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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier zeigen wir die Methoden zur in Vivo Quantifizierung der Leukozyten Ausstieg aus naiv, entzündet, und bösartigen murinen Haut. Wir führen einen direkten Vergleich der beiden Modelle: transdermale FITC Anwendung und in Situ Ladungszustand. Darüber hinaus zeigen wir den Nutzen der Ladungszustand für die Verfolgung von Leukozyten Egress von kutanen Tumoren.

Zusammenfassung

Leukozyten-Ausstieg aus den peripheren Geweben, Lymphknoten ist nicht nur wichtig für die Immunüberwachung und Einleitung, sondern trägt auch zur Lösung der peripheren Gewebe Antworten. Während eine Vielzahl von Methoden werden verwendet, um die Leukozyten Ausstieg aus den nicht-lymphatischen, peripheren Geweben zu quantifizieren, bleiben die zellulären und molekularen Mechanismen, die Kontext-abhängige ausgehenden Regeln schlecht verstanden. Hier beschreiben wir die Verwendung von in Situ Ladungszustand für Quantitative Analyse der Leukozyten Ausstieg aus murinen Haut und Tumoren. Ladungszustand ermöglicht die direkte Kennzeichnung von Leukozyten in Hautgewebe aufhalten. Obwohl die Exposition der Haut gegenüber UV-Licht induziert lokale Entzündungsreaktionen Leukozyten Infiltrate und geprägt vaskulären Undichtigkeit in einem Direktvergleich mit transdermalen Anwendung von fluoreszierenden Tracern Ladungszustand speziell wandernde dendritische Zellenbevölkerungen beschriftet und aktiviert gleichzeitig die Quantifizierung der myeloischen und lymphatischen Egress von kutanen Mikroumgebungen und Tumoren. Die Mechanismen der Leukozyten Egress bleiben eine fehlende Komponente in unserem Verständnis der intratumorale Leukozyten Komplexität und damit die Anwendung der hier beschriebenen Tools bieten einzigartige Einblicke in die Dynamik der Tumor immun Mikroumgebungen beide im Steady State und im Ansprechen auf die Therapie.

Einleitung

Periphere Gewebe Immunantworten sind geprägt durch Leukozyten Einstellung zu den Standorten von Entzündungen, sondern auch durch Mechanismen, die ihre spätere Aufbewahrung zu Regeln. Somit richtet sich schützende Immunität durch kumulative zellulären und molekularen Mechanismen, die bestimmen, ob ein Leukozyten eingibt, Aufenthalte innerhalb, oder besser gesagt aus peripheren Gewebe über Lymphgefäße migriert. Wichtig ist, ist die Neigung für Leukozyten Gewebe durch Lymphgefäße (genannt Egress) beenden ihre speziellen Funktionen verbunden. Dendritische Zellen (DC) erwerben Wanderungsverhalten in Reaktion auf Reifung Signale führt zu Antigen-Transport und Präsentation in Entleerung Lymphknoten (dLN), ein Prozess, der für adaptive Immunität1erforderlich ist. Aufräumvorgang myeloische Zellen wie Makrophagen und Neutrophilen, dienen der Apoptotic Rückstand durch Phagozytose zu löschen. Während der bakteriellen Infektion Neutrophilen Brandschutzzeichen Gewebe und letztlich Apoptose in dLNs2 und in einem Modell der DSS-induzierte Kolitis, Daten unterstützen die Hypothese, dass Makrophagen Egress lokale Entzündung3lösen muss. Ob Neutrophilen und Makrophagen Egress Auftritt in allen entzündlichen zusammenhängen, ist allerdings unbekannt. Beweise für die T-Lymphozyten Egress von Steady-State4,5,6,7, infizierte8und entzündeten4,9,10, 11,12 periphere, nicht-lymphatischen Gewebe zeigt, dass T-Zellen aktiv umwälzen, obwohl die gewebebasierten Signale, die diese Ausfahrt fahren schlecht verständlich bleiben. Mehrere Studien identifizierten Signale für gerichtete Migration in Richtung Entwässerung lymphatische Kapillaren und die anschließende Brandschutzzeichen einschließlich Chemokin (C-C-Motiv) Liganden 21 (CCL21) und seines Rezeptors CCR74,11, 13, Chemokin (C-X-C Motiv) Liganden 12 (CXCL12) und sein Rezeptor CXCR42,14, sowie Sphingosine-1-Phosphat (S1P)10,15,16. Diese Mechanismen sind nicht in allen Kontexten tätig, und ob sie Ausgang alle Zelltypen bestimmen, bleibt eine offene Frage. Wichtig ist, bedarf weiterer Einblick in die Mechanismen, die für Ausstieg und seine funktionelle Relevanz bei der Krankheit gelten quantitative in-Vivo -Methoden der Analyse.

