Flash-NanoPrecipitation für die Kapselung der hydrophoben und hydrophilen Verbindungen in Polymeren Nanopartikel

Zusammenfassung

Flash-NanoPrecipitation (FNP) ist ein skalierbarer Ansatz, Polymere Kern-Schale-Nanopartikeln zu produzieren. Labormaßstab Formulierungen für die Kapselung der hydrophoben bzw. hydrophilen Therapeutika werden beschrieben.

Zusammenfassung

Die Formulierung einer therapeutischen Verbindung in Nanopartikeln (NPs) kann einzigartige Eigenschaften vermitteln. Für schlecht wasserlösliche Medikamente können NP Formulierungen verbessert Bioverfügbarkeit und Verteilung von Medikamenten im Körper ändern. Für hydrophile Substanzen wie Peptide oder Proteine kann Kapselung in NPs auch Schutz vor natürlichen Freiraum Mechanismen bereitstellen. Es gibt einige Techniken zur Herstellung von Polymeren NPs, die skalierbar sind. Flash-NanoPrecipitation (FNP) ist ein Prozess, der verwendet mischende Geometrien um NPs mit engen Größenverteilung und einstellbaren Größen zwischen 30 und 400 nm zu erzeugen. Dieses Protokoll beschreibt die Labormaßstab Produktion von Kern-Schale-Polymeren Nanopartikel eine Zielgröße mit FNP. Das Protokoll kann implementiert werden, um entweder hydrophile oder hydrophobe Verbindungen mit nur geringfügigen Änderungen zu Kapseln. Die Technik kann ohne weiteres im Labor in Milligramm Maßstab Bildschirm Formulierungen eingesetzt werden. Führen Treffer können direkt in Gramm und Kilogramm-Maßstab hochskaliert werden. Als einen kontinuierlichen Prozess beinhaltet skalieren mehr mischen Prozessdurchlauf Zeit anstatt Übersetzung ins neue Prozessbehälter. NPs produziert von FNP sind hoch belasteten mit therapeutischen, verfügen über ein dichtes stabilisierende Polymer-Pinsel und haben eine Größe Reproduzierbarkeit von ± 6 %.

Einleitung

Seit Ende der 1990er Jahre gab es eine stetige Zunahme der Zahl der klinischen Einsatz von Nanomaterialien^1,2. Das steigende Interesse spiegelt das Versprechen von Nanomaterialien, die Bioverfügbarkeit von hydrophoben Drogen zu verbessern und damit bevorzugte Ausrichtung innerhalb der Körper³. Polymeren Nanopartikel (bezeichnet als Nanopartikel oder NPs hier) sind einen wachsenden Anteil dieser Klasse von Materialien². NPs haben sammelte Interesse, weil sie sehr abstimmbare Eigenschaften wie Größe, Zusammensetzung und Oberfläche Funktionalisierung⁴haben. Bei der Anwendung auf die Verabreichung von Medikamenten schlecht löslichen haben NPs häufig eine Kern-Schale-Struktur, wo die therapeutischen ist gekapselt in der hydrophoben Kern und die Hülle besteht aus einem hydrophilen Polymer-Pinsel. Eine einfache Möglichkeit, diese Struktur generieren beschäftigt eine amphiphile Diblock Copolymers (BCP) bestehend aus einem abbaubaren hydrophobe Block, bildet Bestandteil der Partikel, und eine hydrophile Poly(ethylene glycol) (PEG) blockieren, bildet die Polymer-Bürste und sterische Stabilisierung^4,5vermittelt.

Nanoprecipitation ist ein verbreitetes Verfahren der Herstellung polymerer Nanopartikel, denn es ist einfach und nicht Energie intensive⁶. In seiner einfachsten Form beinhaltet Nanoprecipitation Ergänzung mit Pipette NP Komponenten in einem organischen Lösungsmittel wie Aceton, eine überschüssige Wasservolumen gerührt. Die Änderung im Lösungsmittel zu einer verdünnten wässrigen Lösung ergibt die Ausfällung von unlöslichen Kernkomponente. Der Stabilisator montiert auf diesem wachsenden Partikeloberfläche unter der Regie von Adsorption von den eingestürzten hydrophobe Block^7,8,9,10. Eine gleichmäßige Kornverteilung wird erreicht, wenn die Lösungsmittel und Wasser schnell mischen, um eine homogene Lösung zu bilden. Das Mischen ist langsamer als die Keimbildung und Montage der Komponenten führt zu einer größeren, mehr Polydisperse Partikel Bevölkerung. Obwohl leicht zugänglich für einen einfachen Test, der gerührten Batch-Ansatz führt zu große Variabilität durch Vermischung Inkonsistenz und ist nicht zugänglich, Scale-up-^6,11. Mikrofluidik entstanden als eine weitere Möglichkeit zur NP-Produktion, die kontinuierlich ausgeführt werden können. Diese Art der Produktion wurde vor kurzem von Ding Et Al. geprüft ¹¹ . Ein gemeinsamer Ansatz nutzt Laminar-Flow mit Schwerpunkt die Lösungsmittel Längenskala auf Sub-Mikrometer-Werte zu reduzieren. Mischen von der Antisolvent tritt durch Diffusion, so dass kleine Strömung Abmessungen entscheidend sind für gleichmäßigen Partikel^11,12zu gewährleisten. Parallelisierung von mehreren mikrofluidischen Kammern für Scale-Up ist problematisch für große Produktionsmengen.

Die schnelle Mischungsbedingungen, die einheitliche Nanoprecipitation in Mikrofluidik begünstigen können abwechselnd in engen, turbulente Strömungen hergestellt werden. Flash-NanoPrecipitation (FNP) beschäftigt mischende Sondergeometrien, diese Bedingungen unter höheren volumetrischen Flussraten als möglich mit Mikrofluidik zu erreichen. Einlass-Streams geben eine Mischkammer unter turbulenten Bedingungen, die zu der Generation von Wirbeln, führen, so dass Lösungsmittel/anti-solvent Lamellen auf der Längenskala Diffusion^11,13bilden. Dadurch wird die gleichmäßige Durchmischung auf einer Zeitskala, die kürzer als die Keimbildung und das Wachstum der therapeutischen erreicht. Die geschlossene Geometrie des Mischers erlaubt keinen Stream unter Umgehung der Region wo turbulente Energiedissipation auftritt und das gesamte System erfährt der gleiche Prozess Geschichte¹³. Keimbildung Auftritt einheitlich in der Mischkammer und Partikel Wachstum verläuft bis zum Stillstand von der Versammlung des BCP auf der Oberfläche^9,14. Gemischte Streams mit stabilen Partikeln kann dann verdünnt werden, mit zusätzlichen Antisolvent Ostwald unterdrücken Reifung der Partikel^15,16,17.

Ein geschlossenen auftreffenden Jet (CIJ) Mischer ist die einfachste Armaturendesign für FNP und erlaubt Mischen von zwei Bächen auf skalierbare und kontinuierliche Weise, wie in Figur 1A¹³dargestellt. Ein Multi-Einlass-Vortex-Mixer (MIVM) wurde entwickelt, um bis zu vier anderen Stream Eingänge ermöglichen dabei noch die schnelle Micromixing für einheitliche Partikelbildung erforderlich, wie in Abbildung 1 b¹⁸dargestellt. FNP ermöglicht einfache Formulierung-Screening, die großtechnische Produktion leicht übersetzt werden kann. Aufgrund der kontinuierlichen Natur des Prozesses erfordern größere Losgrößen keine Neubauten sondern eher mehr Laufzeiten, ermöglicht einfache Übersetzung Kilogramm-Maßstab-Produktion in der gleichen Ausrüstung-Zug.

Hydrophile Verbindungen wie Peptide und Proteine ("Biologika") können auch in einem Prozess als Inverse Flash NanoPrecipitation (iFNP) gekapselt werden. Die Technik erfordert eine amphiphile BCP wo einen Block ist hydrophob und der andere ist ein Polysäure¹⁹. Der erste Schritt besteht darin, schnelle Vermischung von ein Dimethyl Sulfoxid (DMSO)-Stream mit der biologischen und der BCP gegen lipophilen Lösungsmittel wie Dichlormethan oder Chloroform. Dies führt zur Bildung von Partikeln, die mit den hydrophoben Block Pinsel stabilisiert. Eine solche Architektur wird hier ein "umgekehrtes" NP bezeichnet werden. Der Kern enthält die Polysäure, die dann ionisch ist vernetzt mit einem multivalente kation. Dies stabilisiert die Partikel für die Verarbeitung in einer wässrigen Umgebung in Form von Mikropartikeln oder PEG-beschichteten Nanopartikel durch Techniken, die in der Literatur^19,20,21gemeldet wurden.

