스 링크 반전 한다. 마지막 결 찰 상호 작용 loci의 작은 동그라미를 생성합니다. 관심사의 순서에 뇌관 다음 다운스트림 다음 세대 시퀀싱 다음 circularized 조각에서 알 수 없는 시퀀스의 증폭된 라이브러리를 생성 하는 데 사용 됩니다.

샘플 준비에 초점을 맞추고, 여기, 프로토콜은 기존 4 C-seq 방법8,9,10,,1112에 두 가지 주요 변경 합니다. 첫째, 정량 기반 메서드를 사용 하 여 실험적으로 결정 하 증폭의 최적의 수 4 C-seq 라이브러리 준비 단계 주기 따라서 PCR 바이어스 라이브러리-확대에서 형태소 분석에 대 한 가능성을 줄입니다. 둘째, 그것은 시퀀싱 악기에 의해 정확한 자료 호출을 방해 하 고, 따라서, 각 읽기에 독특한, 유익한 시퀀스를 극대화 하는 알려진된 "미끼" 시퀀스의 균일성을 줄이기 위해 노력에서 한 추가 제한 다이제스트 단계를 사용 합니다. 다른 프로토콜은 다른 미끼 시퀀스 또는 금지 사이트, 다른 실험실에 의해 달성 되지 않을 수 있습니다 실험의 많은 (12-15)8 4 C-seq 라이브러리를 풀링 하 여이 문제를 포위. 여기에 제시 된 수정 실험, 수가 적은 샘플, 또는 색인 풀링된 단일 차선으로 복제를 허용 합니다.

프로토콜

1. 제한 효소 선택

  1. 관심 영역 식별 (예., 유전자 발기인, 단일 염기 다형성 (SNP), 확장기) 생명 공학 정보 (NCBI)를 위한 국립 센터 같은 저장소에서 DNA 시퀀스를 가져옵니다.
  2. 첫 번째 제한 효소 소화 (RE1)을 자르지 않는다 관심사의 순서 안에 소화, 다시 후 끈 적 끝 (돌출부와 DNA 테르미니)을 생산 및 그 활동은에 의해 저해 하지에 대 한 후보 제한 효소 (REs) 식별 CpG 메 틸 화입니다.
    참고: 데이터의 해상도 RE1에 의해 결정 됩니다. 6 기본적인 쌍 (bp) 인식 순서를 가진 효소 생산, 평균, 조각 약 4 kilobases (kb) 길이, 4 혈압 인식 순서를 가진 효소 생산 조각 약 250 bp 길이, 더 정확 하 게 허용 하는 동안 상호 작용 시퀀스의 id입니다.
  3. 관심 영역 또는, 양자 택일로, 인근 지역의 포함 하 긴 "관점" 제한 조각 적어도 500 bp 생산 단계 1.2에서 확인 된 후보 효소에서를 RE1를 선택 합니다.
    참고: 선택 하는 효소는 뇌관에 순종 해야 합니다. 디자인 (단계 2 참조).
  4. 두 번째 소화에 대 한 제한 효소 (RE2) 소화, 그 활동은 하지 CpG 메 틸 화에 의해 저해 하 고 그 제한 내에서 다시 후 끈 적 끝 (돌출부와 DNA 테르미니)을 생성 하는 4 혈압 인식 시퀀스 확인 RE1 250-500 bp 미끼 조각 (그림 1) 생산에 의해 생성 된 조각입니다.
    참고: 선택 하는 효소는 뇌관에 순종 해야 합니다. 디자인 (단계 2 참조).