Verschiedene Methoden wurden verwendet, um Ausstieg in mehreren Tiermodellen in Vivo einschließlich direkter Kanülierung der Lymphgefäße, Adoptiv Transfer von ex-Vivo mit der Bezeichnung Leukozyten, transdermale Anwendung von fluoreszierenden Tracer zu quantifizieren, Einspritzung der beschriftete Partikel und in Vivo Ladungszustand17,18. Direkte Kanülierung der afferenten Maus Lymphgefäße ist schwierig und Kleintiere begrenzt durch die Menge an Flüssigkeit, die gesammelt werden können. So Kanülierung vor allem bei großen Tieren durchgeführt wurde (zB., Schafe) wo solche chirurgischen Manipulationen sind praktisch. Diese Studien liefern direkte Hinweise auf das Vorhandensein des lymphatischen und myeloischen Zellen in Lymphknoten10,19,20. Darüber hinaus zeigen Schafe Modelle, dass akute und chronische Entzündungen Lymphozyten Präsenz in Lymphe durch fast 100-fold10,21 erhöht.

Adoptiveltern Übertragung von beschrifteten und genetisch manipulierter Lymphozyten hat vor allem ergeben, dass CCR7 für den Ausstieg von CD4 benötigt+ T-Zellen von akut entzündeten Haut5,11, während der Vorbehandlung von Lymphozyten mit dem kleinen Molekül S1P-Rezeptor-Agonist hemmt FTY720, nur teilweise ihren Ausgang10. Interessanterweise der Egress von übertragenen Lymphozyten von chronisch entzündete Haut ist CCR7-unabhängige10, aber erfordern teilweise CXCR49. Adoptiv-Transfer Experimente, liefern jedoch physiologisch Zahlen von Ex-Vivo aktivierte und beschriftete Lymphozyten in das Gewebe durch Injektion, die biomechanische Umwelt von Geweben und erhöhten interstitiellen Fluiddrücke verändert das erste lymphatische Kapillaren öffnen und ändern ihre Transport-Eigenschaften-22. Als alternative, transdermale Anwendung von Fluorescein erfolgt (FITC) in das Vorhandensein oder Fehlen von dermalen Reizstoffe (zB., Dibutyl Phthalat, DBP) oder Infektion23,24 ermöglicht die Verfolgung von phagocytic Zellen, die Tracer zu sammeln und zu dLNs migrieren. In ähnlicher Weise können Eindringmittel beschriftete Tumoren phagocytic Zellen zu verfolgen, die Tumor Material25verschlungen haben. Diese Methoden haben wichtige Einblicke in die Mechanismen zur Verfügung gestellt, die regieren DC Ausgang13,14,17,26,27 , aber sind nicht in der Lage, nicht-phagocytic verfolgen Lymphozyten und Interpretation können durch kostenlose Lymphdrainage des löslichen FITC so Kennzeichnung nicht migrierend LN ansässige DCs erschwert werden.

Alternativ ist intravitalen Mikroskopie ein leistungsfähiges Werkzeug, das in Vivo Verfolgung von physiologisch relevanten Leukozyten Populationen in Echtzeit28,29ermöglicht. In Kombination mit dem Reporter Mäuse und Antikörper-basierten in Vivo immunofluorescent Kennzeichnung intravitalen Mikroskopie ergab die komplexe räumliche und zeitliche Dynamik der immunen Zellen des Drogenhandels, einschließlich interstitielle Migration30 , Seelenwanderung über das lymphatische Endothel, Passage innerhalb der lymphatischen Lumen und Migration auf LN Eintrag28,31. Breite Akzeptanz der intravitalen bildgebenden Verfahren wird durch Kosten, notwendige Know-how zum Einrichten, begrenzt und beschränkt Durchsatz zur Quantifizierung der mehrere Zelltypen. Dennoch werden Kupplung quantitative Methoden, die Populationsdynamik analysieren Gewebe mit intravitalen Bildgebung zusätzliche und wichtige mechanistischen in Bezug auf die Mechanismen der Motilität und Migration in Richtung und im lymphatischen Kapillaren Einblick 18 , 31 , 32.

