Isolierung der embryonalen Gewebe und die Bildung von Wachteln-Huhn Chimären Organe Thymus am Beispiel

Zusammenfassung

Dieser Artikel enthält eine Methode, um reine embryonalen Gewebe von Wachteln und Hühner-Embryonen zu isolieren, die kombiniert werden können, um ex Vivo Chimären Organe.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit zur embryonalen Gewebe isolieren war ein wesentlicher Schritt für die Gründung der Wachtel-Huhn Chimera-System, das wiederum unbestritten Beiträge zur Enthüllung Schlüsselprozesse in der Entwicklungsbiologie zur Verfügung gestellt hat.

Hierin ist eine optimierte Methode um embryonale Gewebe von Wachteln und Hühner durch Mikrochirurgie und enzymatische Verdauung unter Beibehaltung seiner biologischen Eigenschaften zu isolieren beschrieben. Nach Isolierung sind Gewebe aus beiden Arten in einem in-vitro-organotypischen Assay für 48 h. Wachtel und Huhn Gewebe können durch unterschiedliche Kernmerkmale und molekulare Marker ermöglicht die Untersuchung der zellulären Übersprechen zwischen diskriminiert werden artfremden Verband der Gewebe. Dieser Ansatz ist daher ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung komplexer Gewebe Wechselwirkungen in Entwicklungsprozessen mit hochdynamischen räumliche Änderungen, wie die auftretenden pharyngealen Morphogenese und die Bildung von der foregut Entoderm abgeleitet Organe. Dieser Versuchsansatz wurde zuerst entwickelt, um die epitheliale-mesenchymale Interaktionen während der frühen Stadien der Thymus Bildung zu untersuchen. In diesem, das Entoderm abgeleitet prospektive Zebrafischembryonen Rudiment und Mesoderm abgeleitet Mesenchym waren bzw. von Wachteln und Hühner-Embryonen, isoliert.

Die Kapazität der damit verbundenen Gewebe, Organe zu generieren kann weiter durch Pfropfung sie auf chorioallantoic Membrane (CAM) von einem Huhn Embryo getestet werden. Die CAM liefert Nährstoffe und Gasaustausch der explantierten Gewebe ermöglicht. Nach 10 Tagen in Ovo Entwicklung können die Chimäre Organe in der geernteten Explantaten morphologische konventionell analysiert werden. Dieses Verfahren ermöglicht auch studieren gewebespezifischen Beiträge während Orgel-Formation, von seiner ersten Entwicklung (in vitro) in der Endphase der Organogenese (bei Ovo-Entwicklung).

Schließlich bietet die verbesserte Isolation-Methode auch dreidimensional (3D) erhalten embryonalen Gewebe, das auch für hochauflösende topografische Analyse der gewebespezifischer Genexpression Muster verwendet werden können.

Einleitung

In den frühen 1970er Jahren entwickelte sich eine elegante Wachtel-Huhn-Chimäre-System von Le Douarin, öffnen neue Wege um zu verstehen, die Rolle der Zellwanderung und zellulären Interaktionen während der Entwicklung^1,2. Das Modell wurde unter der Prämisse entwickelt, dass Zelle Austausch zwischen den beiden Arten Embryogenese, später bestätigt, wenn verwendet, um die zahlreichen Entwicklungsprozesse, einschließlich die Bildung des Nervensystems und der hämatopoetischen studieren nicht erheblich stören würde Systeme¹. Wobei letzteres als Vorbild, die zyklischen Wellen der hämatopoetischen Vorläuferzellen besiedeln die Zebrafischembryonen epithelialen Rudiment wurde erstmals beobachtet mit Hilfe der Wachtel-Huhn Chimäre System³. Dafür war das prospektive Gebiet des Thymus, das Entoderm des dritten und vierten pharyngealen Beutel (3/4PP), in 15 bis 30 - Somiten Stadium [embryonalen Tag (E) 1,5-E2.5] mechanisch und enzymatisch von Wachteln (Q) Embryonen isoliert. Diese Stufen entsprechen Huhn Hamburger und Hamilton⁴ (HH) - Stufen 12-17. Die Isolierungsmaßnahmen begann mit dem Einsatz von Trypsin enzymatisch das Entoderm aus der beigefügten Mesenchym distanzieren. Das isolierte Entoderm wurde in der Somatopleura Region eines Host Huhn (c) Embryos bei E3-3,5 (HH-Stufen 20-21) veredelt. Diese heterologen Mesenchym galt "permissive" Zebrafischembryonen Epithel Entwicklung tragen auch zur Orgel Formation³. Danach infiltriert aufeinanderfolgende Wellen Huhn Host Blut übertragbare Vorläuferzellen der Wachtel Spender Zebrafischembryonen epithelialen Gegenstück zur Thymus-Bildung in der Host-Embryo-³.