2. 설계 및 테스트 역 PCR 및 소화 효율 정량 pcr 뇌관

  1. Primer3 같은 뇌관 디자인 도구를 사용 하 여 미끼 파편의 끝을 향해 바깥쪽으로 이동 역 뇌관 디자인 (http://primer3.ut.ee) (즉., 5' 뇌관은 "반전" 뇌관, 3' 뇌관은 플러스 물가에 무료 한 " 앞 으로"뇌관, 마이너스 물가에 보완)으로 가까이 비 유익한 미끼의 증폭을 최소화 하기 위해 가능한 제한 사이트 순서 (그림 2A) PCR 효율을 극대화.
    참고: 뇌관 PCR 예측 철에 의해 게놈 DNA에서 최소한의 일반적인 확대를 예측 해야 하 고 해야 정렬 되지 않을 다른 곳에서 그들의 목표를 제외 하 고 게놈에서 이상 16/18 신원9. 시퀀싱 어댑터는 반전 PCR 뇌관에 통합 되지, 뇌관 바인딩의 사이트는 다른 4 C 준비 방법; 보다 더 유연 뇌관 50 이내 anneal 최적 해야 해당 제한 사이트의 끝의 혈압.
    1. 템플릿으로 순화 genomic DNA (gDNA)를 사용 하 여 증폭 하 여 반전 PCR 뇌관의 특이성을 확인 합니다.
    2. 최적의 뇌관 때 gDNA를 템플릿으로 사용 하 여 몇 가지 제품을 산출 해야 한다 (예상된 4 C 제품의 설명에 대 한 단계 11.2 참조). 상당한 증폭 gDNA에서 발생 하는 경우 새로운 뇌관 디자인. 없는 허용 뇌관 세트를 식별 하는 경우 단계 1을 새로운 제한 효소를 선택 하 여 새로운 미끼를 선택.
  2. 길이 제한 소화 효율 (그림 2B)를 모니터링 하는 조각을 70-200 뉴클레오티드 (nt) 증폭 정량 Pcr 뇌관 디자인.
    1. 디자인 미끼 시퀀스를 정의 하는 각 제한 사이트 (단계 1에서 선택한)에 걸쳐 증폭 하는 뇌관의 한 쌍. 두 RE1 뇌관 디자인 (6.5.6 단계 참조) 및 RE2 사이트 (단계 9.2 참조).
    2. RE1 및 RE2 (6.5.6 단계 참조) 하거나 제한 효소에 대 한 사이트 정규화 컨트롤 (포경된 DNA) 포함 하지 않는 영역을 증폭 하는 뇌관의 집합을 디자인 합니다.

3입니다. 셀의 컬렉션

  1. 조직 또는 세포 문화에 대 한 적절 한 메서드를 사용 하 여 단일 셀 서 스 펜 션 가져올. 작은 200 x g에 5 분에 대 한 셀을 삭제는 상쾌한 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 107 셀 당 x 1의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend.

4. 포름알데히드 Chromatin 상호 작용을 유지 하기 위해 셀의 Cross-linking

  1. 107 셀 당 추가 1% 전자 현미경 (EM)의 9.5 mL-포름알데히드 (메탄올-무료) PBS에서 학년 및 품 어, 로커에 연속 (또는 유사한), 실 온 (RT, 18-22 ° C)에서 10 분.
    참고: 고정 조건 각 셀 형식에 대 한 최적화가 있을 수 있습니다. 마우스 셀에 사전 게시 작업 그 최적의 고정 매핑된 읽기 평균 크기의 염색체에 대 한 비-telomeric 영역을 가정 관점9 를 포함 하는 염색체에 정렬의 적어도 40%에 결과 보고.
  2. 얼음 0.125 M (1.425 mL) 끄다 가교 반응의 최종 농도에 얼음 1 M 글리신을 추가 하는 반응 튜브를 전송 합니다. 부드러운 반전에 의해 혼합.
  3. 200 x g, 4 ° C에서 5 분 동안 centrifuge 고 신중 하 게 모든 상쾌한을 제거 합니다. -80 ° C에서 셀 펠 릿 저장 하거나 세포를 세포에 즉시 진행 합니다.

5. 세포 세포의 용 해

  1. 5 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 씻어의 500 µ L에서 단계 4.3에서 셀 펠 릿 resuspend 실시간 삭제에서 5 분 동안 200 x g 에서 원심은 상쾌한.
  2. 5 mm EDTA 0.5% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 125 µ L에서 셀 펠 릿과 칵테일 5 mg/mL antipain, 10mg/mL chymostatin, 10mg/mL leupeptin, 그리고 10 mg/mL pepstatin A. 100 x 같은 x protease 억제제, 1 resuspend
    참고: 세제 농도 각 세포 유형에 최적화가 있을 수 있습니다. 부족 한 세제 농도 불완전 한 세포 세포의 용 해, chromatin 액세스할 수 없는 제한 효소를 떠나 발생 합니다. 제한 소화가 지속적으로 낮은 단계 6.5.6 효소의 활동을 확인 하는 경우 추가 세제 필요할 수 있습니다. SDS 농도 0.1% 단위로 증가.
  3. 10 분 동안 얼음에 세포 현 탁 액을 품 어.
    참고: 기본 인간의 keratinocytes에 대 한 최적의 세포 달성 했다 동요 (900 rpm)와 함께 떨고 난방 블록에서 37 ° C 하룻밤 부 화 뒤 65 ° C에서 10 분 부 화를 사용 하 여.
  4. 그 세포 세포의 용 해 완료 되 면 확인 하십시오.
    1. 혼합 6 µ L 셀의 6 µ L Trypan 파랑의 슬라이드와 커버는 coverslip로. 현미경으로 볼 수 있습니다.
      참고: 성공적인 세포에는 세포의 내부 나타납니다 파란색 하 고 유엔 lysed 세포 흰색 표시 됩니다.
    2. 세포 세포의 용 해 부족 한 경우, 5 분 동안 200 x g 에서 셀 펠 렛 하 고는 상쾌한 저장 합니다. Resuspend 펠 릿 및 반복 단계 5.2-5.4 및 또는 다른 외피 온도 (단계 5.3에 참고 참조).
    3. 저장 된 상쾌한 다시 lysed 펠 릿 결합 하 고 진행 합니다.
      참고: 검사 충분 한 세포 보장 하지 않습니다. 소화 효율 단계 6.5.6에서 객관적으로 결정 되어야 합니다.