Infolgedessen in Vivo Ladungszustand entstanden als eine Methode, die in Situ zu etikettieren, erlaubt unabhängig von phagocytic Tätigkeit und für die Quantifizierung der physiologischen Leukozyten Ausgang (wenn in Verbindung mit Durchflusszytometrie) in der fehlen oder Vorhandensein von Herausforderung. Kaede-Tg Mäuse express konstitutiv ein Protein isoliert von Stony Coral, die grüne Fluoreszenz (Kaede grün) aufweist, bis UV-Licht ausgesetzt nach denen es irreversibel zu rote Fluoreszenz (Kaede rot)33umwandelt. Photoconverted Zellen können verfolgt werden, wie sie von Seiten der peripheren Gewebe Brandschutzzeichen und reichern sich in dLNs. Dies und andere ähnliche Photoconvertible Maus Modelle34,35 ergaben sich wichtige Biologie einschließlich konstitutive Egress von regulatorischen T-Zellen von Haut36, CXCR4-abhängige B Zelle Austritt von Peyer Patches37 , Mobilisierung von Residenten Speicher T-Zellen auf Peptid erneut herausfordern38und breiten Leukozyten Egress von Tumor Mikroumgebungen39. Hier führen wir einen direkten Vergleich der Ladungszustand mit transdermalen FITC Anwendung im Rahmen der kutanen Entzündung und Infektion mit der Photoconvertible-Methode zum direkten Vergleich der vorhandenen Daten zu ermöglichen. Wir zeigen Ladungszustand im implantierten Tumoren und beschreiben die Umwandlungs-Leistungsfähigkeit und selektive Egress von Tumor Mikroumgebungen. So, wir argumentieren, dass die weitere Anwendung dieser Methoden benötigt wird, um die kritische Biologie der Leukozyten Egress von Tumoren, aufzuklären, die erhebliche Auswirkungen auf die Interpretation intratumorale Leukozyten Komplexität, anti-Tumor Immunität haben wird und Ansprechen auf die Therapie.

Protokoll

Alle tierischen Protokolle wurden von den institutionellen Animal Care und Use Committee an der Oregon Health & Science University genehmigt.

1. Induktion von Entzündungen und FITC Malerei der Maus Pinna

  1. In einem Laminar-Flow-Haube, betäuben Mausklick C57Bl/6 mit verdampftem Isofluorane (bei 3-5 % Isofluorane induzieren und pflegen auf 1-3 % Isofluorane; Sauerstoff Durchflussmenge bei 0,5-1,0 L/min). Richtige Anesthetization zu gewährleisten, durch die Überwachung des Verlust Pedal-Reflex, unwillkürliche Bewegungen und reduzierte Atemfrequenz.
  2. Legen Sie ein Ohr flach mit der Bauchseite das Ohr nach oben. Pipettieren 20 µL 5 % FITC Lösung aufgelöst in 1:1 Aceton: Dibutyl Phthalat (DBP) auf die ventrale Seite des Ohr Ohrmuschel. Lassen Sie das Ohr ein paar Sekunden trocknen.
  3. 24 h nach dem Auftragen FITC einschläfern die Mäuse über CO2-Exposition durch zervikale Dislokation gefolgt. Sammeln Sie das Ohr Ohrmuschel in PBS durch die Ohren vom Kopf mit einer Schere zu trennen. Sammeln Sie die zervikalen dLNs und leisten--Entwässerung LNs in PBS mit einer Pinzette die LNs getrennt vom umgebenden Gewebe. Leisten--Entwässerung LNs dient als negative Kontrollen auf das Vorhandensein von FITC+/Kaede rot+ Leukozyten. Entsorgen Sie Kadaver pro institutionelle Protokoll.
    Hinweis: Die optimale Zeit Post Ladungszustand zur Analyse hängt von Zelltyp und bekannte wandernde Verhalten. Dendritische Zellen können beispielsweise in dLNs bereits als 6 h Post DBP-Anwendung erkannt werden.