Dieses Protokoll kann für den Labormaßstab Herstellung von Polymeren Kern-Schale-Nanopartikeln Verkapselung entweder hydrophobe bzw. hydrophile Verbindungen eingesetzt werden. Die Unterabschnitte des Protokolls bieten Anleitungen zur Verwendung der beiden Mischer Klassen - CIJ und die MIVM. Der Leser sollte sich anpassen des Protokolls für neuartige Kernkomponenten und reproduzierbar generieren Nanopartikel mit einer gewünschten Größe mit dem entsprechenden Mixer für die Stream-Eingänge. Nachfolgend werden drei Beispiel-Formulierungen mit FNP und iFNP vorgestellt. Zwei beschäftigen CIJ Mixer und man benötigt die MIVM^15,22. Die erste Formulierung zeigt Kapselung eines Modells hydrophobe Verbindung durch FNP. Die zweite Formulierung zeigt Kapselung eines Modells hydrophile Verbindung durch iFNP in einem CIJ-Mischer. Die endgültige Formulierung enthält ein Beispiel für Protein Kapselung von iFNP mit einem MIVM. Das Protokoll für diese dritte Formulierung beschreibt die Verwendung von einer kleinräumigen, handheld MIVM bezeichnet "μMIVM." Das Armaturendesign ist kleiner für vereinfachte Formulierung Screening, ermöglichen aber die Skalierung Verhalten ist gut verstanden und der Mixer ist kein mikrofluidischen Gerät²². Der letzte Abschnitt des Protokolls enthält einige Hinweise zum Scale-Up von Blei Formulierungen im Screening identifiziert. Diese Formulierungen sind Access-Points für den Lernprozess und folglich verwenden nicht-abbaubaren Poly (Styrol) bestimmt-basierte Polymere. Alternative Stabilisatoren wurden in der Literatur mit einer Reihe von biokompatiblen kommerzielle Optionen verfügbar^14,23,24beschrieben.

Protokoll

(1) Kapselung von hydrophoben Verbindungen in Polymeren NPs mit einem CIJ-Mixer

1. Vorbereitung und Ausrüstung reinigen.
   1. Beschaffen und CIJ Mixer zu validieren.
      Hinweis: Siehe Ergänzende Informationen Abschnitt 1 für Bau-Anleitung. CAD-Dateien sind auch als Zusätzliche Informationen zur Verfügung.
   2. Sicherstellen Sie vor jeder Benutzung, dass alle Beschläge auf dem CIJ-Mischer gemütlich sind und der Auslass-Schlauch nicht geknickt oder eingeklemmt.
   3. In einer Dampfhaube Anfügen einer 5 mL Luer Lock Spritze mit ca. 2-3 mL Lösungsmittel für den jeweiligen Einlass-Adapter. Wählen Sie ein Lösungsmittel (z.B. Aceton), die alle Verbindungen, die vor kurzem in den Mischer eingesetzt zu reinigen.
      Hinweis: Typische Einstellungen sind Aceton oder Tetrahydrofuran (THF). Nur Gebrauch Polypropylen Spritzen, solvent Kompatibilitätsprobleme wie Auswaschung zu vermeiden. Verwenden Sie nicht spritzen mit Kautschuk o-Ring Dichtung Kolben.
   4. Legen Sie CIJ Montage über einem Abfallbehälter.
      Hinweis: Eine Flasche mit einer Öffnung kleiner als die CIJ Körper funktioniert gut, da dies den Mixer unterstützt und ermöglicht eine einfache Bedienung der Spritzen.
   5. Ständig drücken Sie die Spritzenkolben zum Entleeren des Inhalts durch die Mischkammer über ein paar Sekunden. Entfernen Sie die Spritzen.
      Hinweis: Spritzen aufbewahrt und wiederverwendet werden können für mehrere Runden der Reinigung zwischen den Läufen der FNP.
   6. Trocknen Sie die CIJ-Mixer-interna mit einem N-₂ -Stream. Ein männlichen Luer-Adapter auf das Zeilenende N₂ ist wirksam.
      Hinweis: Wenn die Reinigung Lösungsmittel nicht flüchtige (z. B. DMSO), wiederholen Sie Schritte 1.1.3-1.1.5 mit Aceton oder THF vor 1.1.6 Schritt. Es ist entscheidend, restliche Lösungsmittel für Run-to-Run-Konsistenz zu entfernen.
2. Lösungsmittel und antisolvent-Streams am Ziel Kompositionen vorzubereiten.
   1. Auflösen der hydrophoben Verbindung (z.B. Vitamin E) in nicht stabilisierten THF bei 10 mg/mL in ausreichender Menge, um die gewünschte Anzahl der FNP Runs zu vervollständigen. Bereiten Sie etwas mehr als benötigt pro Durchlauf.
      Hinweis: Andere Lösungsmittel können in den folgenden Schritten, die Beschränkungen im Abschnitt Diskussion verwendet werden. Wenn THF beschäftigt, empfiehlt Stabilisator-freie Lösungsmittel, da Butylated Hydroxytoluene geringe wässrige Löslichkeit hat. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden Peroxid Aufbau (einschließlich Peroxid Tests) und beachten Sie, dass niedrige Konzentrationen von Peroxiden bestimmte NP-Anwendungen (z. B. Ausbleichen der Farbstoffe) stören können.
   2. Mischen Sie die Vitamin E-Lösung auf einem Vortex-Mixer bis aufgelöst.
      Hinweis: Bei einigen Verbindungen kann Bad Beschallung für 1 – 2 min. bei Erzeugung einer gelösten Lösung unterstützen. Es ist wichtig, dass alle NP Komponenten molekular gelöst sind.
   3. Auflösen den Block-Copolymer-Stabilisator (d. h., poly(styrene) -b- Poly(ethylene glycol), PS_{1,6 k}-b-PEG-_{5 k}) in THF bei 10 mg/mL in etwa das gleiche Volumen wie in Schritt 1.2.1 die Polymerlösung zu bilden.
      Hinweis: Andere Lösungsmittel können, vorbehaltlich der Einschränkungen, die detailliert im Abschnitt Diskussion verwendet werden.
   4. Mischen Sie die Polymerlösung mit einem Vortex-Mixer bis aufgelöst. Bei Bedarf legen Sie die Lösung in einem Beschallung Bad für 1 – 2 min. um Feststoffe Auflösung unterstützen.
      Hinweis: Das Polymer kann nicht in Mizellen Form sein. Dynamische Lichtstreuung (DLS) kann ein nützliches Instrument, um festzustellen, ob eine neue Stream-Komposition dieses Kriterium erfüllt sein.
   5. Erstellen Sie das Lösungsmittel input-Stream mit 5 mg/mL Vitamin E und der Stabilisator (50 % Vitamin E Beladung) durch erste Pipettieren 0,25 mL Vitamin E-Lösung in eine 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Dann 0,25 mL der Polymerlösung pipette in das gleiche Rohr.
      Hinweis: Volumes, die größer als 0,5 mL pro Durchlauf sind mit verschiedenen Spritze Größen machbar. Über 10 mL input-Lautstärke ist es sinnvoll, eine Spritzenpumpe verwenden.
   6. Optional auf einem Vortex Mixer für 5-10 s. Mischen Sie, Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1000 X g für 5-10 s wieder Flüssigkeiten stecken, um die Kappe, die Reproduzierbarkeit zwischen CIJ Läufen verbessert.
   7. Pipette 0,525 mL entionisiertem Wasser in eine zweite 1,5 mL Zentrifugenröhrchen als antisolvent-Stream.
      Hinweis: Es ist besser, überschüssige Antisolvent, die sicherstellt, dass Lösungsmittel Stream nie die Mischkammer ohne Antisolvent vorhanden betritt. In einigen Fällen, wo Salz Löslichkeit in dem Lösungsmittel/Antisolvent-Gemisch nicht begrenzt ist, können die gepufferte wässrige Systemen verwendet werden.
   8. Pipette 4 mL entionisiertem Wasser in ein 20 mL-Fläschchen funkeln oder anderen geeigneten Behälter als Quench-Bad. Legen Sie eine kleine magnetische Stir Bar in der Flasche.
      Hinweis: Das Quench-Bad reduziert die Ostwald-Reifung durch eine Senkung der endgültigen Lösemittelanteil auf 10 % vom Volumen^15,17. Dieses Volumen kann Adresse Prozess Einschränkungen angepasst werden und kann direkt mit Eingabe-Stream Volumen skaliert werden.
3. NPs von FNP mit dem CIJ Mixer zu produzieren.
   1. Positionieren Sie das offene Quench Bad Fläschchen unterhalb der gereinigten CIJ Mixer auf einem Teller rühren unter einem Abzug. Eine praktische Konfiguration verwendet einen 50 mL Reagenzglas Rack Block zur Unterstützung der CIJ Mixer mit dem Fläschchen unter und der Steckdose Schlauch in das Fläschchen geleitet. Siehe Abbildung 1A zur Orientierung.
   2. Begin Rühren der Quench Bad über magnetische Stir Bar bei rund 75 % max Geschwindigkeit.
   3. Mit einer Polypropylen 1 mL-Spritze mit einer stumpfen Spitze Nadel ausgestattet, das volle Volumen aus dem antisolvent Rohr zu ziehen.
      Hinweis: Verwenden Sie nicht spritzen, die enthalten einen o-Ring-Gummidichtung um Kompatibilitätsprobleme zu vermeiden. Verwenden Sie für größere Volumen der Einlass eine entsprechend dimensionierte Luer Lock Spritzen. Die Spritze Steckdose muss auf der Spritze Achse zentriert werden oder es werden instabil bei Depressionen.
   4. Sorgfältig alle Luftblasen aus der Spritze entfernen Sie und die stumpfe Spitze Nadel, in einem Sharps Container entsorgen.
   5. Grundieren Sie den Kolben, so dass der Strom nur um die Öffnung der Spritze kommt. Legen Sie die Spritze auf eines der CIJ Zulauf-Armaturen.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.3-1.3.5 für die Lösungsmittel Lösung.
   7. Drücken Sie schnell, sanft und gleichmäßig die Spritzen zur gleichen Zeit, indem der Ball die Hand, die Handfläche der Hand oder einem Daumen auf die Spitzen der Kolben je nach persönlicher Vorliebe. Sammeln des Abwassers in der Quench-Bad-Durchstechflasche.
      Anmerkung: Eine 0,5 mL Eingang sollte gedrückt werden, in weniger als 0,5 s.
   8. Beiseite der CIJ Mixer mit dem Spritzen noch befestigt. Entfernen Sie die Stir Bar und Kappe das Fläschchen, enthält jetzt die NP-Dispersion mit einem Kern-Schale Partikelstruktur (Abbildung 1).
   9. Halten Sie den Mixer über einen Abfall Lösung Behälter und entfernen Sie die Spritzen. Die halterlosen Volumen (ca. 0,25 mL) wird dann abfließen. Entsorgen Sie die gebrauchten Spritzen und wiederholen Sie die Reinigung Schritt 1.1 vor der nächsten FNP Testversion.
      Hinweis: Lassen Sie nicht die halterlosen Lautstärke zu leeren in die Durchstechflasche mit der NPs, da dies negative auf Probe Einheitlichkeit Auswirkungen.
4. Durchführen Sie Analyse und Nachbearbeitung der NP Dispersion.
   1. Charakterisieren die NP-Größe mit DLS, pipette 100 μL der NP Dispersion in einem Kunststoff Küvette und 900 μl des Quench Bad Lösungsmittels (z.B. Wasser) hinzufügen.
      Hinweis: Kleinere Mengen können für Kleinserien Küvetten verwendet werden. Eine 10-divisibel Verdünnung ist in der Regel ausreichend.
   2. Mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter oder durch leichte Schütteln. Anweisungen Sie die gerätespezifischen, um die Probe zu analysieren.
      Hinweis: Erforderlich, Alternative Charakterisierung Techniken wie Zeta-potential-Analyse oder Elektronenmikroskopie als durchgeführt werden kann. Die NP-Dispersion kann weiterverarbeitet, wie durch die Anwendung vorgegeben und überprüft im Diskussion Abschnitt.