6. 첫 번째 제한 소화

  1. 제한 효소 버퍼 (제조 업체에 의해 지정 된) x 10의 30 μ와 20%의 27 μ 추가 단계 5.4에서 현 탁 액을 트라이 톤 X-100 (최종 1.8%). H2o. 300 µ L을 총 볼륨을가지고
    참고: 제한 효소 버퍼의 구성 1 단계에서에서 선택한 다시에 따라 달라 집니다.
  2. "소화 되지 않은 관리" 및 4 ° c.에 게 서 15 μ aliquot 제거
  3. 200 U RE1 나머지 반응 혼합물에 추가 하 고 동요 (900 rpm)와 함께 떨고 난방 블록에 효소에 적합 한 온도에서 밤새 품 어. 다음 날, 추가 200 U RE1 추가 하 고 하룻밤 사이 부 화를 계속.
  4. 15 μ "소화 제어"로 aliquot를 제거 하 고 4 ° c.에 저장
  5. 소화 효율을 결정 합니다.
    1. 단계 6.2, 6.4에서 15 µ L 샘플 10 mM Tris HCl pH 7.5의 82.5 µ L를 추가 합니다. 2.5 µ L의 성분 K (20 mg/mL)을 추가 하 고 65 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어
    2. 페 놀-클로 프롬의 100 µ L을 추가 하 고 잔여 단백질 오염 제거를 반전 하 여 적극적으로 혼합. 5 분, 실 온에서 16,100 x g 원심 분리기.
    3. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송. 3 M 나트륨 아세테이트 pH 5.2, 20 mg/mL glycogen의 1 µ L 및 100% 에탄올 (EtOH)의 300 µ L의 6.66 µ L를 추가 합니다. 반전 및 장소 1 h-80 ° C에 의해 부드럽게 혼합.
    4. 4 ° c.에 16,100 x g 에서 20 분 동안 원심 분리기 제거는 상쾌한, 실시간에서 16,100 x g 에서 70 %EtOH, 그리고 5 분 동안 원심 분리기의 500 µ L를 추가
    5. 상쾌한을 제거 하 고 건조 한 실 온에서 펠 릿 2 분 Resuspend 펠 릿 nuclease 없는 H의 50 µ L에 대 한2o.
    6. ∆∆Ct 메서드를 사용 하 여 정량13,14 소화 효율을 결정 합니다. 설정 하지 제한 사이트 측면 뇌관을 사용 하 여 (단계 2.2.2 참조) 정규화 컨트롤. 진행 하는 경우 소화 효율 > 85%. 그렇지 않으면, 작은 셀 고 반복 단계 5.2-6.5, 단계 5.3에 65 ° C에 외피를 생략.

