Preparação de uma cultura de célula primária de alta qualidade do peixe Pituitaries

Resumo

Aqui descrevemos um protocolo para preparar e manter as culturas de células da hipófise primário de medaka (Oryzias latipes). As condições otimizadas no presente protocolo considerar parâmetros importantes, tais como temperatura, pH e pressão osmótica imitando as condições fisiológicas dos peixes, possibilitando resultados fisiologicamente mais significativos.

Resumo

Cultura de pilha primária é uma poderosa ferramenta comumente usada pelos cientistas para estudar as propriedades celulares e mecanismos de células isoladas em um ambiente controlado. Apesar das vastas diferenças na fisiologia entre mamíferos e peixes, protocolos de cultura de célula primária de peixe são frequentemente com base em condições de cultura mamíferos, frequentemente com apenas pequenas modificações. As diferenças ambientais afetam não só a temperatura do corpo, mas também soro sanguíneo parâmetros tais como a osmolaridade, pH e capacidade tampão de pH. Como meios de cultura celular e soluções de trabalho semelhantes são feitas para imitar as características do líquido extracelular e/ou soro de sangue para que uma célula é adaptada, é fundamental que esses parâmetros são ajustados especificamente para o animal em questão.

O atual protocolo descreve as condições de cultura primária otimizado para medaka (Oryzias latipes). O protocolo fornece etapas detalhadas sobre como isolar e manter saudável dissociado células da hipófise para mais de uma semana e inclui as seguintes etapas: 1. a adaptação da osmolalidade para os valores encontrados no plasma de sangue medaka, 2. a adaptação do temperatura de incubação à temperatura normal medaka (aqui na instalação de aquário) e 3. o ajuste do pH e bicarbonato buffer para valores comparáveis a outras espécies de peixes vivem em temperaturas semelhantes. Os resultados apresentados usando o protocolo descrito promovem resultados fisiologicamente significativos para medaka e podem ser usados como um guia de referência pelos cientistas fazer culturas de células primárias de outras espécies não-mamíferos.

Introdução

Cultura de pilha é uma das principais ferramentas usadas em pesquisa biológica molecular, proporcionando um excelente modelo sistema para responder perguntas biológicas diferentes, variando de fisiologia celular normal a droga triagem e carcinogênese¹. As células primárias, isoladas diretamente do tecido animal usando métodos enzimáticos e/ou mecânicos, são muitas vezes consideradas biologicamente mais relevantes do que linhas celulares como a resposta biológica pode estar mais perto a situação na vivo . Protocolos para a preparação de culturas de células primárias devem ser otimizados para cada tipo de espécie e célula de interesse, a fim de imitar as características para que uma célula é adaptada e obter resultados significativos fisiologicamente.

Inúmeros protocolos descrevem as condições de cultura para sistemas de células de mamíferos, enquanto protocolos semelhantes descrevendo as condições de cultura primária de células de peixes são bastante escassos em comparação. As células são vulneráveis a mudanças rápidas de temperatura, pH e pressão osmótica e são particularmente frágeis durante o procedimento de dissociação. Soluções de sal comerciais e meios de cultura utilizados para culturas de células de mamíferos não são ideais para peixes teleósteos, especialmente em termos de sistema (s) tampão de pH e pressão osmótica. É, portanto, importante medir e ajustar as soluções aos níveis fisiologicamente relevantes desses parâmetros na espécie de interesse.

Foram feitas culturas primárias da hipófise de várias espécies de peixes teleósteos, incluindo a carpa comum (Cyprinus carpio)^2,3, capim (Ctenopharyngodon idella)⁴, peixe dourado (Carassius auratus deda carpa )⁵, truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss)⁶, enguia europeia (Anguilla anguilla)⁷, tilápia (Oreochromis mossambicus)⁸, peixe-zebra (Danio rerio)⁹, e Bacalhau do Atlântico (Gadus morhua)¹⁰. Para ajustar a temperatura de incubação para as espécies de interesse, além de vários desses protocolos têm incubadas as células em condições semelhantes a mamíferos que podem ser ideais para as espécies de interesse, com um pH de 7.2 a 7.5 em um ambiente umidificado contendo 3-5% de CO₂. Além disso, é claro se a pressão osmótica de soluções utilizadas para a preparação de várias destas culturas de célula primária foram ajustada e estável entre diferentes soluções.