2. Kapselung von hydrophilen Verbindungen in umgekehrten NPs mit einem CIJ-Mixer

1. Lösungsmittel, antisolvent, vorbereiten und Lösungen in Abzug zu stillen.
   1. Führen Sie die Reinigung und Vorbereitung Verfahren beschriebenen Schritt 1.1, mit DMSO als Lösungsmittel reinigen und Einhaltung der Hinweis im Schritt 1.1.6 um eine zweite Spülung mit THF abzuschließen.
   2. Auflösen die hydrophile Verbindung (d.h., Maltodextrin (MD) mit Traubenzucker entspricht (DE) von 4-7, mittleres Molekulargewicht = 3.275 g/Mol, "3 k MD") läuft in DMSO bei 10 mg/mL in ausreichendem Umfang, die gewünschte Anzahl von FNP abzuschließen.
      Hinweis: Andere Lösungsmittel, im Diskussion Abschnitt beschriebenen Einschränkungen einsetzbar.
   3. Mischen Sie die Maltodextrin-Lösung mit einem Vortex-Mixer bis aufgelöst. Bei Bedarf legen Sie die Lösung in einem Beschallung Bad für 1 – 2 min. um Feststoffe Auflösung unterstützen.
   4. Erstellen Sie einen Block-Copolymer-Stabilisator (d. h., poly(styrene) -b- Poly (Acryl Säure), PS-_{5 k}-b- PAA_{4,8 k}) Lösung in THF bei 11,1 mg/mL in etwa das gleiche Volumen wie in Schritt 2.1.2 bilden die Polymerlösung auf Lager .
      Hinweis: Andere Lösungsmittel und Stabilisator Konzentrationen können verwendet werden. DMSO kann ohne weiteres als Lösungsmittel anstelle von THF verwendet werden.
   5. Mischen Sie die Polymerlösung mit einem Vortex-Mixer bis aufgelöst. Bei Bedarf legen Sie die Lösung in einem Beschallung Bad für 1 – 2 min. um Feststoffe Auflösung unterstützen.
      Hinweis: Die Polymer-Eingabe kann nicht in Mizellen Form sein. DLS kann verwendet werden, um festzustellen, ob eine neue Stream-Komposition dieses Kriterium erfüllt.
   6. Vorbereiten den Lösungsmittel Stream Input (0,5 mL) durch die Kombination der folgenden in der Reihenfolge, in eine 1,5 mL Zentrifugenröhrchen: 0,250 mL der 3 k MD Lösung, 0,225 mL Polymerlösung und 0,025 mL entionisiertem Wasser.
      Hinweis: Der Wassergehalt dieser Strömung hat einen starken Einfluss auf NP Größe und Polydispersität. Im Allgemeinen empfiehlt es sich, in der 2,5-10 Vol % Reichweite²⁰tätig. Werte am oberen Ende des Bereichs können Kapselung von größeren Molekulargewicht Verbindungen helfen.
   7. Mischen Sie gut auf einem Vortex-Mixer für 5-10 s.
   8. Optional, Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1000 X g für 5-10 s zu steckte, um die Kappe, die verbessert die Reproduzierbarkeit zwischen CIJ läuft Flüssigkeit zu erholen.
   9. Bereiten Sie eine Vernetzer Lösung von Kalzium-Chlorid (CaCl₂) Dihydrat in Methanol bei 25,0 mg/mL.
      Hinweis: Der Vernetzer wird im Verhältnis 1:1 kostenlos die Säuregruppen im PAA Block hinzugefügt werden. Passen Sie die Konzentration entsprechend an, wenn ein anderes Vernetzer verwendet wird oder ein anderer PAA Block-Größe oder Polymer-Konzentration verwendet^20,21ist.
   10. Die antisolvent-Stream durch Pipettieren 0,5 mL Chloroform und 0,05 mL der Lösung Vernetzer (0,55 mL gesamt) zu einem Microcentrifuge Schlauch vorbereiten.
       Hinweis: Andere akzeptable Antisolvents werden durch die Block-Copolymer-Wahl diktiert und umfassen in der Regel Dichlormethan oder Aceton. Der Vernetzer kann stattdessen das Quench-Bad mit zusätzlichen Alterung der NP Dispersion Crosslink Bildung²⁰ermöglichen hinzugefügt werden.
   11. Mischen Sie gut auf einem Vortex-Mixer für 5-10 s.
   12. Optional, Zentrifugieren Sie das Rohr auf 1000 X g für 5-10 s zu steckte, um die Kappe, die verbessert die Reproduzierbarkeit zwischen CIJ läuft Flüssigkeit zu erholen.
   13. Fügen Sie 4 mL Antisolvent (z.B. Chloroform) zu einem 20 mL funkeln Fläschchen, das Quench-Bad zu bilden. Legen Sie eine kleine magnetische Stir Bar in der Flasche.
       Hinweis: Dieser Band kann an die Gegebenheiten der Adresse Prozess angepasst werden.
2. Füllen Sie das Protokoll für NP-Bildung, wie unter Punkt 1.3 beschrieben.
3. Durchführen Sie Analyse und Nachbearbeitung der NP Dispersion.
   1. Charakterisieren die NP-Größe mit DLS, pipette 100 μL der NP Dispersion in einem Glas Küvette und 900 μl des Lösungsmittels für das Quench-Bad hinzufügen.
   2. Mischen Sie gut durch Pipettieren rauf und runter oder leichte Erregung von der Küvette. Folgen Sie die Anweisungen der Software, die Probe zu analysieren.
      Hinweis: Vernetzung der NPS kann qualitativ von DLS mit ein gutes Lösungsmittel wie DMSO oder Dimethylformamid (DMF) als DLS Verdünnungsmittel²⁰bewertet werden. Teilchen, die stabil vernetzt sind werden eine Autokorrelationsfunktion in dem Lösungsmittel mit minimaler Änderung der Partikelgröße aufweisen. Schlecht vernetzt Partikel Schwellen an und zeigen eine schwache Autokorrelationsfunktion und Streuung Stärke²¹.
   3. Optional fügen Sie eine Basis, wie z. B. Ammoniak, ionische Komplexierung und Stärkung der Vernetzung in der Partikel-Kern hinzu.
      1. Optional, bereiten Sie die 3,48 mg/mL Lösung von Ammoniak in Methanol gravimetrisch mit Ammonium Hydroxid-Lösung (in der Regel 30 wt % Ammoniak). 50 μL (d.h. 0,6 Entsprechungen in Bezug auf die Säuregruppen auf das Polymer) tropfenweise unter Rühren hinzufügen.
         Hinweis: Die äquivalente können eingestellt werden, indem man entweder die Konzentration auf Wunsch oder das Volumen hinzugefügt²⁵.
      2. Optional, Alter nicht weniger als 30 min mit milden rühren für Vernetzung auftreten.
   4. Prozess der NP-Dispersion, Mikropartikel oder beschichtete NPs zu produzieren, wie in der Literatur^19,20,21beschrieben.