7. 첫 결 찰

  1. 65 ° c.에 20 분을 배양 하 여 제한 효소 열 비활성화 또는 효소 비활성화 열 수 없으면, 페 놀-클로 프롬을 추출 하 고 에탄올 침전 샘플.
    참고: 일부 제한 효소에 대 한 권장 비활성화 고온 염색 질, 단백질 변성 그리고이 부정적인 샘플 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한,로 샘플 손실에 페 놀: 클로 프롬 추출, 적합 하지 않습니다.
  2. 50 mL 원뿔 튜브에 전송 하 고 nuclease 없는 H의 6 mL을 추가2O, 700 µ L 리가 버퍼 (660 mM Tris HCl pH 7.5, 50 m m 염화 마그네슘 (MgCl2), 10 m m dithiothreitol (DTT) 10mm 아데노신 3 인산 염 (ATP)), x 10의 그리고 50 U T4 DNA 리가. 소용돌이 의해 부드럽게 혼합 하 고 하룻밤 16 ° c.에 품 어
  3. '결 찰 컨트롤로' 샘플의 100 µ L 약 수를 제거 합니다.
  4. 결 찰 효율성을 확인 합니다.
    1. 가수분해 K (20 mg/mL)의 2.5 µ L을 추가 하 고 65 ° c.에 1 시간을 품 어
    2. 적극적으로 전도 의해 페 놀-클로 프롬 및 혼합 100 µ L를 추가 합니다. 5 분, 16,100 x g 실시간에 대 한 원심 분리기
    3. 새로운 튜브에 수성 단계를 전송. 3 M 나트륨 아세테이트 pH 5.2, 1 µ L의 glycogen, 그리고 100%의 300 µ L의 6.66 µ L 추가 EtOH. 역전과 장소-80 ° C 1 시간 약에 의해 부드럽게 혼합.
    4. 4 ° c.에 16,100 x g 에서 20 분 동안 원심 분리기 제거는 상쾌한, 4 ° c.에 16,100 x g 에서 70 %EtOH, 그리고 5 분 동안 원심 분리기의 500 µ L를 추가
    5. 상쾌한을 제거 하 고 건조 한 실 온에서 펠 릿. 20 µ L의 물에 펠 릿을 resuspend 및 0.6 %agarose 젤 단계 6.5에서 "소화 컨트롤" 옆에 로드 합니다.
      참고: 잘 합자 샘플 비교적 꽉, 높은 분자량 밴드 (그림 3)으로 표시 됩니다.
    6. 결 찰 충분 한 경우 8 단계를 진행 합니다. 그렇지 않으면, 추가 신선한 ATP (1mm 최종 농도)와 새로운 리가; 16 ° C에서 밤새 품 어 고 7.3-7.4 단계를 반복 합니다.

8. 반전 Cross-linking 고 Chromatin 격리

  1. 가수분해 K (20 mg/mL)의 15 µ L을 추가 하 고 상호 링크를 65 ° C에서 밤새 품 어.
  2. 30 µ L의 RNase A (10 mg/mL)을 추가 하 고 37 ° c.에 45 분을 품 어
  3. 적극적으로 전도 의해 페 놀-클로 프롬 및 믹스의 7 mL를 추가 합니다. 분리기 15 분, 실시간에 3300 x g
  4. 새로운 50 mL 튜브에 수성 단계 전송 및 nuclease 없는 H의 7.5 mL를 추가2O (DTT는 DNA와 침전 리가 버퍼에 희석), 3m 나트륨 아세테이트 pH 5.6, 글 리 코겐 (20 mg/mL)의 7 µ L의 1 mL 그리고 100%의 35 mL EtOH. 혼합 하 고 1 시간-80 ° C에서 품 어.
  5. 원심 분리기 20 분, 4 ° c.에 3900 x g 제거는 상쾌한 (펠 릿 볼 하기 어려울 수 있습니다), 얼음 처럼 차가운 70의 10 mL와 펠 릿을 세척 %EtOH, 그리고 원심 분리기 15 분, 4 ° c.에 3300 x g
  6. 제거는 상쾌한 고 짧게 실시간 디졸브 37 ° c.에서 10 mM Tris HCl pH 7.5의 150 µ L에서 펠 릿에서 펠 릿 건조 -20 ° C에서 저장 하거나 9 단계를 계속 합니다.

9. 두 번째 제한 소화: 트리밍 동그라미

참고:이 단계는 다운스트림 증폭 단계에서 PCR 바이어스로 인해 작은 캡처된 조각의 overrepresentation 최소화 하기 위해 작은 동그라미를 만듭니다.

  1. 단계 8.6에서 샘플 추가 제한 효소 버퍼 (제조 업체에 의해 지정 된), x 10의 50 µ L 300 µ L nuclease 무료 h2O, 그리고 50 U 제한 효소 RE2. 선택한 효소에 대 한 적절 한 온도에서 밤새 품 어.
  2. "소화 컨트롤로" 샘플의 15 µ L 약 수를 제거 합니다. 단계 6.5에서 설명 된 대로 소화 효율을 결정 합니다.

