Gemultiplexten fluoreszierende immunhistochemische Färbung, Bildverarbeitung und Analyse in histologischen Proben des Lymphoms

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für Multiplex-fluoreszierende immunhistochemische Färbung und imaging für die gleichzeitige Lokalisierung von mehreren Krebs-assoziierte Antigene in Lymphom. Dieses Protokoll kann für die NS1 Analyse von Biomarkern in allen Gewebeschnitte erweitert werden.

Zusammenfassung

Immunhistochemische (IHC) Methoden für die in-Situ -Analyse der Proteinexpression durch Lichtmikroskopie sind ein mächtiges Werkzeug für Forschung und Diagnostik. Die Visualisierung und Quantifizierung von mehreren Antigenen in einem einzigen Gewebe-Abschnitt mit konventionellen chromogenen IHC ist jedoch anspruchsvoll. Gemultiplexten Bildgebung ist besonders relevant in der Lymphom-Forschung und Diagnostik, wo Markierungen im Rahmen einer komplexen Tumor Mikroumgebung interpretiert werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für Multiplex fluoreszierende IHC Färbung um die quantitative Bewertung der mehrere Ziele in bestimmten Zelltypen des Interesses an Lymphom zu ermöglichen. Die Methode umfasst Aspekte der Antikörper-Validierung, Antikörperoptimierung, die Multiplex-Optimierung mit Markern der Lymphom-Subtypen, die Färbung des Gewebes Microarray (TMA) rutschen und das Scannen von Dias, gefolgt von Datenanalyse, mit spezifischen Verweis auf Lymphom. Mit dieser Methode werden Noten für beide die mittlere Intensität der Marker für die Zinsen und die prozentuale Positivität generiert, um Quantitative Analyse weiter zu erleichtern. Multiplexen minimiert Probe Auslastung und bietet interessante räumliche Informationen für jede Markierung.

Einleitung

Lymphoide Neubildungen entstehen durch das unkontrollierte maligne Proliferation von Lymphozyten. Diese Zellen sind wichtige Komponenten des Immunsystems und die primäre und sekundäre immun Organe wie Knochenmark, Lymphknoten, Milz und anderen Mukosa-assoziierten lymphatischen System zu lokalisieren. Lymphatischen Tumoren bilden eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, die eingestuft werden, basierend auf einer Konstellation von Features, einschließlich Morphologie, Immunophenotype, genetischen Eigenschaften und klinische Präsentation. Während jeder Parameter eine Rolle spielt, bleibt ein bezeichnendes Merkmal Abstammung und bildet die Grundlage für das Klassifikationssystem der WHO, das Neubildungen abgeleitet von B-Zellen, T-Zellen und natürlichen killer (NK) Zellen¹erkennt.

Entscheidend für die Einstufung des Lymphoms ist die Charakterisierung von Antikörpern gegen Leukozyten Oberflächenmarker der verschiedenen Untertypen von Lymphozyten²gewesen. Immunhistochemie (IHC) ist traditionell für die Analyse solcher Marker benutzt worden und basiert auf dem Prinzip der spezifischen Antigen-Antikörper-Anerkennung, Zell- und gewebebasierten Moleküle erkennen, die durch das Lichtmikroskop ^{visualisiert werden können 3}. die Identifizierung von mehreren Zielen auf eine einzelne Folie durch konventionelle Hellfeld chromogene multiplex IHC hat jedoch Einschränkungen, da es oft schwierig, mehrere Farbsignale auf einem einzigen Gewebe zuverlässig zu unterscheiden ist – vor allem für Antigene mit sehr geringe Expression⁴. Visuelle Beurteilung und Quantifizierung der Färbung auch kann subjektiv, Variabilität in der Analyse und Interpretation⁵verursachen.

Deshalb ist herkömmlichen IHC auf Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Proben nicht möglich für die simultane Detektion von mehreren Zielen bei immunologisch unterschiedlichen Erkrankungen wie Lymphom. Darüber hinaus ist die Unterscheidung neoplastischer Lymphozyten aus den umliegenden Immunzellen oft ungenau. Dies behindert den Studien über die Relevanz der neue Biomarker Lymphom. In diesem Zusammenhang multiplex fluoreszierende IHC (mf-IHC) bietet eine viel versprechende Alternative, da die quantitative Bewertung von Antigen Coexpression und eine räumliche Beziehung mit höherer Präzision bei gleichzeitiger Einsparung von begrenzt^6,Proben^7. Wenn diese imaging-Technologie eine mit der digitalen Bildanalyse-Software Partnerschaft ist, die Interpretation der Daten ist effizienter gestaltet und erleichtert das Studium der Tumor und Mikroumgebung Heterogenität^8,9. In diesem Protokoll eine Tyramide-basierte Immunfluoreszenz (IF) multiplexing-Verfahren wird angewendet, um das Signal zu verstärken und ist kompatibel mit jedem IHC validiert Antikörper aus jedem Wirtsarten, auch diejenigen entwickelt, die in der gleichen Spezies^{5,7 , 10}. Tyramide-basiertes Protokoll ermöglicht die direkte Konjugation der Fluorophor des Gewebes von Interesse, dass die primäre und sekundäre Antikörper nach jedem Schritt, die sequenzielle Anwendung mehrere Flecken entfernt werden kann ohne Antikörper Kreuzreaktivität.