O protocolo atual é baseado no trabalho anterior com culturas primárias do bacalhau do Atlântico¹⁰ e inclui ajustes de temperatura de incubação, osmolaridade, pH e sistemas-tampão pH, incluindo a pressão parcial de dióxido de carbono (pCO₂), para a fisiologia do medaka (o. latipes). Medaka é um peixe de água doce pequeno (3 – 4 cm), nativo do sudeste da Ásia. Hoje em dia, é usado como uma espécie de modelo em muitos laboratórios de pesquisa ao redor do mundo, como é relativamente fácil para procriar e altamente resistente a muitos peixes comuns doenças¹¹. Existem várias vantagens de usar o medaka como um modelo, incluindo uma tolerância de temperatura de 4 – 40 ° C¹¹, um tempo de geração curto, embriões transparentes, um sexo-determinando gene¹²e um genoma sequenciado¹³, bem como muitos outros recursos genéticos disponíveis.

As condições de cultura primária neste protocolo são otimizadas para coincidir com a temperatura de 26 ° C que medakas são mantidos na instalação de peixe. Além disso, a osmolalidade é reduzida de 320 mOsm/kg de bacalhau do Atlântico vivem em água salgada para 290 mOsm/kg para medaka vivem em água doce e de acordo com a osmolalidade normal de medaka plasma¹⁴. Em comparação, a osmolalidade típica dos mamíferos plasma está na faixa de 275-295 mOsm¹⁵. Vive em uma variedade de temperaturas e possuem brânquias que estão em contacto directo com a água, tornando a capacidade de buffer e o pH do sangue e fluido extracelular em peixes diferentes em mamíferos. Meios de cultura mamíferos geralmente incluem sistemas tampão que resultam em um pH de cerca de 7,4 quando a mídia está equilibrada para uma atmosfera padrão de 5% de CO₂ no ar umidificado a 37 ° C. O pH é dependente de temperatura e o valor de pH neutro (em água) aumenta com uma diminuição de temperatura¹⁶. Típico de peixes teleósteos plasma pH varia de 7,7 a 7,9¹⁷. A otimização do presente protocolo incluíram uma redução de pH 7,85 bacalhau mantida a 12 ° C pH 7.75 para medaka mantida a 26 ° C, aumentando o CO₂ de 0,5% a 1%.

Além disso, a capacidade de tampão bicarbonato é bastante diferente em peixes e mamíferos. CO₂ é facilmente trocado sobre as brânquias em peixes e o pCO₂ na água é apenas uma pequena fração da pCO₂ no pulmão¹⁸. Alterar a temperatura ou o pCO₂ alterará o pH e o tampão do meio. Consequentemente, o pH, nem o pCO₂ recomendado pela incubação de células de mamíferos é ideal para células de peixe e, portanto, os meios de cultura devem ser otimizados com sistemas tampão contendo valores fisiologicamente relevantes para os peixes e os determinada espécie de interesse. Este protocolo descreve como preparar culturas de células primárias de pituitaries medaka e incluem ajustes de pH, osmolaridade, pH e temperatura reserva do sistema de incubação, além de outros parâmetros importantes a considerar ao preparar a célula primária culturas de espécies não-mamíferos.

Protocolo

As experiências com animais realizadas neste estudo foram aprovadas pela Universidade Norueguesa de Ciências da vida, seguir as orientações para o cuidado e bem-estar dos animais de pesquisa.