10. 두 번째 결 찰 및 DNA 정제

  1. 제조업체에서 권장 하는 대로 제한 효소 비활성화. 효소는 열 비활성화 될 수 없습니다, 열 기반 정화 키트를 사용 하 여 효소를 제거 합니다.
    참고:이 샘플의 손실에 있는 결과로 열 정화 적합 하지 않습니다.
  2. 50 mL 튜브에 샘플을 전송 하 고 12.1 mL nuclease 무료 H의 추가2O, 결 찰 버퍼 (660 mM Tris HCl, pH 7.5; 50 m m MgCl2, 10 mM DTT, 10mm ATP), x 10의 1.4 mL 및 100 U T4 DNA 리가. 16 ° c.에서 밤새 품 어
  3. 추가 3 M 나트륨 아세테이트 pH 5.6, nuclease 무료 233 µ L의 467 µ L H2O, 7 µ L glycogen (20 mg/mL), 및 35 mL 100 %EtOH. 잘 혼합 하 고-80 ° C 1 h에서 품 어.
  4. 분리기 45 분, 4 ° c.에 3900 x g 제거는 상쾌한, 차가운 70의 10 mL을 추가 %EtOH, 그리고 원심 분리기 15 분, 4 ° c.에 3300 x g
  5. 상쾌한을 제거 하 고 잠시 실 온에서 펠 릿 건조. 10 mM Tris HCl pH 7.5의 150 µ L을 추가 하 고 펠 릿을 해산 하기 위해 37 ° C에서 품 어.
  6. 실리 카 열 기반 PCR 정화 키트, 제조업체의 지침에 따라 샘플을 정화. 3 x 106 셀, 셀의 초기 번호에 따라 당 1 열을 사용 합니다. 10 mM Tris HCl, pH 7.5의 50 µ L 열 elute 고 샘플 수영장.
  7. Fluorimetry 또는 분 광 광도 법 260에는 흡 광도 사용 하 여 농도 측정 nm. 4 C 템플릿은 이제 반전 PCR에 대 한 준비입니다. -20 ° C에서 저장 하거나 직접 11 단계를 진행 합니다.

11. PCR 증폭 역 PCR에 의해 알 수 없는 상호 작용 시퀀스

  1. 12.5, 25, 50, 그리고 100 ng 4 C 서식 파일의 서식 파일 희석을 사용 하 여 PCR을 수행 하 여 증폭의 선형 범위를 결정 합니다. 원하는 경우, 직접 제품을 비교 하 여 일반적인 증폭 식별을 병렬로 gDNA에서 증폭. PCR 반응 94 ° C에서 2 분;에 대 한 초기 변성을 사용 하 여 실행 94 ° C 10에서 변성 단계 구성 된 30 사이클 s, 1 분, 55 ℃에서 어 닐 링 단계 및 3 분;에 대 한 68 ° C에서 확장 단계 그리고 5 분 동안 68 ° C에서 최종 확장.
  2. 선형 증폭을 확인 하 고 (그림 4) 템플릿 품질을 평가 하는 1.5 %agarose 젤에 PCR 제품 각 15 µ L을 구분 합니다. 4 C 템플릿에서 증폭 낮은 DNA 농도 및 더 높은 농도에서 얼룩에 개별 밴딩 항복 한다. 얼룩의 증폭된 4 C ligations의 증가 복합성을 나타냅니다.
  3. 생성 역 PCR 제품의 양과 품질에 만족 때 설정 한 정량 주기 증폭에 사용할 최적의 수를 확인할:
    1. 반응 SYBR와를 이용한 염료 반응 혼합물을 사용 하 여 표 2에 포함 된 설정 합니다. 증폭 단계 11.2, 반응 당 서식 파일의 사용 100 ng에서에서 높은 농도에 선형입니다.
      참고:를 이용한 추가 잘에서 우물과 사이클을 형광 신호의 정상화를 촉진 한다.
    2. 94 ° C에서 2 분;에 대 한 초기 변성을 사용 하 여 PCR 반응 실행 40 주기 10 94 ° C에서 변성 단계 구성 된 s, 1 분, 55 ℃에서 어 닐 링 단계 및 3 분;에 대 한 68 ° C에서 확장 단계 그리고 5 분 동안 68 ° C에서 최종 확장.
    3. 증폭 플롯을 사용 하 여 반응의 피크 (끝점) 형광을 확인 합니다. 반응 피크 형광 (그림 5)의 25%에 도달 하는 주기를 결정 합니다.
      참고: 이것은 사이클 (참조 단계 11.4) 4 C 라이브러리를 증폭 하는 데 사용 될 수입니다.
  4. 4 C 템플릿에서 미끼를 출혈 하는 알 수 없는 순서를 증폭 반전 PCR 표 3을 설정 합니다. 실행 하기 전에 50 µ L의 16 반응으로 나눕니다. 94 ° C에서 2 분 및 10 94 ° C에서 변성 단계 구성 된 주기는 초기 변성을 사용 하 여 PCR 반응 실행 s, 1 분, 55 ° C에 단계는 어 닐 링 그리고 3 분 68 ° C에서 확장 단계 단계 11.3.3에서에서 결정 하는 사이클의 수를 사용.
  5. 수집 하 고 반응을 수영장. 실리 카 열 기반 PCR 정화 키트를 사용 하 여 정화. 16 반응 당 적어도 2 열을 사용 합니다. 순화 된 PCR 제품 풀.
  6. 분 광 광도 법에 의해 샘플 크기와 순도 확인 합니다. 전형적인 수확량은 10과 20 μ g A260/A280 ~ 1.85와 사이입니다. 흡수 비율이 최적의 경우 다시 시퀀싱 하는 동안 문제를 방지 하기 위하여 정화.
  7. 300을 구분 하 여 라이브러리의 복잡성을 평가 1.5 %agarose 젤에 PCR 제품을 정화의 ng.
    참고: 증폭된 제품을 단계 11.2에서 유사 해야 합니다.

