Vorbereitung einer qualitativ hochwertigen Primärzelle Kultur von Fisch Hypophysen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Hypophyse primären Zellkulturen von Medaka (Oryzias Latipes) zu erhalten. Die optimierte Bedingungen in diesem Protokoll nehmen wichtige Parameter wie Temperatur, Osmolalität und pH berücksichtigt durch die Nachahmung der physiologischen Bedingungen der Fische, wodurch es physiologisch mehr aussagekräftige Ergebnisse.

Zusammenfassung

Primärzelle Kultur ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das häufig von Wissenschaftlern verwendet, um zellulare Eigenschaften und Mechanismen der isolierten Zellen in einer kontrollierten Umgebung zu studieren. Trotz der großen Unterschiede in der Physiologie zwischen Säugetieren und Fischen Primärzelle Kultur Protokolle von den Fischen oft Säugetier-Kulturbedingungen, oft mit nur geringfügigen Änderungen basieren. Die ökologischen Unterschiede beeinflussen nicht nur die Körpertemperatur, sondern auch Blutserum Parameter wie Osmolalität, pH-Wert und Pufferkapazität pH. Da Zellkulturmedien und ähnlich funktionierende Lösungen imitieren Merkmale der extrazellulären Flüssigkeit bzw. Blutserum sollen, bei denen eine Zelle angepasst ist, ist es wichtig, dass diese Parameter speziell auf das betreffende Tier angepasst werden.

Das aktuelle Protokoll beschreibt optimierte Primärkultur Bedingungen für Medaka (Oryzias Latipes). Das Protokoll bietet detaillierte Schritte auf, wie zu isolieren und halten gesund dissoziiert Hypophyse Zellen für mehr als eine Woche und umfasst folgende Schritte: 1. gefunden die Einstellung der Osmolalität auf die Werte im Blutplasma Medaka, 2. die Anpassung der Inkubationstemperatur auf normalen Medaka Temperatur (hier in der Aquarium-Anlage), und 3. die Einstellung des pH und Bicarbonat Puffer zu Werten vergleichbar mit anderen Fischarten Leben bei ähnlichen Temperaturen. Die Ergebnisse, die mit dem beschriebenen Protokoll physiologisch sinnvolle Ergebnisse für Medaka fördern und von Wissenschaftlern machen primären Zellkulturen von anderen nicht-Säugetier-Arten als Nachschlagewerk verwendet werden können.

Einleitung

Zellkultur ist eines der wichtigsten Instrumente für die molekularbiologische Forschung, bietet eine ausgezeichnete Modellsystem für verschiedene biologische Fragen von normalen zellulären Physiologie bis hin zu Drogen-Screening und in der Karzinogenese¹. Primärzellen, direkt aus dem tierischen Gewebe mit enzymatischen und/oder mechanischen Methoden isoliert werden oft als mehr biologisch relevante als Zell-Linien wie die biologische Reaktion auf die in-Vivo -Situation näher sein kann. Protokolle für die Zubereitung von primären Zellkulturen sollten optimiert werden, für jede Spezies und Zelle Interesse um imitieren die Eigenschaften, die eine Zelle angepasst ist, und physiologisch sinnvolle Ergebnisse zu erzielen.

Zahlreiche Protokolle beschreiben Kulturbedingungen für Säugetier-Zelle Systeme, während ähnliche Protokolle beschreiben Primärkultur Bedingungen für Fisch-Zellen im Vergleich eher knapp sind. Zellen sind anfällig für schnelle Änderungen in Temperatur, pH-Wert und Osmolalität und sind besonders empfindlich bei der Dissoziation. Kommerzielle Salzlösungen und Kulturmedien verwendet für Säugetier-Zelle Kulturen sind nicht optimal für teleost Fische, vor allem in Bezug auf die pH-Puffer-Systeme und Osmolalität. Deshalb ist es wichtig, zu messen und passen die Lösungen an physiologisch relevanten Ebenen dieser Parameter in den Arten von Interesse.