(3) die Verkapselung von Ovalbumin im umgekehrten NPs mit einem μMIVM

1. Lösungsmittel und antisolvent Lösungen vorzubereiten.
   1. Bereiten Sie eine 50 mg/mL Lösung von Ovalbumin in entionisiertem Wasser ("OVA").
   2. Bereiten Sie 0,75 mL der Lösung A in einem 1,5 mL Zentrifugenröhrchen durch Verdünnung 75 μL OVA-Lösung mit 0,675 mL DMSO eine 5 mg/mL Lösung von Eizellen in DMSO mit 10 % Wasser durch Volumen zu generieren. Gut mischen und kurz, wie zuvor beschrieben zentrifugieren.
      Hinweis: Siehe Schritt 2.1.6 über Wasser-Effekte. Wie in den vorherigen Abschnitten können die Lösung-Volumen nach oben oder unten Fit materiellen Bedürfnisse skaliert werden.
   3. Bereiten Sie Lösung B durch Auflösen des Block-Copolymer-Stabilisators (d. h., poly(styrene) -b- Poly (Acryl Säure), PS-_{5 k}-b- PAA_{4,8 k}) in DMSO bei 6 mg/mL. Mischen Sie gut und beschallen Sie, sich aufzulösen, wenn nötig. Pipette 0,75 mL in einem 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.
   4. Pipette 0,75 mL THF (Lösung C) in einer 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.
   5. Pipette 1,85 mL Chloroform (Lösung D) in einer Glasflasche funkeln.
   6. Bereiten Sie eine 60,0 mg/mL Calciumchlorid Dihydrat Vernetzer Lösung in Methanol. Mischen Sie mit einem Vortex-Mixer.
   7. Bereiten Sie eine 4,17 mg/mL Ammoniak-Lösung in Methanol wie unter Punkt 2.3.4 beschrieben.
   8. Eine 15 mL Zentrifugenröhrchen 5,25 mL Chloroform als Quench Bad hinzufügen.
2. Bereiten Sie Mixer Baugruppe und stehen.
   1. Sammeln Sie die unteren Empfänger, mischen Geometrie Datenträger, die obere Scheibe, den Schraubenschlüssel Schraubenschlüssel und einen o-Ring. Schematische Darstellung der Komponenten und der Mixer Stand Terminologie finden Sie in Abbildung 2 .
      Hinweis: Informationen über MIVM Bau in Zusatzinformationen (Abschnitt 1) und in der Literatur²²finden werden. CAD-Dateien sind auch als Zusätzliche Informationen zur Verfügung.
   2. Setzen Sie den o-Ring in die Nut, sicherzustellen, dass es gut passt und es keine Anzeichen von Abnutzung oder Beschädigung gibt.
      Hinweis: Normalbetrieb führt zu abgenutzt oder Lösungsmittel geschwollen O-Ringe. Erscheint der o-Ring gestreckt oder verformt, lassen Sie es an der Luft trocknen über Nacht vor dem Gebrauch. Wenn die Form nicht über Nacht erholen, entsorgen Sie den o-Ring. Halten Sie einen großen Vorrat, da dies eine konsumierbare Teil.
   3. Vorsichtig richten Sie die Rührschüssel Scheibe Löcher mit den Zapfen auf der oberen Platte und zusammenschieben. Stellen Sie sicher, dass der o-Ring nicht verschoben werden, indem Sie überprüfen, dass die beiden Stücke sitzen bündig.
   4. Invertieren Sie die beiden Stücke zu und montieren sie manuell mit dem unteren Empfänger. Sicherstellen Sie, dass das Outlet Schlauch Fitting gelockert hat, so dass es nicht stört, mit kompletten Verschärfung des Datenträgers.
      Hinweis: Wenn das threading Fänge bei der Montage sorgfältig zerlegen und wenden Sie ein Essen oder Arzneimittelqualität Anti-Haftmittel, das Einfädeln um fressen zu vermeiden.
   5. Nach dem manuellen anziehen, den Schraubenschlüssel Schraubenschlüssel um die obere Scheibe Stifte passen und fest anziehen der Versammlung. Festziehen der Steckdose Schlauch fitting, sodass sie fest gegen die untere Fläche der mischenden Geometrie steckt. Sicherstellen Sie, dass die Spritze Beschläge auf der oberen Platte fest.
   6. Legen Sie den montierten Mischer auf dem Mischpult Ständer, so dass der Auslass-Schlauch unter der Trägerplatte erstreckt sich. Unterstützen Sie die mobile Platte, so dass es aus dem Weg zu den geschäftlichen Bereich ausgesetzt ist.
   7. Optional, Spritzen, mechanischen Anschlag Ausrichtung prüfen, befestigen zuerst das leere Glas, die Mixer-Eingänge.
      Hinweis: Volumetrische Flussraten sind vielfältig mit Spritzen von verschiedenen Lauf Durchmessern, da Spritzen die gleichen linearen Geschwindigkeit gleichzeitig gedrückt werden. Die Anfangs- und Endwert vertikalen Höhen müssen das gleiche für alle Spritzen und einstellbar mit Stellschrauben der Kolben Welle²²erschlossen. Die mechanischen Anschläge sicherstellen, dass übermäßige Schäden an Glas Spritzen nicht auftritt.
      1. Optional kommt niedriger die mobile Platte, so dass auf den mechanischen Endanschlägen ruhen. Stellen Sie sicher, dass diese so ausgerichtet sind, dass die Platte auch zur Ruhe unmittelbar vor der Kontaktaufnahme mit den leeren Spritzen kommt (wie in Abbildung 2zu sehen).
      2. Optional, lösen Sie die mechanische Anschläge und neu positionieren, wenn nötig. Entfernen Sie die Glas Spritzen und Zurücksetzen Sie die mobile Platte aus dem Weg.
         Hinweis: Für den Betrieb mit Kunststoffspritzen sind die mechanischen Anschläge nicht erforderlich.
   8. Legen Sie die offene Quench-Bad unter den Auslass Schlauch um das Abwasser zu sammeln.
   9. Ziehen Sie Lösung A in eine gasdichte 1 mL-Spritze mit einer stumpfen Spitze Nadel. Alle Luftblasen zu entfernen und entsorgen der Nadel. Grundieren Sie die Lösung bis zum Ende der Spritze Luer Armatur. Wiederholen Sie diesen Vorgang für Lösungen B und C.
   10. Ziehen Sie Lösung D in eine gasdichte 2,5 mL-Spritze mit einer stumpfen Spitze Nadel. Alle Luftblasen zu entfernen und entsorgen der Nadel. Grundieren Sie die Lösung bis zum Ende der Spritze Luer Armatur.
       Hinweis: Diese Bände wurden ausgewählt, so dass die erste Spritze Kolben Höhen identisch sind. Wenn Datenträger geändert werden, müssen sie noch diese Höhenbedarf erfüllen.
   11. Montieren Sie die vier Spritzen auf den Mischer im Uhrzeigersinn in alphabetischer Reihenfolge. Siehe Abbildung 1 b letzter Auftritt und Spritze Orientierung schematische.
       Hinweis: Überprüfen Sie, dass keine Spritze Höhe deutlich anders als die anderen und nach Bedarf zu beheben.
3. Führen Sie Mixer Bedienung und Reinigung.
   1. Greifen Sie das Lagergehäuse auf beiden Seiten der mobile Platte. Legen Sie Finger nicht auf der Unterseite des Gehäuses, weil dies eine Quetschgefahr gegen die mechanischen Anschläge ist. Senken Sie langsam die mobile Platte, so dass es gleichmäßig aufliegt, aber kaum berührt die Spritzen.
   2. Stetig und gleichmäßig drücken die Platte, mit dem Ziel, diesen Vorgang in etwa 0,5-1 s für diese Bände²²streamen.
      1. Entfernen und Kappe die Quench-Badewanne enthält jetzt die NP-Dispersion.
   3. Nehmen Sie den Mixer mit dem Spritzen noch befestigt und halten über einem Abfallbehälter. Entfernen Sie die Spritzen, so dass die halterlosen Volumen in den Behälter zu entleeren. Halten Sie die Mixer-Baugruppe auf den Kopf und zerlegen Sie den Mixer mit dem Schraubenschlüssel Schraubenschlüssel zu.
   4. Mit einer Sprühflasche, die Steckdose Schläuche mit einige Milliliter des Lösungsmittels (z.B. Aceton) spülen und trocknen mit Luft oder Stickstoff.
   5. Spülen Sie die Rührschüssel Geometrie mit ein gutes Lösungsmittel (z. B. deionisiertes Wasser oder DMSO) und dann spülen Sie mit Aceton verwenden mehrere Milliliter aus einer Sprühflasche. Trocken mit einem Strom von Luft oder Stickstoff.
   6. Den o-Ring in einen Strom von entionisiertem Wasser abspülen und trocken tupfen.
   7. Spülen Sie die obere Scheibe gründlich mit einigen Millilitern von Aceton mit einem Lösungsmittel Flasche bis Sie optisch sauber. Trocknen Sie mit Luft oder Stickstoff-Stream die Oberfläche und die Spritze Beschläge.
   8. Spülen Sie jede Spritze mit mehreren Milliliter ein gutes Lösungsmittel (z. B. deionisiertes Wasser oder Aceton) aus einem Lösungsmittel Flasche. Wenden Sie ein abschließendes Spülen der mehrere Milliliter Aceton und an der Luft trocknen vor dem nächsten Gebrauch.
4. Ausführen einer Analyse und Nachbearbeitung.
   1. Hinzufügen von 50 μL der Kalzium-Chlorid-Dihydrat Vernetzer Lösung tropfenweise unter Rühren bei etwa 75 % maximale Geschwindigkeit.
   2. Fügen Sie 50 μL der Ammoniak-Lösung tropfenweise unter Rühren mit maximaler Geschwindigkeit von 75 %. Alter mindestens 30 min lang.
   3. Charakterisieren Sie die NP-Größe, wie in den Schritten 2.3.1 und 2.3.2 beschrieben.
   4. Prozess der NP-Dispersion, Mikropartikel oder beschichtete NPs zu produzieren, wie in der Literatur^19,20,21beschrieben.