1. preparação de soluções

1. Calibre os instrumentos de medidor de aparelhos e pH de acordo com as instruções do fabricante para garantir uma medição correta.
2. Preparar 500 mL de Ca^{2 +}- e Mg^{2 +}-livre fosfato salino de Dulbecco (dPBS), ajustar o pH a 7.75 (etapa 1.2.1) e a pressão osmótica para 290 mOsm/kg (etapa 1.2.2) antes de uma filtração estéril (etapa 1.2.3).
   1. Ajuste o pH a 7.75 com um medidor de pH calibrado cuidadosamente adicionando gotas de uma solução de NaOH 1 M, agitando cuidadosamente a solução.
   2. Medir a osmolalidade da solução usando um aparelhos calibrados e calcular a quantidade de manitol, necessário para aumentar a pressão osmótica para 290 mOsm/kg. Adicione a quantidade necessária de manitol e em seguida medir a osmolalidade da solução novamente para garantir o ajuste correto.
      Nota: A quantidade de manitol necessário depende a osmolalidade medida, que normalmente varia entre diferentes lotes. Uma molécula de manitol é igual a 1 partícula osmótica.
   3. Estéril-filtrar a solução de dPBS usando um filtro de 0,2 µm.
      Nota: A solução pode ser armazenada a 4 ° C pelo menos 3 meses.
3. Preparar 500 mL de meio de cultura Leibovitz (L-15) sem L-glutamina e bicarbonato e complementar com 10mm NaHCO₃ (passo 1.3.1), glicose de 4,5 mM (etapa 1.3.2) e glutamina comercialmente disponível de 2 mM (etapa 1.3.3). Ajustar a solução para 290 mOsm/kg (etapa 1.3.4), filtro estéril (passo 1.3.5) e adicionar 2,5 mL de uma solução de penicilina-estreptomicina (etapa 1.3.6).
   Nota: A solução pode ser armazenada a 4 ° C pelo menos 4 semanas.
   1. Adicione 420 mg de NaHCO₃ por 500 mL de meio de cultura para alcançar uma solução de 10 mM.
   2. Adicione 405 mg de glucose por 500 mL de meio de cultura para alcançar uma solução de 4,5 mM.
   3. Adicione 5 mL de 100 ações de x de uma solução de glutamina em 500 mL de meio de cultura para alcançar uma solução de 2 mM. Mexa até que todos os solutos são dissolvidos.
   4. Ajuste a solução para 290 mOsm/kg com manitol usando um aparelhos (como o realizado na etapa 1.2.2).
   5. Realize uma filtração estéril do meio de L-15 usando um filtro de 0,2 µm.
   6. Após a filtração estéril, adicione 2,5 mL de uma solução de penicilina-estreptomicina, correspondente a 50 U/mL de penicilina e 50 µ g/mL de estreptomicina.
4. Prepare-se 50 mL de uma solução de tripsina usando 1 mg/mL (0,1%) tipo de tripsina QUE II-S dissolvido na dPBS modificados (preparado na etapa 1.2). Faça alíquotas de 2 mL em tubos de plástico estéril e armazená-los a-20 º C até o uso.
   Nota: Alíquotas de 2 mL podem ser armazenadas a-20 º C pelo menos 3 meses.
5. Prepare-se 50 mL de uma solução de inibidor de tripsina usando 1 mg/mL de (0,1%) tripsina inibidor tipo S e completá-lo com 2 µ g/mL de DNase eu dissolvido na dPBS modificados (preparado na etapa 1.2). Faça alíquotas de 2 mL em tubos de plástico estéril e armazená-los a-20 º C até o uso.
   Nota: Alíquotas de 2 mL podem ser armazenadas a-20 º C pelo menos 3 meses.

2. preparação do equipamento

1. Prepare-se pipetas de vidro pelo fogo da ponta para a dissociação de célula de polimento. Fazer dicas com 2 categorias de tamanho diferentes (uma abertura média de 0,6-0,8 µm e uma pequena abertura de 0,4 – 0,6 µm), jogando com o tempo e a distância entre a chama rodando simultaneamente a pipeta. Coloque as pipetas de vidro em um recipiente de vidro limpo e autoclave-los (usando o modo sólido a 105 ° C por 45 min).
2. Prepare uma caixa de isopor com gelo.
3. Prepare um tubo de plástico com 1,5 mL de dPBS modificados (preparado na etapa 1.2) para transferir os pituitaries para durante a dissecção e mantê-lo no gelo.
4. Prepare um tubo de 15 mL com 10 mL de dPBS modificados (preparado na etapa 1.2) e mantê-lo no gelo até a dissociação de célula.
5. Prepare fresco ou descongelar alíquotas das soluções de inibidor de tripsina (preparadas em etapas 1.4 e 1.5) e tripsina e mantê-los no gelo até o uso.
6. Configure o banho de água a 26 ° C antes de iniciar a dissecação para permitir que a água atingir a temperatura desejada antes a dissociação química dos pituitaries.
7. Limpe todas as ferramentas de dissecação com etanol a 70% antes, durante e após o uso, incluindo a pinça fina para usar para a dissecção e agulhas finas e uma placa de cera para fixar os peixes. Usar luvas limpas (alterar e limpar frequentemente) durante todo o procedimento para evitar uma potencial contaminação das células.