Eine gebündelte Strategie wird für die Vorhersage Prognose und Behandlung Ergebnisse durch die Identifizierung von Zielen und deren Variante immunologischen Muster in Lymphome nützlich sein. Multiplex-Leuchtstofflampen IHC angewendet wurde in unserem Labor für die Studie eines Panels von T- und B-Lymphozyten und T-follikulären Helfer Marker Angioimmunoblastic T-Zell-Lymphom (AITL), ein Subtyp des eine periphere T-Zell-Lymphom zeichnet sich durch aggressive klinische Verhalten und Tumor Heterogenität¹¹. Der Nutzen dieser Methode zeigt auch diffuse große B-Zell-Lymphom (DLBCL) wo die erhöhte Signalisierung eines B-Zell-Rezeptors mit gleichzeitiger C-MYC und BCL-2 Ausdruck den möglichen therapeutischen Einsatz von Brutons Tyrosin-Kinase Hemmung schlägt ¹² .

Hier beschreiben wir das gesamte Protokoll von Antikörper-Validierung, die Auswahl der angemessenen Kontrolle Gewebe und Multiplexen mit Lymphom FFPE Gewebe, mit einer späteren Analyse der gefärbten Folien mit einer Scan-automatisierte quantitative Pathologie Bildgebung System.

Protokoll

Alle Gewebe, die in diesem Protokoll verwendeten erhielten unter dem Singapur NHG Domain spezifische Review Board B 2014/00693 zu studieren.

1. Auswahl und Validierung von Antikörpern

Hinweis: Bevor Sie mit der Einsetzung einer Multiplex, sicherstellen Sie, dass alle Antikörper robust, Färben nur das Ziel-Antigen des Interesses zu identifizieren. Ziel ist es, Antikörper, die spezifisch das Antigen des Interesses an Gewebeschnitten erkennen, wählen.

1. Bestätigen Sie für einen Antikörper mit einem etablierten Forschungszwecken oder klinischen Routineeinsatz in IHC Bedingungen wie Epitop Retrieval und Antikörper Verdünnung durch konventionelle IHC^5,13 auf positive und negative Kontrollgewebe ausführen Abschnitte. Gewebeschnitte menschlichen Ursprungs sicherstellen Sie, dass die entsprechenden Ethik-Abstände vor Einleitung Experimente sind.
   Hinweis: Positivkontrollen sind Gewebe, die das Antigen von Interesse zum Ausdruck bringen sollen und Negativkontrollen sind diejenigen, die dies nicht tun. Gutartigen Tonsillen Gewebe wird als eine gute Gewebekontrolle für Lymphom Antigene gewählt, weil es eine Mischung aus Immunzellen einschließlich B-Zellen, T-Zellen, sowie Antigen-präsentierenden Zellen und Stromazellen und epithelialen Zellen enthält. Letztere dienen als nützliche interne Negativkontrollen.
2. Für unbekannte Ziele oder für kommerzielle Antikörper mit unzureichender veröffentlichten Daten validieren Antikörper durch die Schaffung von aufeinander abgestimmten Positive und negative Kontrolle FFPE Zelle blockiert¹⁴, mit CRISPR-Knock-Out oder SiRNA Knock-down Antigen des Interesses in einer entsprechenden Zelllinie durch standard molekularbiologischen Methoden. Verwenden Sie diese Proteinkinase Zelle Blöcke anstelle von positiven und negativen Kontrolle Gewebe für konventionelle IHC gemäß Schritt 1.1.
   Hinweis: HeLa oder 293T Zellen werden häufig verwendet für Antigene, die nicht Zelltyp spezifisch, wie Lymphom Zelllinien schwer zu transfizieren sind. Für Antigene, die Lymphozyten spezifische sind, Lymphom Zelllinien mit virale Transduktion oder Elektroporation als gen Lieferart (wenn auch mit geringer Wirksamkeit) einsetzbar.