4. Änderungen Formulierung Scale-up

1. Bereiten Sie die Lösungsmittel und antisolvent Lösungen wie in den Schritten 1, 2 oder 3 auf die gewünschte Zusammensetzung und in ausreichendem Umfang für die gewünschte Formulierung Größe beschrieben vor.
2. Optional, falls erforderlich, reinigen und sterilisieren des Mixers mit einem geeigneten Protokoll vor NP Bildung.
   Hinweis: Sequentielle Spülungen CIP 100 Wasser (pH-neutral), CIP-200, Wasser (pH-neutral) und einem geeigneten Lösemittel sind in der Vergangenheit eingesetzt worden. Darüber hinaus können Sterilfilter an den Einlässen des Mischers in Fällen wo Endkorngröße Sterilisation schließt angebracht werden, durch Filtration.
3. Laden Sie die Lösungen in gasdichte Spritzen angemessene Lautstärke und fügen Sie Polytetrafluorethylen (PTFE) Schlauch mit einem Luer-Adapter ausgestattet, am Ende an. Manuell erstklassige Lösungen für das Ende des Schlauches.
   1. Laden Sie die Spritzen in eine Spritzenpumpe und befestigen Sie die Spritzen die Mixer-Eingänge auf CIJ oder MIVM, je nach Bedarf.
      Hinweis: Alternativ können Flow Controller im Labor oder Pilotmaßstab verwendet werden, größere Volumen Fähigkeiten als eine Spritzenpumpe bereitzustellen. Erfolgreiche Operation erfordert stetigen Fluss und ausreichender Druckabfall, was bedeutet, dass unter Druck stehenden Behältern mit Durchflussmessung an der Steckdose die am besten geeignete Auswahl für Produktion in großem Maßstab sind.
4. Legen Sie ein Sammelbehälter mit einem Quench Bad ausreichend Volumen, falls erforderlich, unter den Auslass-Schlauch.
5. Festlegen der volumetrischen Flussraten an diejenigen erreicht manuell anzupassen (z. B. ca. 30-60 mL/min pro Stream).
   Hinweis: Wenn die CIJ verwenden, müssen die Pumpe Durchflussmengen identisch sein. Wenn Sie die MIVM verwenden, können verschiedene Buchten verschiedene Durchflussmengen haben.
6. Beginnen Sie gleichzeitig die Pumpen. Ca. 5-10 mL des Abwassers als Abfall in ein kleines Fläschchen (Dies ist ein "Einschaltlautstärke") zu sammeln und dann beginnt das Quench-Bad zu sammeln.
7. Charakterisieren und entsprechende Formulierung oben im Abschnitt wie beschrieben verarbeiten.

Ergebnisse

Screening von NP-Formulierungen mit FNP ist schnell und erfordert geringe Mengen Material (in der Größenordnung von 1 bis 10 mg). Die FNP Protokoll hydrophobe Substanzen wie Vitamin E (Schritt 1) Ergebnisse in einem stabilen, klar oder leicht opalisierend NP Dispersion zu Kapseln. Dynamische Lichtstreuung (DLS) bietet ein robustes Mittel um die Partikelgröße zu charakterisieren. Wie in Abbildung 3dargestellt, erzeugt der Prozess NPs mit einem niedrigen Polydispersität auf reproduzierbare Weise. Die typische Polydispersität Index (PDI) ist kleiner als 0,20, zeigt ein relativ Monodisperse Bevölkerung. Die PDI ergibt sich aus der Autokorrelationsfunktion und ist oft in Gerätesoftware umgesetzt. Es ist ein Verhältnis von der zweiten auf den ersten Moment, wo Werte von 0,1 sind in der Regel für Monodisperse Partikel²⁶abgerufen. Für die vier Vitamin E/PS-b-PEG Formulierung Wiederholungen berichtet, war der Wert 0,12 ± 0,02 und der durchschnittliche Durchmesser betrug 107 ± 7 nm. Eine typische "Fehlzündungen" aufgrund der beiden ungleichen Depression der Spritzen oder Depression langsamer werden auch in Abbildung 3berichtet. Die Polydispersität war nicht betroffen, aber die Größe war etwas größer (135 nm). Einschließlich der in diesem Beispiel sind die neuen Metriken für Partikelgröße 113 ± 14 nm. Eine Fehlzündung führt in Zeiten wo die Kammer nur einen einzigen Datenstrom-Typ enthält. Es ist wichtig, dass der gesamte Strom der gleiche Prozess Geschichte und relativen Mengen der organischen und wässrigen Ströme innerhalb des Mischers erlebt. Ohne Stabilisator entsteht eine opake Lösung mit sichtbaren Aggregate. Die DLS Autokorrelationsfunktion für dieses Beispiel ist nicht monoton und reibungslos, wie in der Abbildung 3 Inset gesehen nicht zerfallen.