3. na hipófise dissecção e dissociação de célula

1. Eutanásia o peixe por imersão em lama de gelo (0 ° C). Deixe o peixe da lama de gelo pelo menos 1 min garantir um choque hipotérmico irreversível.
   Nota: Perda de imobilização e equilíbrio ocorrerá após alguns segundos. Verifique se o peixe está completamente submersa na água gelo e não reside em cima do gelo, como o último conduzirá à asfixia e potencial pele queima em vez de um choque hipotérmico rápido e humano.
2. Rapidamente o peixe em uma rede de transferência para uma placa de cera sob o microscópio de dissecação e destruir a coluna por um soco de agulha no pescoço.
3. Pino da cabeça do peixe para a placa de cera usando agulhas finas, inserindo uma agulha na parte dianteira (sobre a boca) e um em cada lado da cabeça (atrás do cérebro) para estabilizar a cabeça perante a dissecação.
4. Ver o peixe sob o microscópio de dissecação e delicadamente, raspe as escamas na parte superior da cabeça usando a pinça fina com uma ponta em ângulo.
5. Cuidadosamente Introduza a ponta angular da pinça fina sob a pele do lado da cabeça e remover o teto do crânio, movendo lentamente a pinça na direção da boca, mantendo um aperto firme para a pinça encerram o teto do crânio.
6. Corte a medula espinhal completamente usando a pinça com ponta em ângulo.
   Nota: O tempo é um fator importante, para trabalhar eficientemente e com precisão limitar o tempo gasto desde a dissecação dos pituitaries até que as células são banhadas no prato. Depois de alguma prática, dissecação da hipófise deve levar em torno de 2 – 3 min por peixe, dos quais apenas cerca de 10 s são necessários para atender a hipófise quando o cérebro já está exposto.
7. Vire cuidadosamente o cérebro em direção a boca para expor a hipófise e dissecá-lo com uma pinça limpa com uma ponta reta. Transferir a pituitária para um tubo de plástico contendo 1,5 mL modificado dPBS (para obter detalhes, consulte Passo 2.3) colocado no gelo. Verifique se a ponta da pinça sob o microscópio para garantir que a hipófise com êxito é adicionada ao tubo e nada é deixado a fórceps.
   Nota: Disse como muitos pituitaries conforme necessário, dependendo do número de pratos de cultura que vão ser preparados simultaneamente. Como regra geral, calcule pelo menos 10 pituitaries de peixe adulto por prato para ter uma densidade adequada de células (que depende da aplicação a jusante).
8. Spin para baixo as pituitaries em uma centrífuga de mesa para 1-2 s à temperatura ambiente. Retire o dPBS usando uma pipeta de vidro cuidadosamente e tome cuidado para evitar a remoção de qualquer pituitaries.
9. Adicione 1 mL da solução de tripsina (preparada na etapa 1.4) para lavar as pituitaries, girá-los para baixo em uma centrífuga de mesa para 1-2 s e remover a maior parte do líquido usando uma pipeta de vidro antes de adicionar um adicional 1 mL de solução de tripsina.
10. Incubar o tubo em um banho de água a 26 ° C durante 30 minutos, de preferência com agitação suave, ou alternativamente, agite o tubo algumas vezes durante o período de incubação.
11. Spin para baixo as pituitaries em uma centrífuga de mesa para 1-2 s à temperatura ambiente e certifique-se de todos os pituitaries estão localizados na parte inferior do tubo. Remover a maior parte da solução de tripsina com uma pipeta de vidro e adicione 1 mL da solução de inibidor de tripsina (preparada na etapa 1.5) para inactivar a tripsina e lavar os pituitaries.
12. Recolha os pituitaries na parte inferior do tubo girando-os para baixo em uma centrífuga de mesa para 1-2 s à temperatura ambiente. Remover a maior parte do líquido com uma pipeta de vidro e adicione 1 mL da solução de inibidor de tripsina (preparada na etapa 1.5). Colocar o tubo em um banho de água a 26 ° C durante 20 minutos, de preferência com agitação suave, ou alternativamente, agite o tubo algumas vezes durante o período de incubação para inactivar a tripsina.
13. Prepare um prato de cultura de célula poli-d-lisina-revestido de 35 milímetros com um fundo de vidro central adicionando 2 mL do meio de L-15 e deixar que incube durante pelo menos 10 min a 26 ° C e com 1% de CO₂ para que conseguir atingir a temperatura e o pH antes de chapear as pilhas.