Hypophyse Primärkulturen von mehreren teleost Fischarten, darunter Karpfen vorgenommen wurden (Cyprinus Carpio)^2,3, Rasen Karpfen (Ctenopharyngodon Idella)⁴, Goldfisch (Carassius Auratus )⁵, Regenbogenforelle (Oncorhynchus Mykiss)⁶, Europäischer Aal (Anguilla Anguilla)⁷, Tilapia (Oreochromis Mossambicus)⁸, Zebrafisch (Danio Rerio)⁹, und Atlantischer Kabeljau (Gadus Morrhua)¹⁰. Neben der Anpassung der Inkubationstemperatur auf die Arten von Interesse, haben einige dieser Protokolle der Zellen bei Säugetier-ähnlichen Bedingungen inkubiert, die möglicherweise für die Arten von Interesse, mit einem pH-Wert von 7,2 bis 7,5 in eine feuchte Atmosphäre suboptimale mit 3-5 % CO₂. Darüber hinaus ist es unklar, ob die Osmolalität von Lösungen für die Zubereitung verschiedener diese primären Zellkulturen angepasst wurden und zwischen verschiedenen Lösungen stabil.

Das aktuelle Protokoll basiert auf früheren Arbeiten mit Primärkulturen von Atlantischer Kabeljau¹⁰ und besteht aus Anpassungen der Inkubationstemperatur, Osmolalität, pH-Wert und pH-Puffer-Systeme, einschließlich der Partialdruck des Kohlendioxids (pCO₂), um die Physiologie des Medaka (O. Latipes). Medaka ist ein klein (3 – 4 cm) Süßwasserfisch, ursprünglich aus Ostasien. Heutzutage dient es als ein Modell-Arten in vielen Forschungslabors auf der ganzen Welt, da es relativ einfach zu züchten und sehr widerstandsfähig gegen viele gemeinsame Fisch Krankheiten¹¹ist. Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung von Medaka als Vorbild, darunter eine Temperatur-Toleranz von 4 – 40 ° C¹¹, eine kurze Generationszeit, transparente Embryonen, ein Geschlecht-Bestimmung gen¹², und eine sequenzierte Genom¹³, sowie viele andere verfügbaren genetischen Ressourcen.

Die primäre Kulturbedingungen in diesem Protokoll werden optimiert, entsprechend der Temperatur von 26 ° C, die Medakas in der Fisch-Anlage gehalten werden. Darüber hinaus die Osmolalität von 320 mOsm/kg aus Atlantischer Kabeljau in Salzwasser bis 290 mOsm/kg für Medaka Leben im Süßwasser lebenden reduziert und steht im Einklang mit der normalen Osmolalität von Medaka Plasma¹⁴. Im Vergleich dazu ist die typische Osmolalität von Säugetieren Plasma im Bereich von 275-295 mOsm¹⁵. Fische leben in einer Vielzahl von Temperaturen und haben Kiemen, die in direktem Kontakt mit Wasser, so dass der pH und Puffer Kapazität des Blutes und der extrazellulären Flüssigkeit in den Fischen unterscheiden sich von denen bei Säugetieren sind. Säugetier-Kultur Medien umfassen in der Regel Puffersysteme, die einen pH-Wert von etwa 7,4 führen, wenn die Medien sind zu einem standard-Atmosphäre von 5 % CO₂ in befeuchtete Luft bei 37 ° c equilibriert Der pH-Wert ist temperaturabhängig und der Wert für pH-neutral (im Wasser) steigt mit abnehmender Temperatur¹⁶. Typische teleost Fische Plasma pH-Bereiche von 7,7 bis 7,9¹⁷. Die Optimierung dieses Protokolls enthalten eine Reduzierung von pH 7,85 für Kabeljau auf pH 7,75 für Medaka auf 26 ° C gehalten, durch die Erhöhung der CO₂ von 0,5 % bis 1 % bei 12 ° C gehalten.