(2) Induktion von Entzündungen und Ladungszustand der Maus Pinna

  1. Betäuben Sie in einem Laminar-Flow-Haube Kaede-Tg Maus (Hintergrund C57Bl/6) durch intraperitoneale Injektion von 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin in Kochsalzlösung aufgelöst. Richtige Anesthetization zu gewährleisten, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
  2. Legen Sie ein Ohr flach mit der Bauchseite das Ohr nach oben. Pipettieren 20 µL einer 1:1 Aceton: DBP auf der ventralen Seite des Ohr Pinna. Lassen Sie das Ohr ein paar Sekunden trocknen.
  3. Schneiden Sie nach Anwendung der DBP einen Schlitz in ein Stück Alufolie und ziehen Sie das Ohr durch den Schlitz, das Ohr auf die violetten Lichtquelle aussetzen. Legen Sie das Ohr flach mit der dorsalen Seite nach oben mit doppelseitigem Klebeband, um das Ohr an der Folie zu sichern.
  4. Positionieren Sie das Ohr direkt unter der Lichtquelle und Photoconvert für 3 min mit einer 405 nm Lichtquelle mit 100 mW Leistung.
  5. 24 h nach Ladungszustand, einschläfern Kaede-Tg-Mäuse und das Ohr Ohrmuschel, zervikale LNs und inguinalen LNs zu ernten, wie in Schritt 1.3 beschrieben.
    Hinweis: Neben Überlegungen in Schritt 1.3 zitiert, die Rate der Verbreitung bestimmt den Zeitpunkt der Analyse wie der Verlust von Kaede rot in sich schnell teilenden Zellen auftreten wird.

(3) Vaccinia Infektion der Maus Pinna und FITC Anwendung

  1. Eine C57Bl/6-Maus mit verdampftem Isofluorane zu betäuben, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
  2. Die Bauchseite des Ohres flach zu legen. Pipettieren 5 x 106 Plaque bilden Einheiten (PFU) des Vaccinia Virus (VacV) in 10 µL PBS auf Ohr Pinna verdünnt. Mit einer 29-Gauge-Nadel, stechen Sie die Ohrmuschel 25 Mal40.
  3. 24 h nach der Infektion, VacV-infizierte Mäuse mit Isofluorane zu betäuben, wie unter Schritt 1.1 und Pipettieren 20 µL 5 % FITC in Aceton auf der Bauchseite der Ohr-Pinna gelöst. Lassen Sie das Ohr ein paar Sekunden trocknen.
  4. 24 h nach dem Auftragen FITC einschläfern die Mäuse und das Ohr Ohrmuschel, zervikale LNs und inguinalen LNs zu sammeln, wie in Schritt 1.3 beschrieben.
    Hinweis: FITC kann zu jeder Zeitpunkt Post Infektion DC Menschenhandel in verschiedenen 24 h Abständen bestimmen angewendet werden. Wir berichteten bereits, dass DC-Migration auf dLNs auf ähnlichem Niveau von Tag 1 bis 3 Post-Infektion41aufrechterhalten wird.

4. Vaccinia Infektion der Maus Pinna und Ladungszustand.

  1. Kaede-Tg Maus mit verdampftem Isofluorane zu betäuben, wie in Schritt 1.1 beschrieben.
  2. Das Ohr Ohrmuschel mit VacV zu infizieren, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
  3. 24 h nach der Infektion, Kaede VacV-infizierten Mäusen wie in Schritt 2.1 beschrieben zu betäuben und Ladungszustand durchführen, wie 2.3-2.4 beschrieben.
  4. 24 h nach Ladungszustand, einschläfern die Mäuse und das Ohr Ohrmuschel, zervikale LNs und inguinalen LNs zu ernten, wie in Schritt 1.3 beschrieben.
    Hinweis: Wie bereits erwähnt in Schritt 3.4 kann Ladungszustand bei jeder Zeitpunkt Post Infektion verabreicht werden.

(5) Ohr und Lymphknoten Verarbeitung für Durchflusszytometrie

  1. Erstellen Sie einzelne Zellsuspensionen von Ohr Ohrmuschel: schälen auseinander ventralen und dorsalen Rand mit zwei paar Pinzette und Ort mit der Innenseite nach unten in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 1 mg/mL Kollagenase D und 80 U/mL DNase verdünnt im Ohr Ohr Pinna Hank es gepuffert salzhaltige Lösung (HBSS) (mit Ca2 + und Mg2 +). Inkubation bei 37 ° C für 30 min. Presse das verdaute Gewebe durch ein 70 µm Nylon Zelle Sieb.
  2. Erstellen Sie einzelne Zellsuspensionen von LNs: Brunnen von einer 24-Well-Platte mit 1 mg/mL Kollagenase D und 80 U/mL DNase verdünnt in HBSS LNs entgegenbringen. Öffnen Sie den Lymphknoten Kapsel mit zwei 29-Gauge Nadeln und inkubieren Sie die Lymphknoten bei 37 ° C für 30 min. Presse das verdaute Gewebe durch ein 70 µm Nylon Zelle Sieb zu necken.

6. intrakutane Melanom Tumor Implantation und Ladungszustand.