12. 세 번째 제한 소화: 미끼 시퀀스에서 트림

참고:이 단계는 다운스트림 시퀀싱 단계에서 정보 캡처 시퀀스를 최대화 하기 위해 역 PCR 제품에서 비 유익한 미끼 시퀀스를 제거 합니다. 소화 효율을 모니터링 하려면 "다이제스트 모니터"15 는 동일한 DNA와 효소 농도 사용 하 여 병렬로 소화 된다. RE1 및 RE2 동시 소화에 대 한 호환 되지 않는, 경우 예를 들어 다른 최적의 부 화 온도 또는 반응 버퍼가 수행 되어야 합니다 (이것은 이상적인) 순차 다이제스트로.

  1. 다시 다이제스트 모니터를 얻을 하 고 50 µ L 반응에서 소화를 테스트.
    참고: 이것은 다시 사이트를 포함 하는 (예를 들어: 플라스 미드, PCR amplicon, 또는 합성 DNA) dsDNA의 분자 이다. 유일한 요구 사항은 agarose 젤에 포경된 모니터에서 컷을 구분 하기 쉽게 되어야 합니다. 최적화 다시 모니터 질량과 효소 농도 필요한 경우.
  2. 그리고, 병렬, 단계 12.1에서 다시 모니터 단계 11.6에서 정화 역 PCR 제품의 다이제스트 1 µ g.
    참고: 보육 시간, 뿐만 아니라 DNA와 효소 농도 이어야 한다 단계 12.1 모두 역 PCR 제품에서 테스트 다이제스트 및 모니터 다이제스트. 필요에 따라 반응 볼륨을 조정 합니다.
  3. 실행은 소화 모니터 다시 예상된 조각에 대 한 적절 한 농도의 agarose 젤에. 소화 간주 됩니다 충분 한 때 < DNA의 10% 남아 포경된 (그림 6).
  4. 실리 카 열 기반 DNA 정제 키트에 소화 역 PCR 제품을 정화. 순차적 다이제스트 필요한 경우, 두 번째 효소와 12.1-12.4 단계 반복 하십시오.