Partikel Größe Kontrolle durch FNP ist in Abbildung 4gezeigt wo die relativen Mengen des Kernmaterials – poly(styrene)_{1,8 k} in diesem Fall – und PS -bVariation-PEG Stabilisator führte zu Partikel-Größen, die von 49-152 nm reichten. Diese Partikelgrößen entstanden mit THF-Streams mit einer totalen Massenkonzentration des Kerns und Stabilisator von 20 mg/mL, wo 25 %, 50 % oder 75 % der Masse der poly(styrene) Kernmaterial war. Die Polydispersität der Nanopartikel wurde immer weniger als 0,15. Ausführliche Diskussion der Parameter Auswirkungen auf die Partikelgröße von FNP produziert entnehmen Sie bitte den Literatur-¹⁰. Die Beladung kann abgestimmt werden, indem die Lösungsmittel Volumen konstant und variieren die relative Lautstärke der Kern- und Stabilisator Stammlösungen. Ebenso kann die gesamte Massenkonzentration variiert werden, durch die Vorbereitung auf lagerlösungen auf andere Werte als 10 mg/mL. Unter bestimmten Voraussetzungen ist es möglich, eine leere Micelle Bevölkerung von DLS²⁷zu beobachten. Dieser muss keine nachteilige Wirkung als Erweiterung der gemessenen Partikelgrößenverteilung. Wenn die Größen ähnlich sind, kann dies als einen einzigen breiten Gipfel anstatt zwei getrennte Peaks manifestieren.

Der gleichen CIJ Mixer kann auch hydrophile Verbindungen zu Kapseln von iFNP, wie in Schritt 2 des Protokolls verwendet werden. Die Teilchen in der gemeldeten Formulierung sind rund 65 nm mit einer niedrigen Polydispersität von 0,08. Die Größenverteilung sehen in Abbildung 5A (gestrichelte Linien). Die Wirkung der Vernetzung der PAA Carbonsäure Rückstände auf Partikel Stabilität wird durch DLS-Analyse in einem starken Lösungsmittel wie DMSO, gezeigt, wie in Abbildung 5 bgezeigt. Die Autokorrelationsfunktion für gut vernetzt Partikel sollten in der Nähe von einem Wert von 1- and -Drop scharf auf 0 zu einer charakteristischen Zeit anlaufen, die mit der Partikelgröße (durchgezogene Linie) zusammenhängt. Partikel, die ausgiebig anschwellen oder aufzulösen sind nicht vernetzt und minimaler Autokorrelation Signal (gepunktete Linie) zeigen. Für iFNP fehlgeschlagene Versuche zu manifestieren in ähnlicher Weise wie für FNP oben beschrieben. Sichtbaren Aggregate gesehen werden können oder schlechtem DLS Autokorrelation Funktion Zustand beobachtet werden kann. Die MIVM kann für FNP oder iFNP verwendet werden, wenn mehr als zwei Einlass Ströme aufgrund von Systemeinschränkungen wie Löslichkeit oder chemische Inkompatibilität erforderlich sind. Eine kleinere Version des MIVM (μMIVM) mit einem Mixer-Stand ist in Abbildung 2dargestellt. Wie bei der CIJ, kann dieser Mixer hydrophoben bzw. hydrophilen Verbindungen²²Kapseln verwendet werden. In Schritt 3 wurde ein Protokoll für die Kapselung der ein hydrophiles Protein, OVA, durch iFNP beschrieben. Die Partikelgrößenverteilung zeigt Abbildung 5A (durchgezogene Linie). Die Größe beträgt rund 125 nm mit einem PDI von 0,16. Ein allgemeines Protokoll für Spritze Pumpenbetrieb bei größeren Maßstäben erfolgt in Schritt 4.

Abbildung 1: Mixer Montage- und innerbetrieblichen Materialfluss Muster Schaltpläne. (A) die engen Auftreffen Düsen (CIJ) Mischer mit angehängten Spritzen befindet sich über dem Quench-Bad. Nicht abgebildet sind, eine Stir Bar in das Quench-Bad-Fläschchen und einen Teller rühren. Die Rührschüssel Geometrie wird dargestellt, in der erweiterten Ansicht zeigt die zwei Stream-Buchten, die in der Mitte der Kammer zu treffen. (B) ein Multi-Einlass Vortex Mixer (μMIVM) ist mit Glas Spritzen gezeigt und in den Stand über einem Quench Bad positioniert. Die mobile Platte und die mechanischen Anschläge haben vom Bild abgeschnitten. Die erweiterte Ansicht zeigt schematisch die Wirbelkammer und die Zulaufkanäle. (C) eine schematische Darstellung des Kern-Schale-NPs von FNP produziert. Rote Kugeln repräsentieren die therapeutische, die zusammen mit dem blauen eingestürzten Polymer-Block, umfassen die NP-Kern. Der gelbe Polymer-Block bildet die Bürste Schicht Vermittlung sterische Stabilisierung der NPs. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: μMIVM Terminologie und Komponenten für die Montage. Die μMIVM erfordert einen Mixer Stand um einheitliche Depression der vier Spritzen zu ermöglichen. In diesem Fall müssen die Spritze Kolben Höhen alle einheitliche, konsequente Vermischung zu gewährleisten. Es kann alternativ mit Spritzenpumpen bedient werden. Der Mixer Stand mit beschrifteten Komponenten ist auf der linken Seite der Abbildung gezeigt. Auf der rechten Seite ist der zerlegte Mixer mit den o-Ring auf die Rührschüssel Geometrie-Festplatte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Partikel Größenverteilung von Polymeren Nanopartikel mit einem Kern aus Vitamin E und stabilisiert durch PS -b-PEG. Dynamische Lichtstreuung (DLS) bietet Intensität gewichtet Größenverteilung, die angeben, die NP-Durchmesser-Verteilung. Kurven sind der Durchschnitt der dreifacher Analysen für jeden Versuch und haben identische maximale Peak-Höhen produzieren skaliert wurde. Die vier Wiederholungen (durchgezogene Linien) zeigen die hohe Reproduzierbarkeit der Methode (Standardabweichung = 7 nm). Ebenfalls enthalten ist eine repräsentative Fehlzündung (gestrichelte Linie), wie Spritze langsamer oder ungleichmäßige Depression der zwei Spritzen, führt zu größeren Durchmesser der Partikel. Die Standardabweichung der NP Größe einschließlich der Fehlzündung war 14 nm. (Kleines Foto) Ohne die PS -b-PEG-Stabilisator, große Mikron-Skala Aggregate (oder Tröpfchen, im Falle eines Öls wie Vitamin E) gebildet werden. Die DLS Autokorrelationsfunktion eines Testlaufs ohne Stabilisator (gestrichelte Linie) wird zusammen mit einem repräsentativen Autokorrelation von Nanopartikel replizieren (durchgezogene Linie) angezeigt. Die Autokorrelationsfunktion zeigt eine Reihe von charakteristischen Zeitskalen für die Kontrollprobe, Angabe einer Polydisperse Population. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Partikel Größe Kontrolle durch FNP durch unterschiedliche relative Kennzahlen des Kerns an Stabilisator. Die Intensität gewichtet Größenverteilung von drei Formulierungen mit einem poly(styrene) Kern stabilisiert durch PS -b-PEG dargestellt. Die gesamte Massenkonzentration in THF war 20 mg/mL und die Antisolvent war Wasser. Die Formulierungen wurden in einem Mischer CIJ vorbereitet. Der Anteil an der Masse, bestehend aus dem Kernmaterial wird in der Legende aufgeführt. Z. B. 25 % Bohrkern enthalten 5 mg/mL poly(styrene) und 15 mg/mL PS -b-PEG. Die durchschnittliche Größe für 25 % (durchgezogene Linie), 50 % (gestrichelte Linie) und 75 % (gemischte gestrichelte Linie) Kern Belastungen waren 49 nm, 96 nm und 152 nm, beziehungsweise. Alle PDI-Werte waren weniger als 0,15. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Charakterisierung der invertierten NPs gemacht in einem CIJ Mischer- oder μMIVM. (A) DLS Kurven sind im Durchschnitt von dreifacher Analysen für jede Formulierung. Die gestrichelte Linie zeigt die Größenverteilung der 3 k MD Partikel in die CIJ Mixer gemacht, während die durchgezogene Linie die Größenverteilung der OVA Teilchen ist, die in der μMIVM. (B) die Stärke der Vernetzung kann durch Verwendung von DMSO als das Verdünnungsmittel DLS beurteilt werden. Die Autokorrelationsfunktion DLS zeigt die Stärke der Vernetzung durch die anfängliche Autokorrelation Wert und die Beobachtung der einen sauberen Übergang auf einen Wert von Null. Die gestrichelte Linie zeigt die Autokorrelationsfunktion eines Partikels mit kein Vernetzer zeigt ein schwaches erstes Signal und einer breiten Abklingzeit. Die durchgezogene Linie zeigt die Autokorrelation nach Zugabe von eine starke Vernetzer (in diesem Fall Tetraethylenepentamine), die ein starkes erstes Signal und einer definierten Verfall Zeitskala zeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6: Übersättigung, S, in Abhängigkeit von der relativen Mischungsverhältnisse der organischen Lösungsmittel, Wasser. (A) Vergleich der höchste erreichbare Übersättigung für (○) Boscalid, Pestiziden und (■) Peptid B, ein sieben-Rückstände Modell Peptid. Die Bio-Stream enthält Boscalid in einer Konzentration von 230 mg/mL und Peptid B bei 200 mg/mL, deren Sättigung-Konzentrationen. Gibt es eine maximale Übersättigung, die jeder aktive pharmazeutische Wirkstoffe (API) hängt / Lösungsmittel System. (B) wenn die Konzentration der Boscalid im Bio Stream 20-fache verringert wird, werden die Bedingungen an denen Übersättigung und Nanoprecipitation abgeschlossen sind begrenzt. Diese Zahl ist mit freundlicher Genehmigung von Elsevier⁹abgedruckt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Diskussion