Darüber hinaus unterscheidet sich die Bicarbonat-Pufferkapazität in Fischen und Säugetieren. CO₂ ist leicht über die Kiemen bei Fischen ausgetauscht und die pCO₂ im Wasser ist nur ein kleiner Bruchteil des pCO₂ in der Lunge-¹⁸. Entweder die Temperatur oder die pCO₂ ändert pH und Puffer des Mediums ändern. Weder den pH-Wert noch die pCO₂ empfohlen für die Inkubation von Säugerzellen deshalb optimal für Fisch-Zellen, und daher sollte die Nährmedien mit Puffersysteme, die physiologisch relevanten Werte für Fische optimiert werden und die bestimmte Arten von Interesse. Dieses Protokoll beschreibt die primären Zellkulturen von Medaka Hypophysen vorzubereiten und umfassen Anpassungen der Inkubation Osmolalität, Temperatur, pH-Wert und pH Puffersystem, neben anderen wichtigen Parameter, die bei der Vorbereitung der Primärzelle Kulturen von nicht-Säugetier-Arten.

Protokoll

Die Tierversuche durchgeführt in dieser Studie wurden von der norwegischen Universität für Biowissenschaften, folgende Richtlinien für die Pflege und das Wohlergehen der Versuchstiere genehmigt.

1. Vorbereitung der Lösungen

1. Kalibrieren Sie die XR und pH Meter-Instrumente nach den Anweisungen des Herstellers um korrekte Messungen zu gewährleisten.
2. Bereiten Sie 500 mL Ca^{2 +}- und Mg^{2 +}-freie Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (dPBS), Einstellung des pH-Werts auf 7,75 (Schritt 1.2.1) und der Osmolalität auf 290 mOsm/kg (Schritt 1.2.2) vor einer Sterilfiltration (Schritt 1.2.3).
   1. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,75 mit einem kalibrierten pH-Meter indem Sie sorgfältig Tropfen einer 1 M NaOH-Lösung die Lösung sorgfältig rühren.
   2. Messen Sie die Osmolalität der Lösung mit einem kalibrierten XR zu und berechnen Sie die Höhe der Mannit musste die Osmolalität auf 290 mOsm/kg zu erhöhen. Fügen Sie die erforderliche Menge an Mannit und Messen Sie dann die Osmolalität der Lösung wieder auf die richtige Einstellung zu gewährleisten.
      Hinweis: Die Höhe der Mannit benötigt richtet sich nach der Osmolalität gemessen, die in der Regel zwischen verschiedenen Chargen variiert. Ein Molekül Mannit entspricht 1 osmotischen Teilchen.
   3. Steril-Filter die dPBS Lösung mit einem 0,2 µm-Filter.
      Hinweis: Die Lösung kann bei 4 ° C für mindestens 3 Monate aufbewahrt werden.
3. Bereiten Sie 500 mL Kulturmedium Leibovitz (L-15) ohne L-Glutamin und Bikarbonat und ergänzen Sie es mit 10 mM Nahco3₃ (Schritt 1.3.1), 4,5 mM Glukose (Schritt 1.3.2) und 2 mM im Handel erhältlichen Glutamin (Schritt 1.3.3). Passen Sie die Lösung für 290 mOsm/kg (Schritt 1.3.4), Sterilfilter es (Schritt 1.3.5) und 2,5 mL einer Penicillin-Streptomycin-Lösung (Schritt 1.3.6).
   Hinweis: Die Lösung kann für mindestens 4 Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden.
   1. Fügen Sie 420 mg Nahco3₃ pro 500 mL Kulturmedium eine 10 mM-Lösung zu erreichen.
   2. Fügen Sie 405 mg Glukose pro 500 mL Kulturmedium Herbeiführung eine 4,5 mM-Lösung hinzu.
   3. Fügen Sie 100 X Lager einer Glutamin-Lösung 5 mL in 500 mL Kulturmedium eine 2 mM-Lösung zu erreichen. Rühren Sie, bis alle gelösten Stoffen gelöst werden.
   4. Passen Sie die Lösung auf 290 mOsm/kg mit Mannit mit einer XR (wie in Schritt 1.2.2 ausgeführt).
   5. Führen Sie eine sterile Filtration des L-15 Mediums mit einem 0,2 µm-Filter.
   6. Fügen Sie nach der Sterilfiltration 2,5 mL einer Penicillin-Streptomycin-Lösung, entsprechend 50 U/mL Penicillin und 50 µg/mL Streptomycin.
4. Bereiten Sie 50 mL einer Trypsin-Lösung mit 1 mg/mL (0,1 %)-Trypsin-Typ II-S in der modifizierten dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) aufgelöst. Aliquote von 2 mL in sterilen Kunststoffrohre und speichern Sie diese bei-20 ° C bis zur Verwendung.
   Hinweis: Aliquote von 2 mL können bei-20 ° C für mindestens 3 Monate gespeichert werden.
5. Bereiten Sie 50 mL einer Trypsin-Inhibitor-Lösung mit 1 mg/mL (0,1 %) Trypsin Inhibitor Typ I-S und ergänzen Sie es mit 2 µg/mL DNase, die ich in der modifizierten dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) aufgelöst. Aliquote von 2 mL in sterilen Kunststoffrohre und speichern Sie diese bei-20 ° C bis zur Verwendung.
   Hinweis: Aliquote von 2 mL können bei-20 ° C für mindestens 3 Monate gespeichert werden.