13입니다. 도서관 시퀀싱의 준비

  1. 각각 다음 세대 시퀀싱 플랫폼 호환 어댑터 선
    1. 그는 oligos 어 닐 링, 후 각 다시 어댑터는 각각 1 면 돌출 각 RE1 및 RE2 어댑터를 디자인 합니다.
      참고: 예를 들어 HindIII을 사용 하는 경우 단련된 어댑터 해야 포함 5' phosphorylated "AGCT" 오버행. 또는, 표준 T-오버행 어댑터 사용 하는 경우 끝-수리 및 A-꼬리 어댑터 결 찰 전에 도서관.
    2. 해당 어댑터 다시 oligos anneal 어 닐 링 버퍼 (10 mM Tris, pH 7.5, 50mm 나트륨 염화 물 (NaCl), 1 mM EDTA)에 oligos resuspend, 50 µ m, 95 ° c, 열 아데닌 수량에서 믹스와 25 ° c.를 천천히 냉각 허용
    3. 결 찰 반응을 수행 합니다. 리가 버퍼 x 1에는 총 5-에 10 배 어 금 니의 초과 단련된 어댑터 (단계 13.1.2, 각 다시 어댑터 사용에 대 한 50: 50 비율)으로 다시 소화 4 C 라이브러리를 혼합 하 고 6U DNA 리가 추가. 제조업체 지침에 따라 품 어.
    4. 낮은 차입 볼륨 실리 카 기반 열 키트를 사용 하 여 정화 하 여 초과 어댑터를 제거 합니다.
  2. 크기 선택 합니다.
    참고: 크기 선택 또한 구슬 기반 정리 키트를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 고 열 정화 후에는 것이 좋습니다.
    1. 따르기 이전 비 UV 얼룩을 추가 고해상도 agarose를 사용 하 여 2 %agarose 젤 캐스팅. 난방 동안 증발 때문 어떤 물 든 지 전과 후가 열 하 고 분실 된 질량을 복구 하는 물을 추가 병 또는 플라스 크의 무게에 의해 대체 됩니다 확인 하십시오.
    2. 샘플 사이 빈 레인을 떠나 젤에 어댑터 출혈 라이브러리를 실행 합니다.
    3. 해당 하는 깨끗 한 메스 또는 면도칼 블레이드를 사용 하 여 1 kb 크기 범위 150 혈압 젤 조각 삭제하시오
    4. 젤 젤 추출 키트를 사용 하 여에서 라이브러리를 정화. DNA의 복구에 GC 바이어스를 최소화 하기 위해 회전 실 온에서 젤 조각 분해.
  3. 표 4에서 반응 혼합물을 사용 하 여 정량 하 여 PCR 증폭에 대 한 사이클의 수를 결정 합니다. PCR 반응 98 ° C에서 2 분에 대 한 초기 변성을 사용 하 여 실행 하 고 10에 98 ° C에서 40 주기는 변성의 구성 단계 s, 1 분, 60 ℃에서 어 닐 링 단계 및 3 분 동안 72 ° C에서 확장 단계.
    참고:는 형광의 최대 25%에 도달 하는 주기는 주기 단계 11.3에서 라이브러리를 증폭 하는 데 사용 될 수 있습니다.
  4. 표 5에서 반응 혼합물을 사용 하 여 라이브러리를 증폭. PCR 반응 98 ° C에 2 분 및 10에 98 ° C에 변성 단계 구성 된 주기는 초기 변성을 사용 하 여 실행 s, 1 분, 60 ℃에서 어 닐 링 단계 및 3 분 동안 72 ° C에서 확장 단계. 각 라이브러리에 대해 사용할 수 확대 주기의 수 단계 13.3에서 결정 되었다.
  5. 정화는 낮은 차입 볼륨 실리 카 기반 열 키트를 사용 하 여 증폭 된 라이브러리.

14. 시퀀싱 및 시퀀싱 데이터의 분석

  1. Fluorimetric 분석 결과 사용 하 여 증폭 된 라이브러리의 농도 결정 합니다. 라이브러리 시퀀싱 (시퀀싱 서비스 또는 그들의 제안에 대 한 코어 확인)에 대 한 적절 한 농도를 희석.
  2. 미세 핵 산 분석 플랫폼을 사용 하 여 라이브러리의 품질을 결정 합니다.
    참고: 라이브러리의 크기 프로필에서 단계, 크기 선택 젤에 본을 반영 해야 합니다 및이 단계에서 결정 하는 샘플의 농도 시퀀싱에 사용 될 것 이다.
  3. 수영장 샘플 당 적어도 3 백만 읽기 (적어도 50 bp 읽기; 단일 [1 X 50] 또는 짝된 끝 [2 X 50])를 라이브러리 색인. 높은-품질 라이브러리 적어도 1 백만 매핑된9, 읽지만 매핑 중 일부 마찰 있을 것입니다 필요 합니다. 예를 들어 레인 당 약 150 백만 읽기를 생성 하는 시퀀싱 플랫폼 단일 차선에 최대 50 샘플을 수용할 수 있습니다.

15입니다. 시퀀스 데이터 분석

  1. 그들의 적절 한 샘플을 읽기를 지정 하려면 인덱스 시퀀스를 사용 하 여 데이터를 demultiplex.
    주: 그들의 숙련도 따라 사용자가 수행할 수 있습니다 기본 명령 라인 인터페이스 또는 양자 택일로, 사용자, 웹 기반 은 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)16 를 사용 하 여 원시 FASTA/FASTQ 시퀀스 파일의 다운스트림 전산 분석 .
  2. 어댑터 시퀀스 및 미끼 시퀀스 12 단계에서에서 소화 다시 불완전에서 발생 하는 예를 들어, 빠른 X 툴킷 (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)를 사용 하 여 정돈 하십시오.
  3. 관심 적절 한 게놈을 역다중화 읽기 지도 (예., UCSC mm10, hg19) 버 로우-윌 러 Aligner (BWA)17 또는 SAM의 결과로 다른 맞춤 소프트웨어를 사용 하 여 출력 파일. 필요한 경우 BAM samtools18 통해 SAM 파일 변환 (단계 15.4 참조).
  4. Basic4Cseq19, 4 C-ker20,21FourCSeq 또는 fourSig22 등 4 C-seq 분석 파이프라인을 사용 하 여 데이터를 분석 하 고 상호 작용을 식별.
    참고: 데이터 분석 및 그 품질의 평가 선택한 소프트웨어 패키지의 안내서에 따라 실시 되어야 한다. 패키지의 언급이 어디를 제외 하 고 침대 출력 파일을 생성 합니다. 간단히, Basic4CSeq19 입력된 SAM 파일 (단계 15.3)를 사용 하 여 (txt, tiff, 침대, 및 발 출력 파일) 상호 작용을 시각화 하 고 반 드 Werken 외에 명시 된 기준에 따라 데이터의 품질을 평가 합니다. 9 4 C-ker20 (입력 FASTQ, 단계 15.2 손질) 및 FourCSeq21 (입력된 BAM, 단계 15.3) 식별 조건 사이 차동 상호 작용. fourSig22 (입력된 SAM) 또한 중요 한 상호 작용을 식별 하 고 그 재현 될 것을 우선. 게놈 규제 농축의 주석 도구 (대)23또는 인코딩 데이터 세트와 통합 도구 4 C-이 의해 발견 하는 상호 작용의 생물 학적 기능을 예측 하에 사용할 수 있습니다.