2. planen die Reihenfolge der Antikörper und Fluorophore für Multiplex-Panel

1. Planen Sie die Abfolge von Reagenzien für die endgültige Multiplex-Färbung. Zum Beispiel wurde hier die Sequenz für die Multiplex-Protokoll zunächst als erstes, Bcl-6 geplant; Zweitens, Bcl-2; Drittens: C-Myc; vierte, CD20; Fünftens: Ki67.
   Hinweis: Um über die Reihenfolge entscheiden, sollten Antikörper mit einer schwachen Affinität erfordern höhere Konzentrationen zuerst in die endgültige multiplex Färbung gefärbt werden. Hohe Affinität Antikörper, die resistent gegen mehrfache Umläufe der Mikrowelle abstreifen dürften gelten zuletzt im Multiplex-Protokoll, unspezifische Färbung zu vermeiden.
2. Planen Sie den Fluorophor-Partner für jeden Antikörper in der Systemsteuerung. Siehe Tabelle 1 und Tabelle der Materialien für die Entscheidungen in diesem Beispiel.
   Hinweis: Um auf der Fluorophor-Partner für jeden Antikörper entscheiden, wählen Sie spektral unterschiedliche Fluorophore für Antikörper mit ähnlichen Mustern der Lokalisierung innerhalb der Zelle und Gewebe. Dies minimiert die spektrale Überlappung und Schwierigkeit mit entmischen.

(3) Monoplex-Tyramide-basierte wenn in einem simulierten 5-Plex Multiplex-Panel

Hinweis: In diesem Beispiel wird das Protokoll für CD20 diskutiert, als der vierte Antikörper in einer Multiplex-Sequenz, die oben beschriebenen geplant ist. Die Anzahl der zusätzlichen abstreifenden Schritte wird für die Position des Antikörpers in der Sequenz unterscheiden.

1. Geschnitten Sie 3 µm dünne Abschnitte der positive und negative Kontrollgewebe mit einem Mikrotom und die Abschnitte auf Poly-L-Lysin-beschichtete Glasobjektträger.
2. Wachsentfernung in den Abschnitten, die durch eine entsprechende Clearing-Lösung 3 X 4 min. Rehydrieren Sie Folien in 100 % Alkohol, 90 % Alkohol und 70 % Alkohol, 4 min. Legen Sie die Folien in destilliertem Wasser für 2-3 min.
3. Legen Sie die Folien in einem Mikrowellenherd geeignet Glas in einem standard Antigen-Retrieval-Puffer (im Handel erhältlich) um die Folien zu tauchen. Durchführen Sie Hitze-induzierte Epitop Retrieval (HIER) mit Hilfe einer geeigneten Mikrowelle in pH9 Antigen-Retrieval-Lösung bei 98 ° C für 25 min.
   Hinweis: Jede Mikrowelle mit einem Druck von 800-1.100 Watt eingesetzt werden und HIER entsprechend optimiert werden. In diesem Fall diente ein multifunktionale Mikrowelle Gewebe Prozessor (open Air) für HIER und Abisolieren. Die Grundeinstellungen für den Abruf einer bestimmten Epitops basieren auf den Vorkenntnissen aus konventionellen IHC.
4. Führen Sie weitere Runden der Mikrowelle abisolieren (drei in diesem Fall, für den vierten Antikörper in einem Panel), jede Runde mit 100 % Leistung auf 98 ° C und 20 % Leistung für 10 min auf die gleiche Temperatur zu halten. Die Folien in destilliertem Wasser für mindestens 10 Minuten abkühlen.
   Hinweis: Führen Sie mehrere Runden der Mikrowelle entkleiden während der Monoplex IF Schritt auf das Ziel-Antigen auf die gleiche Anzahl von Heizung Schritte wie in der vorgeschlagenen Multiplex aussetzen. Da CD20 als der vierte Antikörper ansteht, Mikrowelle abisolieren, 3 X vor und einmal nach der primären Antikörper Inkubationszeit zu tun.
5. Überprüfen Sie und ergänzen Sie den Puffer nach alle 5 Minuten während zusätzliche Mikrowelle abisolieren. Lassen Sie wichtig ist, nicht Folien während der mehrere abstreifenden Verfahren austrocknen. Wenn Sie die Folien aus der Mikrowelle nehmen, verwenden Sie Zange und hitzebeständige Handschuhe, um sie in ein separates Gefäß von destilliertem Wasser zu platzieren. Warten Sie, bis die Antigen Retrieval Lösung natürlich abkühlen lassen.
6. Die Gewebe-Peroxidase-Aktivität mithilfe eines kommerziellen Peroxidase Blocks für 10 min blockieren (3 % Wasserstoffperoxid kann als eine alternative Reagenz verwendet werden). Waschen Sie mit Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) und nichtionische Reinigungsmittel für 5 Minuten.
   Hinweis: TBS besteht aus 50 mM Tris-Cl, pH 7,5 und 150 mM NaCl.TBS TBS-d herstellt.
7. Block mit Antikörper Verdünnungsmittel oder Rinderserumalbumin für 15 min, gefolgt von Inkubation mit dem primären Antikörper von Interesse (z.B.CD20, 1:2,000 Verdünnung in Antikörper Verdünnungsmittel, siehe Tabelle of Materials) bei Raumtemperatur für 30 min. Waschen 3 X mit TBS-D Puffer für 5 min jedes Mal. Es sollte ausreichend TBS-D-Puffer, die Folie vollständig in alle Waschschritte einzutauchen.
   Hinweis: Bovine Serum Albumin kann als Alternative Antikörpers Verdünnungsmittel verwendet werden. Das Volumen der Antikörper Verdünnungsmittel hängt von der Größe des Gewebes, von 50 µL (für Biopsie Proben) bis hin zu 400 µL (für Exzision Proben oder Gewebeproben Microarray).
8. Mit einer entsprechenden Meerrettich-Peroxidase (HRP) inkubieren-markierten Sekundärantikörper, gewählt auf der Grundlage der Arten der Ursprung des primären Antikörpers für 15 min bei Raumtemperatur. 3 X mit TBS-D Puffer für 5 min jedes Mal zu waschen.
9. Wenden Sie einer entsprechenden Tyramide-basierte fluoreszierende Reagenz (1: 100 bei Verstärkung Verdünnungsmittel an) und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min, um Fluorophor Konjugation, die Gewebeprobe an den Standorten der primären Antikörper-Bindung zu ermöglichen. 3 X mit TBS-D Puffer für 5 min jedes Mal zu waschen.
10. Führen Sie eine zusätzliche mikrowellenbasierte abstreifen, um die primären und sekundären Antikörper zu entfernen. Wiederholen Sie ggf. anhand der Position des Antikörpers in der Sequenz.
11. Legen Sie die Folie in destilliertem Wasser abkühlen lassen. 10 min, gefolgt von Waschanlagen mit DAPI (1: 100 Verdünnung in Antikörper Verdünnungsmittel) inkubieren 3 X mit TBS-D Puffer für 5 min jedes Mal. Trocknen Sie den Bereich auf der Folie ohne das Gewebe mit Tüchern und befestigen Sie die Folie mit entsprechenden Montage Medien.
12. Bild die Folie (siehe Abschnitte 6 und 7 dieses Protokolls) und die Angemessenheit der Färbung (definiert durch klare Diskriminierung des Gewebes positive und negative Kontrolle) zu bestimmen.
    Hinweis: Wenn die Färbung Muster falsch ist, wiederholen Sie die Monoplex Färbung nach der Anpassung eine oder mehrere der folgenden Parameter: die Anzahl der Hitze abrufen Schritte, die Menge an Wärme abrufen, die Inkubation Zeitraum/Konzentration von Antikörpern (primäre und (sekundär), die Position der Antikörper in der Sequenz und die Wahl der Fluorophor. Die Monoplex Färbung Schritt in der Regel erfordert mehrere Runden der Optimierung eine Reihe geeignete Parameter für die entsprechende Färbung zu erhalten. Es ist ratsam, eine Reihe von Fluorophore mit jedem Primärantikörper zu testen, wie diese Flexibilität bei der Entscheidung über die endgültige Multiplex-Gruppe zur Verfügung stellt.