2. Vorbereitung der Ausrüstung

1. Bereiten Sie glaspipetten durch Feuer Polieren der Tipp für die Zelle Dissoziation vor. Tipps mit 2 verschiedenen Größenklassen zu machen (eine mittlere Öffnung von 0,6-0,8 µm und eine kleine Öffnung von 0,4 – 0,6 µm) durch das Spiel mit der Zeit und den Abstand von der Flamme und drehen Sie gleichzeitig die Pipette. Ablegen der glaspipetten in einem sauberen Behälter und Autoklaven (mit der solid-Modus bei 105 ° C für 45 min.).
2. Bereiten Sie eine Styroporbox mit Eis.
3. Bereiten Sie ein Kunststoffrohr mit 1,5 mL veränderte dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) übertragen die Hypophysen, während der Präparation und halten sie auf dem Eis.
4. Bereiten Sie eine 15 mL-Tube mit 10 mL der modifizierten dPBS (vorbereitet in Schritt 1.2) und lassen Sie ihn auf Eis, bis die Zelle Dissoziation.
5. Frisch bereiten Sie zu oder tauen Sie Aliquote des Trypsin und Trypsin-Inhibitor-Lösungen (vorbereitet in Schritten 1.4 und 1.5 auf) und halten sie auf dem Eis bis zur Verwendung.
6. 26 ° C im Wasserbad vor Beginn der Dissektion damit das Wasser die gewünschte Temperatur vor der chemischen Dissoziation der Hypophysen erreichen soll.
7. Reinigen Sie alle Dissektion Werkzeuge mit 70 % Ethanol, vor, während und nach dem Gebrauch, einschließlich feine Pinzette für die Zerlegung und feinen Nadeln und eine Wachs-Platte verwenden, um die Fische zu fixieren. Verwenden Sie saubere Handschuhe (ändern und häufig reinigen) während des gesamten Verfahrens um eine mögliche Verschmutzung der Zellen zu vermeiden.