Vor kurzem wurde eine modifizierte Version dieses Ansatzes als auch wichtig für das Studium epitheliale-mesenchymale Interaktionen während der frühen Stadien der Thymus Bildung⁵erwiesen. In dieser Hinsicht waren beteiligt an der Gründung des ektopische Thymus Chimäre Embryonen³ Gewebe isoliert, beide aus Spender und Host Embryonen und ex Vivo verbunden. Eine verbesserte Protokoll wurde verwendet, um die Wachteln 3/4PP Entoderm (E2.5-E3) und das Huhn Somatopleura Mesoderm (E2.5-E3) zu isolieren. Kurz, wurden embryonale Gewebe isoliert durch Mikrochirurgie und nach Maßgabe der in-vitro-Pankreatin Verdauung. Außerdem wurden die Bedingungen der enzymatischen Verdauung, Temperatur und Zeit der Inkubation nach Gewebetyp und Entwicklungsstadium (Tabelle 1) optimiert.

Als nächstes wurden isolierte Gewebe in ein organotypischen in Vitro System für 48 h, wie bereits berichtet^5,6verbunden. Der in-vitro-Verband der Gewebe imitiert die lokalen zellulären Interaktionen im Embryo, einige Einschränkungen der in-vivo Manipulation zu überwinden. Dieses System ist besonders nützlich, um zelluläre Interaktionen in komplexen morphogenen Ereignisse, z. B. die Entwicklung der pharyngealen Vorrichtung zu untersuchen.

Der Beitrag der einzelnen Gewebe im Thymus Histogenese, sowie die Fähigkeit des Vereins artfremden eine Thymus generieren kann weiter erforscht mit Hilfe der CAM-Methodik, zuvor detaillierte^5,7,8. Kurz und bündig, waren die kultivierten Gewebe aufgepfropft CAM cE8 Embryonen und erlaubt, in Ovo für 10 Tage zu entwickeln. Dann wurde Thymus Bildung durch morphologische Analyse in der geernteten Explantaten bewertet. Wie in den Altertumswissenschaften Wachtel-Huhn³wurde der Wachtel Zebrafischembryonen Epithel von hämatopoetischen Vorläuferzellen (HPCs) abgeleitet vom Huhn Embryo, die später gezeigt wurde, beitragen zur Orgel Entwicklung^{9,10 besiedelt.} . Die HPCs migriert vom Embryo, ektopische Chimären Thymus bis stark vaskularisierte CAM^5,7,,⁸. Wachtel abgeleiteten Zebrafischembryonen Epithel von Immunohistochemistry mit Spezies-spezifische Antikörper (d. h. QCPN - MAb Wachtel Perinukleäre), Überwindung der Notwendigkeit einer Gewebe-spezifische molekulare Marker identifiziert werden kann.

Diese experimentelle Methode ermöglicht als die zweistufigen Ansatz in früheren Veröffentlichung⁸, berichtet die Modulation der Signalwege durch regelmäßige Gabe von pharmakologischen Wirkstoffen bei in-vitro- und in Ovo Entwicklung. Explantaten können auch zu jedem Zeitpunkt des Kurses der Experiment⁸geerntet werden.

Schließlich ermöglicht die Isolierung Protokoll hier detailliert die Erhaltung der natürlichen Eigenschaften und 3D-Architektur der embryonalen Gewebe, besonders nützlich für die Detaillierung in-situ-gen-Expressionsmuster von embryonalen Territorien ansonsten unzugänglich durch konventionelle Methoden. Transkriptom-Analyse-Ansätze, einschließlich RNA-Seq oder Microarrays, können darüber hinaus auch in isolierten Geweben ohne genetische Marker und bietet gleichzeitig eine gewebespezifische Hochdurchsatz "Omics" Analyse angewendet werden.

Protokoll

Alle diese Experimente zu folgen, die Pflege der Tiere und ethischen Richtlinien des Centro Académico de Medicina de Lisboa.