4. Wiederholung der Monoplex für jeden Antikörper im Multiplex-Protokoll

1. Die Monoplex Färbung für die anderen Antikörper in ähnlicher Weise durch Anpassung der Anzahl der Mikrowelle Abisolieren Schritte, basierend auf der Position des Antikörpers in der Reihenfolge zu wiederholen. Beispielsweise bei Monoplex Färbung für den dritten Antikörper in einem sechs-Plex Multiplex-Panel, führen Sie zwei Mikrowelle abstreifenden Schritte vor und drei Mikrowelle abstreifenden Schritte nach der Primärantikörper Inkubation.
   Hinweis: Es ist wichtig zu verstehen, dass die mikrowellenbasierte Abisolieren von Antikörpern auch die Probe HIER macht. Wenn ein spezifischer Antikörper eine anderes Epitop Retrieval Strategie erforderlich ist, muss dies berücksichtigt werden, wenn die Multiplex-Reihenfolgeplanung. In diesem Beispiel erfordert Ki67 Epitop Retrieval pH 9, 30 min. lang. Da 25 min. von HIER vor dem getan wird KI67 Färbung im sequenziellen Protokoll, nur eine zusätzliche 5 min HIER sind erforderlich.

(5) Multiplex Färbeprotokoll

Hinweis: Fahren Sie mit dem Multiplex Färbeprotokoll erst, nachdem alle Komponenten mit Monoplex wenn Färbung optimiert wurden. Überprüfen Sie die Ergebnisse der Monoplex Färbung und entwerfen Sie eine Tabelle mit den finalen Layout des Ordens Multiplex und die Wahl der Fluorophor für jeden Antikörper zu. Die Details der Antikörperkonzentration ist die Dauer der Färbung, und die Reihenfolge und Art der Wärme-Abruf für jeden Antikörper verwendet hier in Tabelle 1zur Verfügung gestellt.