(3) die Hypophyse Dissektion und Zelle Dissoziation

1. Einschläfern der Fisch durch Eintauchen in Slush Eis (0 ° C). Lassen Sie den Fisch in den Matsch Eis mindestens 1 min. um eine irreversible hypothermen Schock zu gewährleisten.
   Hinweis: Immobilisierung und Gleichgewicht Verlust wird nach wenigen Sekunden auftreten. Stellen Sie sicher, der Fisch ist komplett in das Eis Wasser getaucht und liegt nicht auf dem Eis, da Letzteres zum ersticken führt und potenzielle Haut, anstatt einen schnellen und humane hypothermen Schock brennt.
2. Schnell übertragen Sie die Fische in einem Netz auf einer Wachs-Platte unter dem Mikroskop Dissektion und zerstören Sie die Wirbelsäule durch eine Nadel Punch durch den Hals.
3. Heften Sie den Kopf des Fisches, die Wachs-Platte mit feinen Nadeln, durch eine Nadel in der Front (über den Mund) und eine auf jeder Seite des Kopfes (hinter dem Gehirn) um den Kopf vor der Präparation zu stabilisieren.
4. Sehen Sie die Fische unter dem Mikroskop Dissektion und vorsichtig abkratzen der Schuppen auf der Oberseite des Kopfes mit feinen Pinzette mit abgewinkelter Spitze.
5. Sorgfältig führen Sie die abgewinkelte Spitze der feinen Zange unter die Haut von der Seite des Kopfes und entfernen Sie der Schädel-Dach, indem Sie langsam die Zange in die Richtung des Mundes, halten Sie einen festen Griff um die Zange umschließen das Schädel-Dach.
6. Abschneiden des Rückenmarks komplett mit Pinzette mit abgewinkelter Spitze.
   Hinweis: Es ist ein wichtiger Faktor, so arbeiten effizient und genau die Zeit begrenzen verbrachte aus der Dissektion der Hypophysen bis die Zellen in der Schale überzogen sind. Nach einiger Übung Hypophyse Dissektion dauert ca. 2 – 3 min. pro Fisch, von denen nur rund 10 s sind notwendig, um die Hypophyse zu holen, wenn das Gehirn bereits ausgesetzt ist.
7. Drehen Sie sorgfältig das Gehirn in Richtung der Mündung zu entlarven die Hypophyse und mit sauberen Pinzette mit einer geraden Spitze zu sezieren. Die Hypophyse auf ein Kunststoffrohr mit 1,5 mL geändert dPBS übertragen (für Details, siehe Schritt 2.3) auf Eis gelegt. Überprüfen Sie die Spitze der Zange unter die Lupe genommen, um sicherzustellen, dass die Hypophyse erfolgreich, um das Rohr hinzugefügt wird und nichts auf der Zange bleibt.
   Hinweis: Sezieren Sie soviele Hypophysen Bedarf, abhängig von der Anzahl der Kultur Gerichte, die gleichzeitig zubereitet werden. Als Faustregel gilt berechnen Sie mindestens 10 Hypophysen von ausgewachsenen Fischen pro Schale, eine entsprechende Dichte der Zellen (die von der nachgeschalteten Anwendung abhängt).
8. Spin-down der Hypophysen in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur. Sorgfältig die dPBS mit einer Glaspipette zu entfernen und um zu vermeiden, entfernen alle Hypophysen kümmern.
9. Fügen Sie 1 mL Trypsin-Lösung (in Schritt 1.4 vorbereitet) zu waschen die Hypophysen, drehen sie sich in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s und der Großteil der Flüssigkeit mit einer Glaspipette vor dem Hinzufügen einer zusätzlichen 1 mL Trypsin-Lösung zu entfernen.
10. Inkubieren Sie das Rohr in einem Wasserbad bei 26 ° C für 30 min, vorzugsweise mit sanft schütteln, oder alternativ, streichen Sie dem Rohr ein paar Mal während der Inkubationszeit.
11. Spin-down der Hypophysen in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur und sicherstellen, dass alle Hypophysen an der Unterseite des Rohres befinden. Entfernen Sie die meisten der Trypsin-Lösung mit einer Glaspipette und 1 mL der Trypsin-Inhibitor-Lösung (vorbereitet in Schritt 1.5) um die Trypsin zu inaktivieren und waschen die Hypophysen.
12. Sammeln Sie die Hypophysen an der Unterseite des Rohres durch Drehen sie nach unten in eine Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die meisten der Flüssigkeit mit einer Glaspipette und 1 mL die Trypsin-Inhibitor-Lösung (in Schritt 1.5 vorbereitet). Legen Sie das Rohr auf einem Wasserbad bei 26 ° C für 20 min, vorzugsweise mit sanft schütteln, oder alternativ, streichen Sie dem Rohr ein paar Mal während der Inkubationszeit, die Trypsin zu inaktivieren.
13. Bereiten Sie eine 35 mm-Poly-d-Lysin-beschichtete Zelle Kulturschale mit einem zentralen Glasboden durch Hinzufügen von 2 mL des L-15 Mediums und lassen, dass für mindestens 10 min bei 26 ° C und mit 1 % CO₂ zu Bebrüten, so dass es die richtige Temperatur und pH-Wert erreichen kann, vor der galvanischen Zellen.
    Hinweis: Die Kulturschale Kunststoff Zelle kann auch verwendet werden. Der wesentliche Vorteil der Verwendung einer Gerichts mit einem zentralisierten Glasboden ist, dass der Bereich, wo die Zellen überzogen sind, kleiner, und daher weniger Hypophyse Zellen pro Gericht erforderlich sind. Einige downstream-Anwendungen erfordern möglicherweise auch ein Glasboden (d.h., einige bildgebenden Verfahren).