결과

기본 인간 keratinocytes 2-3 폐기 신생아 속하고에서 고립 되었다, 풀, 그리고 KSFM 보충에 교양 30 µ g/mL와 소 뇌 하 수 체 추출 물 0.26 ng/mL 재조합 인간 표 피 성장 인자, 그리고 0.09 m m 칼슘 염화 물 (CaCl2 ) 37 ° c, 5% 이산화탄소. 셀 두 플라스 크로 분할 했다 그리고 한 플라스 크 확산에서 72 h. 107 셀 각 1.2 m m의 최종 농도에 CaCl2 의 추가 의해 분화 되었다 ?...

토론

4 C 결과 공개 이전에 알려지지 않은 규제 요소를 식별할 수 있는 chromatin 상호 작용 및/또는 대상 유전자 특정 생물 학적 컨텍스트24,,2526중요 한 가능성이 있습니다. 그러나, 기술적인 장애물은이 실험에서 얻은 데이터를 제한할 수 있습니다. 4 C 프로토콜에 서식 파일의 이상 증폭에서 형태소 분석 PCR 바이어스가 높습니다. 이 ?...

공개

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

감사의 말

이 작품은 NIAMS (R01AR065523)에 의해 지원 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
HindIIINEBR0104S
CviQINEBR0639S
DNA oligonucleotide primersIDTTo be designed by the reader
50 mL conical centrifuge tubesFisher Scientific06-443-19
1.7 mL microcentrifuge tubesMidSciAVSS1700
Phosphate buffered salineThermo Fisher14190-136
Formaldehyde, methanol freeElectron Microscopy Sciences15710
NutatorVWR15172-203
GlycineJT Baker4059-00
Benchtop centrifuge
Refrigerated microcentrifuge
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichED2SS
20% SDS solutionSigma-Aldrich05030
Trypan BlueThermo Fisher15250061
Glass slidesFisher Scientific12-550-143
Cover slipsVWR16004-094
Light microscope
Triton X-100Alfa AesarA16046
Shaking heat block
2 M Tris-HClQuality Biological351-048-101
Proteinase KNEBP8107S
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)Sigma-AldrichP2069
Sodium acetateSigma-AldrichM5661
20 mg/mL glycogenThermo FisherR0561
EthanolFisher Scientific04-355-223
Nuclease-free waterFisher ScientificMT-46-000-CM
qPCR cyclerThermo Fisher4453536
qPCR platesThermo Fisher4309849
ThermocyclerThermo Fisher4375786
PCR strip tubesMidSciAVSST-FL
1 M Magnesium chlorideQuality Biological351-033-721
DithiothreotolSigma-Aldrich43815
Adenosine triphosphateSigma-AldrichA2383
T4 DNA LigaseNEBM0202S
AgaroseSigma-AldrichA6013
RNase AThermo FisherEN0531
Qiaquick PCR purification kitQiagen28104
MinElute PCR Purification kitQiagen28004
Spectrophotometer
Expand Long Template PCR SystemSigma-Aldrich11681834001
dNTP mixThermo FisherR0191
SYBR Green ISigma-AldrichS9430
ROXBioRad172-5858
Sodium chlorideSigma-AldrichS5886
End-It DNA End-Repair KitLucigenER0720
LigaFast Rapid DNA Ligation SystemPromegaM8221
SYBR SafeThermo FisherS33102
Taq PolymeraseNEBM0267S
UltraSieve AgaroseIBI ScientificIB70054
Qiaquick Gel Extraction KitQiagen28704

참고문헌

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