1. Schnitt 3 µm dünne Abschnitte der positive und negative Kontrollgewebe, sowie als das Zielgewebe von Interesse (hier: FFPE-Proben von Lymphomen), mit ein Mikrotom und legen in den Abschnitten auf Poly-L-Lysin-beschichtete Glasobjektträger (siehe Tabelle der Materialien).
   Hinweis: Einbeziehung der positiven und negativen Kontrollen für jeden Antikörper im Panel ist ratsam, zusammen mit den eigentlichen Proben für Multiplex. Dies ermöglicht eine Bestätigung, dass die Färbung Protokoll korrekt ausgeführt wurde.
2. Wachsentfernung, Hitze-induzierte Epitop Retrieval (HIER) durchführen und Gewebe Peroxidase-Aktivität wie in den Monoplex Protokoll Schritten 3.3-3.5 blockieren.
3. Mit dem ersten primären Antikörper der optimierten Multiplex-Sequenz, wie bereits anhand den Monoplex IF Schritt inkubieren. In diesem Beispiel BCL-6, bei einem 01:30 Verdünnung in Antikörper Verdünnungsmittel bei Raumtemperatur für 60 min (siehe Tabelle der Materialien), war der erste Schritt des Multiplex-Protokolls. Mit TBS-D Puffer für 5 min waschen.
4. Inkubieren mit eine geeignete HRP radioaktiv markierten Sekundärantikörper basierend auf die Spezies des primären Antikörpers verwendet in der vorherigen Schritt (siehe Tabelle der Materialien), bei Raumtemperatur für 10 min. Waschen mit TBS-D Puffer für 5 Minuten.
5. Gelten Sie das optimierte Tyramide ansässige fluoreszierende Reagenz (Cy5 in diesem Beispiel 1: 100 in Verstärkung Verdünnungsmittel, siehe Tabelle der Materialien) mit Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Nach der Inkubation mit TBS-D Puffer für 5 min waschen.
   Hinweis: Die Wahl des Tyramide-basierte fluoreszierende Reagens auf die optimierte Monoplex wenn basiert.
6. Überprüfen Sie die Effizienz der Färbung von den ersten Antikörper mit einem geeigneten Mikroskop (siehe Tabelle der Materialien).
   Hinweis: Interim bildgebende Kontrollen kann mit Leichtigkeit durchgeführt werden, wenn die Probe eine TMA oder einzelne Folie. Wenn jedoch der Fleck auf mehreren Folien ausgeführt wird, möglicherweise unpraktisch, und dieser Schritt kann ausgelassen werden.
7. Führen Sie die Mikrowelle stripping für den zweiten Antikörper in das Protokoll mit Hilfe von Bedingungen in der Monoplex-Schritt optimiert. Dann fahren Sie mit der Färbung des zweiten primären Antikörpers (in diesem Fall BCL2) mit dem HRP-markierten Sekundärantikörper und Tyramide-basierte fluoreszierende Reagenz (520, siehe hier, Table of Materials). Überprüfen Sie die Effizienz der Färbung unter dem Fluoreszenz-Mikroskop nach dem Abschluss der zweiten Runde der Färbung.
8. In ähnlicher Weise wiederholen Sie den Vorgang mit dem dritten, vierten und fünften Antikörper in der Sequenz (hier, c-Myc, CD20 und ki67, bzw. mit Fluorophore 570, 540 und 620, beziehungsweise). Durchführen Sie bildgebende Kontrollen zwischen jedem Schritt, wenn möglich.
9. Fügen Sie einer nuklearen Gegenfärbung (DAPI, 1: 100 Verdünnung in Antikörper Verdünnungsmittel) für 10 min hinzu und dann waschen Sie 2 X in TBS-D für 5 Minuten.
10. Montieren Sie die Folien mit einer entsprechenden Montage-Reagenz.

6. Vorbereitung der spektralen Bibliothek Folien

Hinweis: Abschnitte 6 bis 8 dieses Protokolls sind einzigartig für Multiplex Experimente, die mit einer spektralen Kamera abgebildet werden.