14. Die kühle Zentrifuge für die 15 mL-Tuben bis 4 ° C erlauben es, die gewünschte Temperatur zu erreichen, bevor Sie beginnen die mechanische Dissoziation festgelegt.
15. Sammeln die Hypophysen am unteren Ende der Röhre durch Drehen hinunter den Schlauch mit Trypsin Inhibitor Lösung (aus Schritt 3.11) in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur und sicherstellen, dass alle Hypophysen befinden sich am Boden des Röhrchens vor sorgfältig entfernen die meisten der Trypsin-Inhibitor-Lösung mit einer Glaspipette.
    Hinweis: Führen Sie alle folgenden Schritte des Protokolls in einer Laminar-Flow Bank (LAF) zertifiziert für Zelle Arbeit um eine Kontamination der Zellen zu vermeiden.
16. Die Hypophyse Gewebe Stücke 1 mL eiskaltes modifizierte dPBS (vorbereitet in Schritt 2.4) hinzu und saugen Sie sanft die Gewebe Stücke nach oben und unten (6 – 7 X) in eine feuerpolierte Glaspipette (in Schritt 2.1 vorbereitet).
    Hinweis: Die Temperatur ist ein wichtiger Aspekt, also halten Sie alle Lösungen bei 4 ° C. Ab diesem Zeitpunkt alle Schritte auf dem Eis wenn möglich.
17. Spin-down der Gewebe-Stücke in einer Tischplatte Zentrifuge für 1 – 2 s bei Raumtemperatur und übertragen Sie sorgfältig am oberen Ende des dPBS der dissoziierten Zellen (fast 1 mL), eine neue 15 mL Tube auf Eis gelegt. Vermeiden Sie die Pipette in Richtung zur Unterseite des Rohrs bewegen, wo sind die Gewebe Stücke übrig.
18. Wiederholen Sie Schritt 3.16 – 3.17, wehre die Zellen in 1 mL eiskaltes dPBS hintereinander, bis alle 10 mL des dPBS verwendet wird. Starten Sie mit einer Glaspipette mit einem mittleren Öffnung und Umstellung auf eine Glaspipette mit einer kleineren Öffnung gegen Ende (für die letzten 3 – 4 mL des dPBS hinzugefügt) die Dissoziation. Wenn es noch sichtbare Gewebe Stücke am Ende des Verfahrens Dissoziation, pipettieren, ca. 10 X auf die 2 letzten Schritte des dPBS zur Dissoziation zu erhöhen, und schließlich die verbleibende Gewebe Stücke hinterlassen. Aufschwemmen der Zellen vorsichtig und vermeiden Sie Luftblasen zu schaffen, als es Zellschäden verursachen, wenn die Zellen an der Oberfläche der Blasen befestigen.
    Hinweis: Dies ist ein kritischer Schritt dieses Protokolls und erfordert einige Übung, ein gutes Ergebnis zu erreichen.
19. Balancieren Sie das Rohr in die Zentrifuge (vorgekühlt auf 4 ° C) und Spin-down der Zellen bei 200 X g für 10 min bei 4 ° C. Achten Sie auf die Seite des Rohres zu markieren, wo die Zelle Pellet werden.
20. Entfernen Sie vorsichtig den Schlauch aus der Zentrifuge und übertragen Sie den Überstand mit einer Glaspipette sanft auf eine leere 15 mL-Kunststoff-Rohr direkt nach der Zentrifugation. Achten Sie darauf, entfernen die meisten des Überstands aber achten Sie darauf, nicht zu verlieren die kleinen Pellets (oft unsichtbar) Zelle.
21. Sorgfältig Aufschwemmen der Zelle Pellet in 50-100 µL L-15 Kulturmedium.
    Hinweis: Bei diesem Schritt ist es möglich, zählen die Zellen und/oder führen Sie einen Test der Lebensfähigkeit (z. B. eine Zelle zählen im Beisein von Trypan blau mit einem Hemocytometer), aber hüten Sie sich vor, dass mit einem Teil der Zellsuspension zu diesem Zweck die Ausbeute senken. Vermeiden Sie die Verwendung einer großen Aussetzung Volumen da es das Risiko einer Verbreitung außerhalb der Mitte der Schale Zellen erhöht wird.
22. Sorgfältig abtropfen der dissoziierten Zellen in der Mitte der Zelle Kulturschale mit 2 mL des L-15 Mediums (vorbereitet in Schritt 3.13). Lassen Sie die Zellen an der Unterseite der Schale für ca. 5 min zu versenken, bevor Sie verschieben sie in den Inkubator zu vermeiden, dass die Zellen außerhalb der versunkenen Teil der Glasboden zu verbreiten.
23. Inkubieren Sie die Schüssel bei 26 ° C und 1 % CO₂ erlauben die Zellen gründlich zu versenken und legen auf den Boden der Schale.
24. Schauen Sie nach 30 min sich die Zellen im Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie an der Kulturschale angeschlossen haben.
25. Weiterhin die Zellen bei 26 ° C und 1 % CO₂inkubieren.
26. Sorgfältig zu ändern die meisten (aber nicht alle) das Medium alle 3 – 4 Tage.
    Hinweis: Vermeiden Sie Ändern des Mediums immer häufiger, wie es möglicherweise die Zellen stören und machen sie von der Glasboden zu lösen. Verwenden Sie die Zellen innerhalb einer Woche nach der Aussaat sie für Experimente.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung einer Primärzelle Kultur von Medaka Hypophysen und bietet gesunde Zellen, die in einer Kultur für mindestens eine Woche gewartet werden können. Das Protokoll basiert auf physiologisch relevanten Werte für Medaka¹⁴ und ist zusätzlich mit der Hypophyse Gewebe im ausgewachsenen Fischen, mit einem pH-Wert von 7,75 und eine Osmolalität von 290 mOsm/kg während des gesamten Verfahrens von der Gewebe-Ernte, die vergoldete...