(1) befruchtet Wachteln und Huhn-Ei-Inkubation

1. Ort befruchtete Eier von der japanischen Wachtel (Coturnix Coturnix Japonica) in einem befeuchteten Inkubator von 38 ° C für 3 Tage. Brüten Sie die Eier (Ei stumpfen Ende) nach oben in die Luftkammer.
   Hinweis: Die feuchte Umgebung wird erreicht, indem ein Wasserbehälter an der Unterseite des Inkubators.
2. Inkubieren Sie befruchtete Eier Huhn (Gallus Gallus) für 2,5 Tage in einem befeuchteten Inkubator von 38 ° C. Brüten Sie die Eier in eine horizontale Position und markieren Sie die Oberseite mit einem Stück Holzkohle um die Embryo-Standort zu ermitteln.
   Hinweis: Beginnen Sie mit 40 Wachteleier und 60 Hühnereier Festlegung dieses Experiment.

2. Isolierung der Wachtel Entoderm, enthält die zukünftige Domain Zebrafischembryonen rudiment

Hinweis: Verwenden Sie eine horizontale Laminar-Flow-Kapuze und sterilisierte Instrumente und Materialien für Ei Manipulation Verfahren unter sterilen Bedingungen.

1. Die embryonale Region mit mutmaßlichen Gebietder Zebrafischembryonen Rudiment entfernen, die pharyngealen Bogen Region mit 3^rd und 4^th Bögen (3/4PAR), wie beschrieben^7,8.
   1. Füllen Sie eine große Borosilikat Glasschüssel (100 x 50 mm; 100 cm³) mit 60 mL kalte Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
   2. Tippen Sie mit Hilfe der gebogenen Schere auf und schneiden Sie ein kreisrundes Loch in der Schale eine Wachtel Ei, das für 3 Tage inkubiert worden. Machen Sie das Loch auf der gegenüberliegenden Seite des Eies stumpf und übertragen Sie das Eigelb (mit dem Embryo) in die Schüssel mit kaltem PBS zu.
   3. Entfernen Sie den Embryo aus dem Dotter durch die Dotterhäutchen Membran extern zu extraembryonalen Schiffe mit einer gebogenen Schere schneiden.
   4. Mit Hilfe von dünnen Zange Transfer des Embryos in einer kleinen Schüssel (60 x 30 mm; 15 cm³) mit 10 mL kaltem PBS gefüllt.
   5. Mit einem Schaumlöffel, bewegen den Embryo mit einem 100 mm Petrischale mit einem schwarzen Sockel (siehe Tabelle der Materialien), enthält 10 mL kaltem PBS und legen Sie es unter einem Stereomikroskop.
   6. 3/4PAR, wie zuvor beschrieben⁸zu sezieren.
   7. Aspirat 3/4PAR und Transfer in eine Glasschale drei Viertel mit kaltem PBS mit einer 2 mL sterile Pasteurpipette gefüllt.
2. Das Entoderm mit mutmaßlichen Gebietder Zebrafischembryonen Rudiment (3/4PP Entoderm) durch enzymatische Verdauung mit Pankreatin zu isolieren.
   1. Mit Hilfe von Spachtel und dünne Zange Transfer 3/4PAR in einer Glasschale drei Viertel mit kalten Pankreatin (8 mg/mL; 1:3-Verdünnung von 25 mg/mL mit kaltem PBS) gefüllt.
   2. 1 h auf dem Eis für die enzymatische Verdauung inkubieren.
      Hinweis: Die Zeit der enzymatischen Verdauung hängt von der Phase der Entwicklung (Tabelle 1).
   3. Legen Sie die Glasschale unter dem Stereomikroskop (40 x-60 X Vergrößerung), das Entoderm aus 3/4PAR zu isolieren.
      Hinweis: Halten Sie alle Flächen und Lösungen kalt während dieses Vorgangs. In einer neuen kalten Pankreatin-Lösung ändern, wenn sehr lange, das Gewebe zu zergliedern (> 15 min). Als eine Lichtquelle verwenden Sie LED-Leuchten im Stereomikroskop oder in der optischen Fasern aufgenommen, in Anbetracht der begrenzten Wärmelast.
   4. Um das Entoderm aus dem umliegenden Gewebe zu isolieren, verwenden Sie zwei Edelstahl-Microscalpels in Pin-Halter.
      Hinweis: Verwenden Sie Microscalpels mit einem Durchmesser zwischen 0,1 mm und 0,2 mm und Nickel-Pin-Halter mit einem Kiefer Öffnung von 0 mm bis 1 mm Durchmesser.
      1. Entfernen Sie zuerst das Neuralrohr und Mesoderm an der dorsalen Oberfläche des pharyngealen Entoderm befestigt.
      2. Mit der dorsalen Seite nach oben vorsichtig lösen Sie und entfernen Sie das Mesenchym zwischen den Rachenraum Bögen und setzen Sie der pharyngealen Beutel. Führen Sie dieses Verfahren auf beiden Seiten 3/4PAR.
      3. Entfernen Sie das Herz Rohr und das Mesenchym rund um den vorderen Taschen.
      4. Schneiden Sie mit der ventralen Seite nach oben dem Ektoderm der 2^Nd und 3^rd pharyngealen Bögen und entfernen Sie vorsichtig das Mesenchym der Beutel befestigt. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der anderen Seite 3/4PAR. In dieser Phase sollte die Schilddrüse Rudiment sichtbar sein.
      5. Entfernen Sie alle verbleibenden mesenchymalen Zellen an der pharyngealen Entoderm mit zwei Microscalpels befestigt.
      6. Machen Sie einen transversalen Schnitt zwischen den 2^Nd und 3^rd PP, Wehre die pharyngealen Entoderm, enthält 3^rd und 4^th Beutel aus dem vorderen Teil des das Entoderm, die Schilddrüse Rudiment und 2^nd pharyngealen Beutel.
      7. Mit Hilfe von Spachtel und dünne Zange isoliert 3/4PP Entoderm Transfer in eine Glasschale drei Viertel mit 100 % kalt fetalen bovine Serum (FBS) gefüllt.
3. Halten Sie die Glasschale mit den isolierten Geweben auf Eis während der Vorbereitung der in-vitro-Assay. Alternativ die isolierte Gewebe dreidimensional erhalten werden können und in-situ auf Genexpression analysiert.