1. Erstellen Sie Bibliothek Folien (Single-Fleck Referenzbilder) für jede Fluorophor, DAPI und Autofluoreszenz auf der gleichen Kontrollgewebe für Multispektrale Bildanalyse verwendet werden.
   1. Schneiden Sie 2 x 3 µm dünne Abschnitte der Gewebetyp des Interesses (hier, Lymphom Muster oder ein Tonsillen als Kontrolle) ein Mikrotom mit und legen Sie in den Abschnitten auf Poly-L-Lysin-beschichtete Glasobjektträger.
   2. Verfahren sowohl gleitet über das Monoplex-Protokoll (mit allen Abisolieren und Waschschritte), aber ohne Antikörper oder Fluorophor Zusatz.
   3. Fleck mit DAPI gemäß Schritt 5.9 ein und lassen eine Folie (für die Generation des Gewebes Autofluoreszenz Spektrums) ungefärbt.
      Hinweis: Die optimierte Monoplex-Folien (mit einem einzigen Fluoreszenz-Farbstoff, ohne DAPI) als spektrale Bibliothek Folien lässt sich um jede Fluoreszenz-Farbstoff-Spektren zu erzeugen.
2. Scannen Sie diese Gruppe von Folien mit entsprechenden Filtern und in die Bild-Analyse-Bibliothek hochladen.

(7) spectral Imaging

1. Scannen von Dias monoplex
   1. Wählen Sie die Filter aus verfügbaren standard Epi-Fluoreszenz Filter (DAPI, FITC CY3, Texas Red und CY5) für die Beschäftigten Fluorophor geeignet.
      Hinweis: Die empfohlenen Filter-Würfel für spezifische Fluorophore, die in diesem Beispiel verwendet werden in Tabelle 2-¹⁵angezeigt.
   2. Prüfen Sie jedes Zeichen in seinem entsprechenden Fluoreszenz-Kanal, eine geeignete Belichtungszeit ein klares Signal zu identifizieren. Konzentrieren Sie sich auf die Gewebe-Komponente, die das stärkste Signal für den Marker haben soll.
   3. Bestimmen Sie eine feste Belichtungszeit für jeden Analyten (Antikörper-Fluorophor Kombination), um einen Kreuz-Probe Vergleich Pixel Intensität (obwohl einige Handelsplattformen Normalisierung Strategien, um Unterschiede in der Exposition zu berücksichtigen haben).
      1. Um über eine feste Belichtungszeit für einen bestimmten Kanal zu entscheiden, verwenden Sie eine live-Kamera-Einstellung anpassen die Belichtungszeit bis in das live-Kamera-Bild gibt es keine überbelichteten Bereichen, und wiederholen Sie dies für alle Kanäle.
   4. Nach dem Scannen der Monoplex-Folien erzeugen simulierten Hellfeld Bilder (wenn die Funktion in der Software verwendet wird), mit dem normalen IHC-Muster visuell zu vergleichen und um festzustellen, ob die Färbung Muster korrekt (Abbildung 1 und Abbildung 2 ist ).
2. Scannen von Multiplex-Proben (TMA Folien / mehrere Proben)
   1. Richten Sie die optischen Parameter wie beschrieben für das Scannen von Monoplex Bilder (Schritt 6.1). Erstens, stellen Sie den Fokus manuell oder automatisch (folgen Sie den Anweisungen des bestimmten Bildes Scan-Maschine). Zweitens stellen Sie die Belichtungszeit für jeden fluoreszierende Kanal um sicherzustellen, dass alle Kerne auf einem TMA oder alle Bereiche in einer Folie entsprechend ausgesetzt sind.
      Hinweis: Der Bereich ausgewählt, um die Belichtungszeit einstellen ist wichtig. Benutzer müssen die stärkste Signal-Region für jeden Filter wählen (d.h.das Ki67-Signal ist stärker in den Tonsillen germinal Mittelbereich als im nongerminal Zentrum-Gebiet, daher sollte die Benutzung der germinal Mittelbereich auf eine angemessene Belichtung eingestellt (Zeit). Benutzer können auch annehmen, eine Übersättigung-Korrektur-Funktion des imaging Systems falls vorhanden.
   2. TMA-Folien unter einem TMA-Scan-Modus, falls vorhanden in der imaging-System, mit einem entsprechenden Autofokus-Algorithmus zu scannen.
   3. Erhalten Sie für ganze Gewebekapitel rutschen die Folien bewertet von qualifizierten Pathologe, optimale Bilder aus den repräsentativsten Tumor Bereichen auszuwählen.
      Hinweis: Die hier beschriebene Protokoll basiert auf einem definierten Mikroskopbild/Analyse-System (siehe Tabelle der Materialien). Es gibt andere Maschinen und Bildanalyse-Software, die kann scannen und analysieren Multiplex-IHC-Folien-⁷.