Die Kapselung der hydrophoben Substanzen wie Vitamin E, wie in Schritt 1 des Protokolls wurde ausführlich beschrieben^9,14,28. Monodisperse Partikel sind relativ produziert, weil die Zeitskala zum Mischen kürzer als die Zeitskala für die Aggregation und das Wachstum der Partikel ist. Insbesondere wird die gemischte Lösungsmittel/Antisolvent-Lösung rasch homogen, wodurch Keimbildung einheitlich auftreten. Montage von der Block-Copolymer, an der Partikeloberfläche dann bietet sterische Stabilisierung, die Partikel Wachstum⁵hält. Da Mischzeit in der Kammer (Turbulenz) eine Funktion von der Einlass-Flussraten bis CIJ oder die MIVM ist, gibt es eine Einlass-Rate, die nach dem Übergang in die turbulente Durchmischung, auftritt, wo die Partikelgröße ist im Wesentlichen konstant¹³. Dies bietet zusätzliche Robustheit für den Prozess als eine Charge zu Charge Variation im Zulauf Durchfluß (d.h. Spritze Depressionen Geschwindigkeit) ohne erhebliche Auswirkungen auf die endgültige Größe der NP toleriert werden kann, wie aus Abbildung 3zu sehen. Langsamer oder unebenen Einlass Geschwindigkeiten führt zu größeren Partikeln oder mehr Polydisperse Distributionen wie z.B. Fehlzündungen zu sehen. FNP wurde auch erweitert um hydrophile Verbindungen in Nanopartikel Kapseln mit inversen Flash NanoPrecipitation. Diese invertiert Nanopartikel können dann verwendet werden, um Mikropartikel zu erstellen oder mit PEG erstelle ich Wasser dispergierbar Nanopartikel²⁵beschichtet werden. Die Grundprinzipien der Montage bleiben gleich, allerdings gibt es die zunehmende Komplexität der Vernetzung der Partikel-Kern. Dies ist notwendig zur Stabilisierung des Partikels in einer wässrigen Umgebung. Im Allgemeinen reicht ein 1:1 kostenlos-Verhältnis im Vergleich zu den Polysäure Block, obwohl die ionischen Wechselwirkungen von pH-Einstellung durch die Zugabe einer base¹⁹gefördert werden können. In diesem Protokoll ist nur der erste Prozessschritt zur Form invertiert NPs beschrieben worden.

Neben schnellen mischen ist erfolgreiche Formulierung von FNP oder iFNP beschränkt sich auf Fälle, wo mehrere Bedingungen erfüllt^9,14können. Erstens stream alle Eingänge müssen mischbar sein. Während Emulsionen verwendet wurden, um NPs zu produzieren, erfordert FNP eine einheitliche Lösungsphase im Mixer. Zweitens muss die Kernkomponente fast unlöslichen Lösungsmittel Konditionen im Mixer (für die CIJ, eine 50/50 Mischung von Volumen) sein, schnelle Keimbildung zu fahren. Ansonsten ein erheblicher Teil unvergossene bleibt oder wird nach weiteren Verdünnung mit Antisolvent auszufällen. Die MIVM kann höhere antisolvent Inhalt in der Mischkammer zu Adresse Kern Material Löslichkeit Einschränkungen aktivieren. Es ist oft nützlich, Übersättigung Kurven aus Löslichkeit Daten als Funktion der Lösungsmittel Zusammensetzung, Prozess-Design⁹führen zu generieren. Abbildung 6 zeigt repräsentative Kurven für zwei Verbindungen. Niedrige Übersättigung an der Mischungsbedingungen Kammer verdient mit unterschiedlichen Zusammensetzungen, in der Regel mit der MIVM. Höhere Übersättigung begünstigt die Keimbildung der Kernkomponente über Partikel Wachstum aber ein Missverhältnis im Montagezeit des Kernmaterials und der Stabilisator kann in großen Aggregaten von der therapeutischen führen. D'Addio und Prud'homme haben die Anwendung von solchen Übersättigung Kurven im Detail⁹überprüft. Schließlich muss die BCP molekular im Lösungsmittel Stream aufgelöst werden und antisolvent Stream muss für einen Block selektiv sein. Die BCP muss ausreichend amphiphile bieten beide eine Solvophobic treibende Kraft aus dem eingestürzten Block, den Stabilisator an der Partikeloberfläche und für den solvatisierte Block vermitteln sterische Stabilität der Partikel zu verankern. Lösungsmittel außer den beschriebenen im Protokoll können verwendet werden, solange sie diese Auflagen erfüllen.

Praxis mit manuellen Spritze Betrieb kann die Erfolgsquote beim Screening verbessern. Wie oben erwähnt, bedeutet Betrieb über den Übergang zur homogenen, turbulente mischen Bedingungen, dass kleine Variationen im Durchfluss in der Prozess-²⁸toleriert werden. Scale-Up auf Pumpe angetrieben, computergesteuerte fließt Ergebnisse in noch größere Gewinne in der Konsistenz durch die reproduzierbare Einlass Durchflussmengen. Beliebigen Zeitpunkt während der Nachbearbeitung der Partikel kann Sichtprüfung oder DLS-Analyse das Vorhandensein von großen Aggregaten angeben, welche aufgrund der anfallenden Staub oder Partikel Instabilität sein kann. Bei Bedarf kann der Stream mit einem geeigneten Filter Porengröße gefiltert werden. In Ermangelung von Aggregaten, wir haben festgestellt, dass weniger als 5 % Masse in der Regel verloren geht, wenn PEG-beschichteten Nanopartikel zu filtern, wenn die nominalen Filtergröße größer als die Partikelgrößenverteilung ist. Beim Filtern der Aggregate ist die experimentelle Bestimmung der Masse verloren während des Prozesses notwendig. Quantifizierung der Masseverlust kann auf zwei Arten durchgeführt werden. Die Trockenmasse Masse in einem bestimmten Volumen ermittelt werden durch thermogravimetrische Analyse vor und nach der Filtration, das Ausmaß der Veränderung zu identifizieren (siehe Abschnitt " Zusätzliche Informationen " 2). Alternativ können die Partikel wiederhergestellte (z. B.durch Lyophilisation) und in ein gutes Lösungsmittel aufgelöst. Die Konzentration des Kernmaterials kann dann direkt durch eine geeignete Technik wie Ultraviolett-sichtbare Spektrophotometrie oder Chromatographie gemessen werden.