  1. Rasieren Sie das Fell von der Mitte des Rückens Mausklick Kaede-Tg mit einen elektrischen Rasierapparat.
  2. Positionieren Sie eine 29-Gauge-Nadel in der Mitte des Rückens zwischen der linken und rechten oberen Scapulae und Mikrodialysemembranen injizieren Sie 5 x 105 Tumorzellen (in 50 µL Kochsalzlösung verdünnt) in die Haut von Mäusen, Kaede-Tg. Tumoren müssen sorgfältig positioniert werden, um Lymphdrainage zu bestimmten Lymphknoten (alsolinks und rechts brachial LNs für Tumoren in der Mitte des oberen Rückens platziert) zu gewährleisten. Vermeiden Sie den Tumor über dLN, da direkte Ladungszustand der LNs durch die Hauttumor führen kann.
  3. Die Tumoren wachsen auf gewünschte Größe (100-650 mm3) zu ermöglichen.
  4. Betäuben Sie einen Tag vor der Entnahme von Gewebe, Kaede-Tg Maus zu, wie unter 2.1 beschrieben und Rasieren Sie jede neu nachgewachsene Fell rund um den Tumor zu.
  5. Schneiden Sie ein kreisrundes Loch in Alufolie und durchziehen Sie den Tumor, den Tumor auf die Lichtquelle aussetzen. Schneiden Sie das Loch etwas kleiner als der Tumor zu verhindern, dass den Tumor wieder durch das Loch zu fallen, und minimieren Sie die Umwandlung der benachbarten, keinen Tumor Haut.
  6. Positionieren Sie den Tumor direkt unterhalb der Lichtquelle und Photoconvert für 5 min mit einer 405 nm Lichtquelle mit 200 mW Leistung.
  7. 24 h nach Ladungszustand, einschläfern die Mäuse, wie in Schritt 1.3 beschrieben. Sammeln Sie die Tumoren, brachial dLNs und leisten--Entwässerung LNs in PBS. Schneiden Sie die Tumoren von der umgebenden Haut mit einer Schere und entfernen Sie LNs zu, wie in Schritt 1.3 beschrieben.

(7) Tumor und Lymphknoten Verarbeitung für Durchflusszytometrie

  1. Erstellen Sie einzelne Zellsuspensionen von Tumoren: Tumoren mit einer Schere in Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit 1 mg/mL Kollagenase D und 80 U/mL DNase verdünnt in HBSS Blatt vor den Mund. Inkubation bei 37 ° C für 1 h Presse das verdaute Gewebe durch ein 70 µm Nylon Sieb.
  2. Erstellen Sie einzelne Zelle Aussetzung der Lymphknoten, wie im Schritt 5.2 beschrieben.

(8) Antikörper für die Durchflusszytometrie Färbung

  1. Führen Sie nach verdauen das Gewebe in einzelnen Zellsuspensionen, standard Flow Cytometry befleckenden Techniken um die Zellen mit Markierungen von Interesse zu beschriften. Kurz, Pipettieren 2 x 106 Zellen in einer 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Proben mit Fc-Block (1 µg/mL) für 20 min auf Eis; Waschen Sie sich zweimal mit FACs-Puffer (1 % Rinderserumalbumin mit PBS-Puffer). Den Proben lebenden/Toten Fleck (verdünnt mit PBS-Puffer) hinzugefügt und inkubieren Sie für 15 min auf Eis; Waschen Sie sich zweimal mit FACs-Puffer. Brüten Sie mit Primärantikörpern (Table of Materials) in FACs Puffer für 30 min auf Eis verdünnt; Waschen Sie sich zweimal mit FACs-Puffer.
    Hinweis: Kaede grüne und rote Fluoreszenz zu mit FITC und PE Fluorophore Überschneidungen Kaede; Somit können nicht in Kombination mit Kaede Proteine FITC und PE-konjugierten Antikörpern verwendet werden.
  2. Laufen Sie nach der Färbung die Proben auf einem Durchflusszytometer. Alternativ, befestigen Sie die Zellen mit 2 % PFA.