8. die Datenanalyse

1. Preanalysis Bewertung und Planung
   1. Anhand der Referenz-Folie für Autofluoreszenz Autofluoreszenz aus den Bildern gescannt für die Analyse zu subtrahieren.
   2. Überprüfen Sie die Bilder vor der Analyse zu gewährleisten, dass sie im Mittelpunkt stehen und ohne Färbung Artefakte.
   3. Einen Tumor-Marker (z.B.CD20 in diesem Beispiel) verwenden, um Zellen von Interesse zu identifizieren und zum Fortsetzen der Zelle Segmentierung, scoring und Chargenanalyse nähert. Wählen Sie CD20-positiven Zellen für die Analyse.
      Hinweis: zum Beispiel in der DLBCL Proben analysiert hier, die Einstellung und die Parameter, die definiert sind, für Zelle Segmentierung basieren auf Kerngröße und Intensität sind aber speziell für die Bildanalyse-Software verwendet (z.B., bedeuten eine DAPI Pixel Intensität bei mindestens 0,05; Größe zwischen 80-320 Pixel mit einer Spaltung Empfindlichkeit bei 2 [Dies ist ein Software-spezifische Parameter der stützt sich stark auf die Morphologie des Tumors: für kleine Tumorzellen, Aufteilung von 0,7 - 1 ist geeignet, für große Tumorzellen teilen eingestellt werden zu 4]).
   4. Anfrage für qualifizierte Pathologen, einzelne Bilder zu überprüfen und entscheiden, ob Gewebe Segmentierung erforderlich ist, um die Tumorzelle wählen bereichert und ausschließen Regionen mit Nekrose Arearegion Orand reichlich reaktiven Zellen. Wenn zusätzliche Gewebe Segmentierung erforderlich ist, dann wählen Sie geeignete Regionen (z. B. Tumor Zellen/Stroma/Nekrose) und überprüfen Sie, ob die Bildanalyse-Software korrekt solche Regionen identifizieren können
   5. Fahren Sie mit Zelle Segmentierung nach Gewebe Segmentierung (falls vorhanden), verlangen eine qualifizierte Pathologe, die Zelle-Segmentierung-Karte, um die Treue der beabsichtigten Segmentierung zu gewährleisten überprüfen Ansatz⁵.
   6. Bestimmen Sie die biologisch/klinisch geeignete Methode der Analyse für einen bestimmten Biomarker von Interesse (z. B.Prozentsatz Positivität oder mittlere Intensität pro Zelle).
   7. Wählen Sie einen Cut-off-Wert für jede Markierung (für Prozentsatz Positivität).
   8. Bestimmen Sie den optischen Intensität positive Cut-off-Wert für jede Markierung in Verbindung mit einem Pathologen. Histogramme analysiert die Häufigkeitsverteilung der Marker Intensität/Zelle in geeignete Statistik-Software zu generieren (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: Eine Intensität Wert Histogramm bieten einen Überblick über die Verteilung der Signalintensitäten.
   9. Bestimmen Sie eine ungefähre Cut-off aus dem Histogramm und überprüfen Sie dies mit einem Pathologen Review, mit manuell bestimmt Cut-Offs auf ausgewählte Bilder zu korrelieren. In manchen Situationen eine einheitliche single Cut-off werden nicht möglich aufgrund der Variabilität in der Färbung und eine manuelle Grenzwert für jede Probe wird erforderlich sein.
      Hinweis: Abschnitt 8.1 sollte Bildanalyse-Software durchgeführt werden (siehe Tabelle der Materialien) sofern nicht anders angegeben.
2. Positive und negative Zellen markieren
   1. Für jedes Zeichen von Interesse nach der Cut-off-Zahl bestimmt (durch Histogramme oder manuell), verwenden Sie eine "IF" oder ähnliche Logik Formel anlässlich der positive und negative Zellen mit Wert markierten: die Nummer 1 für positive Zellen, Nummer 0 für negative Zellen.
   2. Multiplizieren Sie für die Positivität der Marker den markierten Wert der einzelnen Marker (entweder 1 oder 0) mit den Produkten in separaten Spalten. Wenn das Produkt gleich 1 ist, bedeutet dies, dass die Zelle für alle Marker positiv ist. Verwenden Sie für die Positivität und Negativität einer bestimmten Markierung einen IF-Logik-Algorithmus.
      Hinweis: Abschnitt 8.2 in Statistik-Software getan werden muss (siehe Tabelle der Materialien).
3. Prozentsatz und numerischen Daten mit Hilfe einer Pivot-Tabelle erzeugen
   1. Daten der Prozentsatz für spezifische Marker des Interesses innerhalb der definierten Zellen (z.B., CD20-positiven Zellen oder CD20-negativen Zellen) zu generieren (Abbildung 6).
   2. Legen Sie eine Pivot-Tabelle in dem Datenblatt.
   3. Zur Berechnung des Anteils der Positivität eines einzigen Marker wie CD20, wählen Sie die Summe -Funktion unter den " Wert "-Teil der Pivot-Tabelle die Gesamtanzahl von CD20-positiven Zellen aus der Summe der dem CD20⁺ Zellen geteilt durch die insgesamt Handynummer. Das Ergebnis ist die CD20⁺ Zelle Prozentsatz innerhalb eines Kerns oder einer Studie Anzahl (hängt von der Auswahl der Pivot Tabellenzeile).
   4. Berechnung des Prozentsatzes der Positivität mehrere Marker mit der gleichen Methode (Abbildung 3).
   5. Numerische Daten zu generieren. Extrahieren Sie die mittlere normalisierte Graf für jede Markierung von jeder Kern oder jede Studie Zahl durch den Erwerb der mittleren Intensität der einzelnen Marker von Interesse in allen Zellen, die innerhalb einer Probe (Abbildung 4) studierte.
      Hinweis: Der mittlere Wert kann nicht in der Pivot-Tabelle direkt abgeleitet werden. Mit dieser Formel abgeleitet werden: MEDIAN (IF (Spalte Studie Zahl = spezifische Studie Reihe, Spalte der normalisierte Wert)).
4. Die Daten in einem geeigneten Graphen Plotten
   1. Zeichnen Sie die Ergebnisse der Prozentsatz Positivität oder mittlere Intensität pro Marker in einem Zelltyp des Interesses in geeigneter Weise für weitere statistische Tests und Präsentation.
   2. Punkt plottet eine Visualisierung von Zahlen und Verteilung zu erstellen.
      Hinweis: Die Darstellung von Daten mit Balkendiagramme Informationen über Verteilung nicht vermitteln. Schätzung Grundstücke werden auch als eine gute Methode zur Darstellung der Daten, mit Schwerpunkt auf das Ausmaß des Unterschieds zwischen Proben¹⁶empfohlen.