    Nota: Também pode ser usada numa placa de cultura de células de plástico. A principal vantagem de usar um prato com um fundo de vidro centralizado é que a área onde as células são banhadas é menor, e portanto, menos células da hipófise são necessárias por prato. Algumas aplicações a jusante também podem requerer um fundo de vidro (ou seja, algumas técnicas de imagem).
14. Defina a refrigeração centrífuga para tubos de 15 mL a 4 ° C, para permitir-lhe chegar à temperatura desejada antes de iniciar a dissociação mecânica.
15. Recolher os pituitaries na parte inferior do tubo por girando para baixo o tubo com a solução de inibidor de tripsina (da etapa 3.11) em uma centrífuga de mesa para 1-2 s à temperatura ambiente e certifique-se de todos os pituitaries estão localizados na parte inferior do tubo antes cuidadosamente remover a maior parte da solução do inibidor de tripsina utilizando uma pipeta de vidro.
    Nota: Execute todas as etapas seguintes do protocolo em uma bancada de fluxo laminar (LAF) certificadas pelo trabalho de célula evitar uma contaminação das células.
16. Adicione 1 mL de gelado dPBS modificados (preparado na etapa 2.4) para as peças de tecido na hipófise e chupar delicadamente os pedaços de tecido e descer (6 – 7. x) em uma pipeta de vidro polido fogo (preparada no passo 2.1).
    Nota: A temperatura é um aspecto essencial, portanto, mantenha todas as soluções a 4 ° C. Deste ponto em diante, execute todas as etapas no gelo quando possível.
17. Gire para baixo as peças de tecido em uma centrífuga de mesa para 1-2 s à temperatura ambiente e transferir cuidadosamente a parte superior do dPBS contendo as células dissociadas (quase 1 mL) para um novo tubo de 15 mL colocado no gelo. Evite se mover da pipeta para o fundo do tubo, onde ficam as peças de tecido.
18. Repita a etapa 3.16 – 3.17, dissociando as células em 1 mL de dPBS gelada de cada vez, até que todos os 10 mL de dPBS é usado. Comece usando uma pipeta de vidro com uma abertura de tamanho médio e alternar para uma pipeta de vidro com uma abertura menor no final (para os último 3 – 4 mL de dPBS adicionado) da dissociação. Se há pedaços de tecido ainda visível no final do processo de dissociação, aumentar a pipetagem de aproximadamente 10 x para as 2 últimas etapas de dPBS para dissociação e finalmente deixar os pedaços de tecido residual. Ressuspender as células suavemente e evitar a criação de bolhas como pode causar danos nas células quando as células anexa à superfície das bolhas.
    Nota: Esta é uma etapa crítica do presente protocolo e requer algum treinamento para obter um bom resultado.
19. Equilibrar o tubo no centrifugador (pre-resfriado a 4 ° C) e spin-down as células a 200 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Certifique-se de marcar a lateral do tubo onde será o centrifugado.
20. Retire cuidadosamente o tubo de centrífuga e suavemente, transferir o sobrenadante com uma pipeta de vidro para um tubo de plástico vazia 15 mL diretamente após a centrifugação. Não se esqueça de remover a maior parte do sobrenadante, mas tome cuidado para não perder o pequeno centrifugado (muitas vezes invisíveis).
21. Cuidadosamente Ressuspender as células em 50 a 100 µ l de meio de cultura de L-15.
    Nota: Neste passo, é possível contar as células e/ou executar um teste de viabilidade (como uma célula de contagem na presença de azul de trypan usando um hemocytometer), mas cuidado que utilizando parte da suspensão de células para o efeito irá diminuir o rendimento. Evite usar um volume grande de suspensão como aumentará o risco de células difusão fora do centro do prato.
22. Escorrer cuidadosamente as células dissociadas no meio do prato de cultura de células contendo 2 mL do meio de L-15 (preparado na etapa 3.13). Permitir que as células para afundar até o fundo do prato por aproximadamente 5 min antes de movê-los para a incubadora, para evitar que as células espalhar fora da parte submersa da parte inferior de vidro.
23. Incube o prato no 26 ° C e 1% CO₂ para permitir que todas as células afundar completamente e anexar para o fundo do prato.
24. Depois de 30 min, olhe para as células no microscópio para certificar-se de que eles têm ligado para o prato de cultura.
25. Continue a incubar as células a 26 ° C e 1% de CO₂.
26. Cuidadosamente, mudar da maioria (mas não todos) o médio a cada 3-4 dias.
    Nota: Evite alterar o meio mais frequentemente, que possa perturbar as células e fazê-los desanexar da parte inferior do vidro. Use as células para experiências dentro de uma semana após a semeadura-los.