9. Flow Cytometry Analysis

  1. Legen Sie die FITC (Kaede grün) und PE (Kaede rot) Kanal PMT Spannungen auf 70-80 % des gesamten Bereichs (zentrieren Bevölkerung um ungefähr 104) mit ex-Vivo Kaede grün oder rot Kaede einfarbige Splenocyten oder Blut.
    Hinweis: Kompensieren Sie nicht die Kaede grün (FITC) und Kaede rot (PE) Kanäle wie dadurch größere Signal verteilt wird.
    1. Um einfarbige Kaede Steuerelemente erstellen, eine Milz oder Blut aus Kaede-Tg Maus zu sammeln. Lyse der roten Blutkörperchen mit ACK-Puffer, dann die Zellen in zwei Gruppen unterteilen: unbekehrt Kaede grün und konvertierte Kaede rot.
    2. Für einfarbig Kaede auszusetzen rot-Steuerelemente, die Zellen in 1 mL PBS und Photoconvert in einer 24-Well-Platte für 5 min mit einem 405 nm Lichtquellen mit einer Leistung von 100 mW. Verwenden Sie diese Zellen einstellen von Kaede grün (FITC) und Kaede rote PMT Spannungen auf das Durchflusszytometer (Schritt 9.1).
  2. Sobald die Spannungen für die Kaede Proteine eingestellt wurde, für alle anderen Primärantikörper Flecken mit Single-Fluorophore beschriftet Entschädigung Perlen pro des Herstellers zu kompensieren.
  3. Laufen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometer, Daten zu sammeln.
    Hinweis: Das Protein Kaede wird kontinuierlich durch die Zellen produziert. Dies bedeutet, dass 24 h nach Ladungszustand, umgebaute Zellen werden doppelt positiv für Kaede grün und Kaede rot wie neu synthetisierte Kaede (grün) Protein in der Zelle angesammelt hat.
  4. Analysieren Sie die Daten mithilfe von FlowJo Software oder eine ähnliche Software.

Ergebnisse

Zuerst wollten wir replizieren Ladungszustand Ergebnisse veröffentlicht in der Literatur zu bewerten die Effizienz und die damit verbundenen Entzündung in der Maus Haut festzulegen. Der Ohr-Pinna 100 mW UV-Licht ausgesetzt war (405 nm) für 3 min33wie zuvor beschrieben. Einzelne Zellsuspensionen generiert aus dem Ohr Haut oder zervikalen dLNs unmittelbar nach der Exposition einen 78 % Wirkungsgrad von allen CD45 offenbart+ Leukozyten in der Haut mit ke...

Diskussion

Obwohl der Leukozyten Egress von peripheren, nicht-lymphatischen Geweben für die Initiierung und Auflösung der Immunantwort ankommt, sind die molekularen Mechanismen, die ausgehenden Regeln kaum erforscht. Diese Wissenslücke ist vor allem auf hohe Verfügbarkeit von Werkzeugen für die Quantifizierung in Vivo. Hier beschreiben wir die Verwendung von Photoconvertible Mäusen (Kaede-Tg) zu quantifizieren endogenen Leukozyten Austritt aus der Haut und Tumoren eine direkte Direktvergleich mit FITC-Lack in entzün...

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren möchten Dr. Marcus Bosenberg danken für die Bereitstellung YUMM 1.1 und 1.7 YUMM murinen Melanom Linien und Dr. Deborah J. Fowell für die Bereitstellung von B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr Mäuse im Einvernehmen mit RIKEN BRC durch nationale Bio-Ressource des MEXT, Japan.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Collagenase DRoche11088866001
DNaseRoche4536282001
Silver-LED-405B light source with optical fiber and collimtorPrizmatix LtdV8144
Fluorescein isothiocyanate isomer ISigma-AldrichF4274
dibutyl phthalateSigma-Aldrich524980
acetoneMacron Fine Chemicals2440-02
29-guage syringesExel International26029
Evans BlueSigma-AldrichE2129
70 um cell strainersVWR732-2758
paraformaldehydeSigma-AldrichP6148
HBSSCaissonHBL06
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitInvitrogenL34966
Purified Anti-mouse CD16/CD32Tonbo Biosciences70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418)Biolegend117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)BD Pharmingen562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11)Biolegend100341
APC CD8a (clone 53-6.7)TonBo Biosciences20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103116
BV650 CD19 (clone 6D5)Biolegend115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4)Biolegend128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8)Biolegend123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8)Biolegend127623
BV711 CD11b (clone M1/70)Biolegend101241
BV605 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103155
BV711 CD4 (clone RM4-5)BD Biosciences563726
Bovine serum albumin (Fraction V)Fisher ScientificBP1600-100
Anit-Rat and Anti-Hamster Igk / Negative Control Compensation Particle SetBD Biosciences552845
Fortessa Flow CytometerBD Biosciences
FlowJo v10 SoftwareFlowJo

Referenzen

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