Ergebnisse

MF-IHC-Bilder für eine DLBCL Probe mit C-MYC und BCL2-gen-Umlagerung (Doppel-Hit Lymphom) sind in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 veranschaulicht die simulierten Hellfeld immunhistochemische Bilder. Abbildung 3 zeigt die Generation der Prozentsatz Daten. Abbildung 4 zeigt die Details einer medianen Formel für die Erzeugung von numerischen Daten.

Diskussion

MF-IHC hat das Potenzial, Pathologen, Diagnosticcriteria in lymphatischen Pathologie zu verfeinern und Analyse die Rolle von Biomarkern in bestimmten Zelltypen in Richtung einer Vorhersage des klinischen Ergebnisses ermöglichen. Als eine neue Forschungsmethode ist mf IHC zunehmend auf die quantitative und räumliche Identifizierung von mehreren Immunparameter Tumor Zellen¹⁷angewendet. Die Erkennung von mf-IHC Co Ausdruck der Tumor Biomarker hat sich gezeigt, reproduzierbare und zuverlässige

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody diluent	DAKO	REF S3022	Blocking
Peroxidase Blocking Solution	DAKO	S2023	For peroxide blocking
Vectra multispectral automated microscope	Perkin Elmer	Vectra2.0.8	Spectral imaging
absolute Ethanol	EMSURE	1.00983.2500	Ethyl alcohol for rehydration
Amplification Diluent	PERKIN ELMER	FP1135	Fluorophore diluent buffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled	PERKIN ELMER	NEF822001EA	Secondary antibody
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled	PERKIN ELMER	NEF812001EA	Secondary antibody
BCL2	DAKO	clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)	primary antibody
BCL6	LEICA	NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)	primary antibody
CD20	DAKO	Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)	primary antibody
c-MYC	ABCAM	Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658)	primary antibody
Cy 5	PERKIN ELMER	FP1171	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Graphpad Prism 7	Graph pad		Statisitcal software
HistoClear Clearing Agent	SIGMA	H2779-1L	Histoclear for dewaxing and clearing
inForm Advanced Image Analysis Software	Perkin Elmer	Inform Software 2.2.1	Data Analysis software
KI67	DAKO	Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)	primary antibody
KOS MILESTONE multifunctional tissue processor	Milestone		Microwave for Heat induced epitope retrieval
Microwave	PANASONIC	NN-ST651M	Microwave stripping
Mowiol	SIGMA ALDRICH	81381 Aldrich Mowiol® 4-88	mounting media
Opal 570	PERKIN ELMER	FP1488	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal520	PERKIN ELMER	FP1487B21	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal540	PERKIN ELMER	FP1494	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal620	PERKIN ELMER	FP1495	Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Poly-L-lysine coated slide	FISHER SCIENTIFIC	120-550-15	Slide for tissue section adhesion in routine histological use
Spectral DAPI	PERKIN ELMER	FP1490	nucleic acid stain
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x)	DAKO	S2367	For HIER
Tris Buffer saline (TBS)	1st BASE	BUF3030 20X4L	for buffer wash
Tween 20	SIGMA ALDRICH	P1379-1L	Tween