3. Isolation von Huhn Somatopleura mesoderm

Hinweis: Führen Sie Ei Manipulation Verfahren unter sterilen Bedingungen mit einer horizontalen Laminar-Flow-Kapuze und sterilisierte Instrumente und Materialien.

1. Entfernen Sie die embryonale Territorium mit der Somatopleura Mesoderm auf der Ebene der Somiten 19-24 (19-24).
   1. Entfernen Sie das Huhn-Ei aus dem Inkubator, nach 2,5 Tagen Inkubationszeit.
   2. Öffnen Sie mit einer gebogenen Schere ein kleines Loch in der Schale. Legen Sie eine Nadel und aspirieren Sie 2 mL Albumin mit einer 10 mL Spritze, Albumin Lautstärke innerhalb des Eies und Beschädigung des Embryos (befindet sich unter den markierten Bereich der Schale). Entsorgen Sie die angesaugte Albumin.
   3. Schneiden Sie eine kreisförmige Bohrung (bis zu zwei Drittel der oberen Fläche) in den markierten Bereich der Schale mit einer gebogenen Schere.
   4. Schneiden Sie die Dotterhäutchen Membran nach außen zu den extraembryonic Gefäßen während Sie den Embryo mit dünnen Zange halten.
   5. Legen Sie unter einem Stereomikroskop den Embryo in einem 100 mm Petrischale mit einem schwarzen Sockel mit 10 mL kaltem PBS.
      Hinweis: Verwenden Sie ein Stereomikroskop von diesem Punkt vorwärts für progressive Vergrößerung der Mikrochirurgie Verfahren.
   6. Verwenden Sie vier dünne Insekten Pins des Embryos an der Unterseite der Platte zu halten. Legen Sie die Stifte in den extraembryonic Region bilden eine quadratische Form.
   7. Durchführen Sie zwei Einschnitte zwischen den Somiten 19 und 24 quer zur Achse Embryo und überschreiten alle Embryo-Gebiet, mit einer Schere Wecker Auge.
   8. Lösen Sie Abschnitt Embryo, 19-24, indem marginal embryonalen Kanten schneiden.
   9. Absaugen der 19-24 Gewebe und Transfer in eine Glasschale drei Viertel gefüllt mit kaltem PBS mit einer 2 mL sterilen Pasteurpipette.
2. Isolieren Sie die seitlichen Mesoderm aus Somatopleura Region (19-24) durch enzymatische Verdauung mit Pankreatin (8 mg/mL; 1:3-Verdünnung von 25 mg/mL mit kaltem PBS).
   1. Mit Hilfe von Spachtel und dünne Zange, Übertragung Schale 19-24-Gewebe zu einem Glas drei Viertel gefüllt mit kaltem Pankreatin Lösung.
   2. 30 min auf Eis für die enzymatische Verdauung inkubieren.
   3. Isolieren Sie unter dem Stereomikroskop das Mesoderm aus dem umliegenden Gewebe mit zwei Microscalpels in einer Halterung.
      Hinweis: Halten Sie alle Flächen und Lösungen kalt während dieses Vorgangs. In einer neuen kalten Pankreatin-Lösung ändern, wenn sehr lange, das Gewebe zu zergliedern (> 10 min.). Als eine Lichtquelle verwenden Sie LED-Leuchten im Stereomikroskop oder in der optischen Fasern aufgenommen, in Anbetracht der begrenzten Wärmelast.
   4. Während Mesoderm Isolierung entfernen Sie zunächst das Ektoderm an der Oberfläche, gefolgt von der sorgfältigen Ablösung der ventral befindet sich Splancnopleura Gewebe.
   5. Lassen Sie das rechten seitliche Mesoderm der Somatopleura durch Schneiden in einer parallelen Bewegung auf das Neuralrohr.
   6. Wiederholen Sie die Mesoderm Trennung von der linken Seite des Embryos.
      Hinweis: Achten Sie Microscalpel Bewegungen während dieses Vorgangs zu verlangsamen. Die exponierten extrazellulären Matrixproteine halten Sie sich an Gewebe und Instrumente fließende Bewegungen zu verhindern.
   7. Mit Hilfe von Spachtel und dünne Zange Übertragung der isolierten Mesoderm in einer Glasschale drei Viertel mit kalten FBS gefüllt.
3. Halten Sie die Glasschale mit den isolierten Geweben auf Eis während der Vorbereitung der in-vitro-Assay.