Resultados

Este protocolo descreve a preparação de uma cultura de célula primária de pituitaries medaka e fornece as células saudáveis que podem ser mantidas em uma cultura pelo menos uma semana. O protocolo é baseado em valores correspondentes fisiológicos medaka¹⁴ e além disso é otimizado para o tecido da hipófise em peixes adultos, usando um pH de 7.75 e uma osmolalidade de 290 mOsm/kg durante todo o procedimento desde a colheita de tecidos para o chapeado célu...

Discussão

Sistemas de cultura in vitro células fornecem ferramentas poderosas para os investigadores responder a uma infinidade de questões biológicas diferentes se usado no caminho certo¹. É importante lembrar que células dissociadas que perderam suas conexões com as células vizinhas ter obtido diferentes propriedades funcionais do que tinham originalmente em vivo. Para evitar ser correndo o risco de má interpretação dos resultados obtidos em experimentos em vitro , é ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (dPBS), without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	D8537	Adjust solution to pH 7.75 with 1M NaOH and 290 mOsm with mannitol.
L-15 medium (Leibovitz), witout L-glutamine	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	L5520	Supplement 500 ml culture medium with 10 mM NaHCO3, 4.5 mM glucose, 2 mM Glutamax. Adjust solution to 290 mOsm with mannitol and filter solution through a 0.2 µm PES sterile filter, before adding 2.5 mL Penicillin-Streptomycin solution (see below for details).
NaOH	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	S5881	Add drops of 1 M solution to increase pH of dPBS and culture medium to 7.75.
NaHCO3	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	S5761	10 mM NaHCO3 equals 420 mg per 500 mL culture medium.
D-mannitol	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	63565	Use to increase osmolality of dPBS and culture medium. Calculate correct amount needed to reach an osmolality of 290 mOsm.
D-glucose	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	G5400	4.5 mM  D-glucose equals 405 mg per 500 mL culture medium.
GlutaMAX Supplement	Gibco (Life Technologies, Paisley, UK)	35050-061	Alternative to L-glutamine, with increased stability. 2 mM Glutamax equals 5 ml of 100x stock in 500 mL culture medium.
Penicillin-Streptomycin	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	P0781	Stock solution 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin per mL. Use 2.5 mL of stock solution in 500 mL L-15 medium (equivalent of 50 U/mL Penicillin and 50 µg/mL Streptomycin).
Trypsin type II-S	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	T7409	Prepare 1 mg/mL in dPBS solution.
Trypsin inhibitor type I-S	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	T6522	Prepare 1 mg/mL in dPBS solution, supplement with 2 µg/ml Dnase I (see details below).
Dnase I	Sigma (Merck, Damstadt, Germany)	D5025	Use in trypsin inhibitor solution (see above).
0.2 µm Polyethersulfone (PES) sterile filter system	Corning Inc. (Corning, NY)	431097	Use for sterile filtration of dPBS and L-15 medium after adjustments.
35 mm cell culture dish with glass bottom, poly d-lysine coated	MatTek Corporation (Ashland, MA)	P35GC-1.5-10-C	Can also be replaced by plastic dish, depending on downstream application.
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools (CA)	11254-20	Straight tip
Dumont #5/45 fine forceps	Fine Science Tools (CA)	11253-25	Angled 45° tip
Stereo microscope SZ61	Olympus Corp. (Tokyo, Japan)		Use for dissection of pituitaries.
Alegra X-22R Centrufuge	Beckman Coulter Inc. (Brea, CA)		With cooling option (similar to current model XR-30).
Water bath	Techne (Staffordshire, UK)		Any water bath with the possibility of adjusting temperature will do.
Pasteur glass pipettes	VWR (NY)	612-1701	Outer diameter 1.6 mm, fire polish and autoclave before use.
Galaxy MiniStar table centrifuge	VWR (NY)	521-2844	Any small table centrigue will do.
Fine needles/insect pins	Fine Science Tools (CA)	26001-40	Diameter 0.03 mm. Other fine needles can be used instead.
Wax plate			Custom made by adding melted paraffin wax in large petri dish.