Für FNP muss die wässrige Dispersion der verbleibenden 10 Vol % organischen Lösungsmittel (z.B.THF) entzogen werden. Dies kann durch Verdunstungskühlung Destillation^14,29, Dialyse³⁰oder tangential-Flow Filtration^31,32erfolgen. Praktische Überlegungen für jeden Bearbeitungsschritt werden beschrieben in den Zitaten zur Verfügung gestellt. Für die Dialyse sind typische Membranen 3,5 kDa oder 6-8 kDa Cutoff, obwohl größere Möglichkeiten zur Verfügung stehen. Das Molekulargewicht Cutoff ist ausreichend für Lösungsmittel entfernen, wenn 24 Stunden mit mehreren Bad Änderungen dialysiert. Die Verwendung der tangential-Flow Filtration beinhaltet einige Prozessentwicklung wie darauf geachtet werden, muss um zu vermeiden, induzierende Aggregation durch Konzentration Polarisation an der Membranoberfläche. Wir haben festgestellt, dass die Verringerung der organischen Lösungsmittel Zusammensetzung unter einem systemabhängig Wert, in der Regel 2 bis 10 Vol% Aggregation auf der Membranoberfläche beseitigt. Nach der Verarbeitung, die Konzentration der Nanopartikel leicht richtet sich nach thermogravimetrische Analyse (siehe Abschnitt " Zusätzliche Informationen " 2). Es ist oft wünschenswert, transportieren oder lagern Sie Partikel in eine sehr stabile Form. Wässrige Dispersionen können einfach eingefroren werden, schnell mit Hilfe einer Trockeneis/Aceton-Mischung und dann bei-80 ° c gelagert Alternativ erhalten Sie durch Gefriertrocknung^33,34 Trockenpulver oder spray trocknen²⁴. Häufig muss eine Kryoprotektivum Nanopartikel Aggregation beim Einfrieren oder trocknen reduzieren hinzugefügt werden. Zucker (Saccharose, Trehalose, etc.), Poly(ethylene glycol) oder Cyclodextrine können auf Wirksamkeit über einen Bereich von Konzentrationen untersucht werden durch die Größe von DLS^{35,36,37Überwachung, 38}. NP Stabilitätsprobleme während der Verarbeitung beziehen sich oft auf Löslichkeit oder Phase Trennung in den Kern, wodurch in Umlagerung auf einen niedrigeren Energiezustand unter Bedingungen, wo Mobilität erhöht wird. Verwendung von Co Kernmaterialien, alternative Stabilisatoren oder veränderte externe Lösung Zusammensetzung kann dazu beitragen, Stabilität^{14,16,17,39,40, 41}.

Wie bereits erwähnt, kann die MIVM höhere antisolvent Inhalt in den Mischraum gelangt, wenn erforderlich, um hohe Übersättigung erreicht. Es können auch für die räumlicher Trennung der Arten in mehr als zwei Ströme, wenn Reaktivität oder Löslichkeit Abhängigkeiten es verlangen. Ein Beispiel ist die Bildung von Zein Protein-stabilisierten Nanopartikeln der antibiotischen Clofazimin²⁴. Die hydrophoben Clofazimin wird in einer Aceton-Stream eingeführt; Zein ist in einem 60 % ethanolische wässrigen Strom eingeführt; Kasein, welches komplexe mit Zein, wird mit einer wässrigen Puffer Stream gebracht, und der vierte Strom ist zusätzlichen Puffer um das Verhältnis von Wasser, Aceton und Ethanol zu erhöhen. Zwei Lösungsmittel Ströme sind erforderlich, da Clofazimine und Zein nicht in einem gemeinsamen Lösungsmittel löslich sind. Dieser Prozess könnte nicht in einem zwei-Jet CIJ Mischer erreicht werden. Diese Protein-stabilisierten Formulierung zeigt auch, dass FNP BCP Stabilisatoren nicht beschränkt. Janus Partikel ohne Stabilisator⁴² produziert worden und eine Reihe von Low-Cost-Stabilisatoren für orale Anwendungen²⁴nachgewiesen haben. Insbesondere können Copolymeren wie Hydroxypropyl Methylcellulose anstelle Block-Copolymere²⁴verwendet werden. Kernmaterialien können durch eine Reihe von Techniken mehr hydrophobe erfolgen. Hydrophobe Ion Paarung wurde angewandt, um eine Vielzahl von Verbindungen, die mittleren Löslichkeit^43,44,45Kapseln. Extrem hydrophoben Prodrugs wurden generiert und anschließend umspritzt⁴⁶. Nukleinsäuren sind durch Komplexierung mit kationischen Lipide⁴⁷gekapselt. Wichtig ist, zeigen diese Studien, dass FNP eine Reihe von Teilchen Oberfläche Chemikalien produzieren kann. Weitere, gemischte Stabilisatoren mit einem Bruchteil der BCP, der mit einer targeting Liganden auf das Kettenende geändert wurde, sind verwendet worden. Dies ermöglicht präzise Kontrolle über Liganden Inhalte auf der Oberfläche, da Partikelzusammensetzung Eingabedatenstrom Zusammensetzung^23,48widerspiegelt. Ebenso ist es möglich, mehrere Kernkomponenten sowie, zu integrieren, wie Farbstoffe und anorganische Nanopartikel^3,8.

Flash-NanoPrecipitation ist eine skalierbare Annäherung an Polymeren Nanopartikel bestehend aus entweder einer hydrophoben bzw. hydrophilen Kern. Wenn die oben aufgeführten Kriterien erfüllt sind, wird in der Regel mehr als 95 % des Kernmaterials bei hohen Massenanteil in der Partikel gekapselt. Die drei Beispiele, die hier vorgestellten erfolgten zu Tischwaage, erfordert ein paar Milligramm des Materials und ca. 0,5 mL in jeder Bucht-Stream. Dies ermöglicht eine schnelle Screening von Partikel-Bedingungen für die Formulierung Optimierung. Scale-Up von Blei Formulierungen zu größeren Losgrößen ist eine Frage der Ausführung des Prozesses länger, die leicht durch den Einsatz von Spritzenpumpen oder Flow Controller erreicht werden kann. Im Gegensatz dazu steht das Scale-Up von Bulk-Zusatz-Nanoprecipitation gut dokumentierte Herausforderungen Aufrechterhaltung ausreichender Micromixing zum Zeitpunkt der Zugabe und Rechnungswesen für die Auswirkung einer Änderung Schiff Geometrie⁴⁹. Dies ist ein großes Hindernis, da es entscheidend ist, Partikel in konsistenter Weise kennenlernen FDA Anforderungen⁵⁰herzustellen. Mikrofluidik Techniken können auch einheitliche, reproduzierbare Nanopartikel zu produzieren, aber nur ermöglichen Produktion im Milligramm-Bereich. Zum Beispiel berichtete Karnik Et Al. Produktionsraten von 0,25 mg/min für eine Wirkstofffreisetzung⁵¹studieren. Weitere Skalieren bedeutet in der Regel Parallelisierung bei hohen Kapitalkosten¹². Mit FNP ist es einfach, 1 Gramm von Nanopartikeln mit 600 mg/min mit einer Spritzenpumpe und ein paar Beschläge zum Verbinden mit der Mixer-Eingänge zu produzieren. Infolgedessen stellt FNP eine zugängliche Labormaßstab Screening-Tool sowie einen skalierbaren Ansatz für NP-Produktion für Translationale Arbeit.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confined Impinging Jets Mixer	NA	NA	See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Luer fitting	Idex Health & Science	P-604	Assemble on CIJ or MIVM mixer inlet with corresponding threads
Plug fitting	Idex Health & Science	P-309	Assemble on CIJ mixer sides (seal access point from drilling)
Outlet fitting - CIJ	Idex Health & Science	P-205	Assemble with ferrule and tubing on CIJ chamber outlet
Outlet ferrule - CIJ	Idex Health & Science	P-200	Assemble with outlet fitting (large end flush with tubing)
Outlet tubing - CIJ	Idex Health & Science	1517	Use tubing cutter for clean ends. Ensure extra tubing doesn't protrodue into mixing chamber
Tetrahydrofuran (THF)	Fisher Scientific	T425-4	Use stabilizer-free THF to avoid solubility limits of BHT. Peroxides may interfere in some applications.
Norm-ject syringe (3 ml)	VWR	53548-017
Vitamin E (α-tocopherol)	Sigma-Aldrich	90669-50G-F	Store cold
poly(styrene-b-ethylene glycol), PS1.6k-b-PEG5k	Polymer Source	P13141-SEO	Other block sizes acceptable depending on application
poly(styrene)1.8k	Polymer Source	P2275-S	Example hydrophobic core material
Scintillation vial	DWK Lifesciences	74504-20
Luer-slip plastic syringes, 1ml (100 pk)	National	S7510-1
Maltodextrin DE 4-7	Sigma-Aldrich	419672-100G
poly(styrene-b-acrylic acid), PS5k-b-PAA4.8k	Polymer Source	P5917-SAA	Other block sizes acceptable depending on application
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D159-4
Calcium chloride dihdyrate	Sigma-Aldrich	223506-25G	Hygroscopic.
Methanol	Fisher Scientific	A452-4
Ammonium Hydroxide	Fisher Scientific	AC423300250
Albumin from chicken egg white (Ovalbumin, OVA)	Sigma-Aldrich	A5503-1G
Multi-Inlet Vortex Mixer	NA	NA	See supplemental information for engineering drawings. Review text for new mixer validation
Outlet fitting - MIVM	Idex Health & Science	P-942	Combination with ferrule
Outlet tubing - MIVM	NA	NA	Fit to ferrule ID.
O-ring (MIVM)	C.E. Conover	MM1.5 35.50 V75	Order bulk - consumable part. Ensure solvent compatibility if using an alternative source.
Mixer stand	NA	NA	See Markwalter & Prud'homme for design.17