Diskussion

In-vitro- Zellkultursysteme bieten leistungsstarke Tools für Forscher, eine Fülle von verschiedenen biologischen Fragen zu beantworten, wenn im richtigen Weg¹verwendet. Es ist wichtig zu bedenken, dass dissoziierte Zellen, die ihre Verbindungen zu den benachbarten Zellen verloren haben unterschiedliche funktionale Eigenschaften erhalten haben können, als sie in Vivo ursprünglich. Um zu vermeiden, wird auf die Gefahr hin falsch interpretiert, die Ergebnisse von in-vitro-

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	D8537	Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.
L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	L5520	Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).
NaOH	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	S5881	Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.
NaHCO3	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	S5761	10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 mL culture medium.
D-mannitol	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	63565	Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.
D-glucose	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	G5400	4.5 mM  D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium.
GlutaMAX Supplement	Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)	35050-061	Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium.
Penicillin-Streptomycin	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	P0781	Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 µg/mL Streptomycin).
Trypsin type II-S	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	T7409	Prepare 1 mg/mL in dPBS solution.
Trypsin inhibitor type I-S	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	T6522	Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below).
Dnase I	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	D5025	Use in trypsin inhibitor solution (see above).
0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system	Corning Inc. (Corning, NY)	431097	Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.
35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-10-C	Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools (CA)	11254-20	Straight tip
Dumont #5/45 fine forceps	Fine Science Tools (CA)	11253-25	Angled 45° tip
Stereo microscope SZ61	Olympus Corp. (Tokyo, Japan)		Use for dissection of pituitaries.
Alegra X-22R Centrufuge	Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)		With cooling option (similar to current model XR-30).
Water bath	Techne (Staffordshire, UK)		Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.
Pasteur glass pipettes	VWR (NY)	612-1701	Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.
Galaxy MiniStar table centrifuge	VWR (NY)	521-2844	Any small table centrigue will do.
Fine needles/insect pins	Fine Science Tools (CA)	26001-40	Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.
Wax plate			Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.