4. In-vitro- organotypischen Assay: artfremden Verband der Wachtel 3/4PP Entoderm und Huhn Somatopleura Mesoderm

1. Bereiten Sie das Kulturmedium mit RPMI-1640 Medium mit 10 % FBS und 1 % Pen/Strep^3,5ergänzt.
2. Platzieren Sie ein Metallgitter in einem 35 mm Petrischale mit 5 mL Kulturmedium.
   Hinweis: Entfernen Sie das überschüssige Flüssigkeit, die mittlere Fläche mit dem oberen Rand des Rasters zu ebnen.
3. Tauchen Sie mit Hilfe von dünnen Pinzette ein Membranfilter in das Kulturmedium ein und dann legen Sie es oben auf das Gitter zu einer Oberfläche in Kontakt mit Luft haben.
   Hinweis: Ein Viertel der Membranfläche (mit 13 mm Durchmesser) ist ausreichend für die Gewebe-Association.
4. Assoziieren Sie unter dem Stereomikroskop die isolierte Gewebe an der Oberseite der Membranfilter. Zuerst das 3/4PP Entoderm (Schritt 2) aus der Glasschale zu übertragen, indem Sie sanft mit Hilfe einer Transplantation Löffel (oder Spachtel) und dünne Zange. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die isolierte Mesoderm (Schritt 3).
   Hinweis: Mit Hilfe eines Microscalpel, mischen Sie das Gewebe um die Assoziation zu maximieren.
5. Legen Sie vorsichtig die damit verbundenen Gewebe in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO₂ für 48 h. kultivierten Gewebe auf chorioallantoic Membrane (CAM) verpflanzt werden können.
   Hinweis: Ektopische Orgel Formation in der CAM war zuvor detaillierte⁸.

Ergebnisse

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Vogelgrippe embryonalen Gewebe in verschiedene Zell- und Entwicklungsbiologie Biologie technische Ansätze zu verwendenden isolieren. Diese Methode wurde früher eingesetzt, um epitheliale-mesenchymale Interaktionen während der frühen Stadien der Thymus Bildung⁵zu untersuchen. Hier werden neue Ergebnisse in Abbildung 1 und Abbildung 2, mit ähnlichen Ansätzen da...

Diskussion

Das embryonale Gewebe isoliert Verfahren hier detailliert wurde aus früheren Techniken herstellen Wachtel-Hühnerembryos Chimären in verschiedenen biologischen Zusammenhängen^3,5,6verbessert.

Dieser Ansatz eignet sich für reine embryonalen Gewebe ohne Genmanipulation oder die Verwendung von Gewebe-spezifische Marker, die sind oft unbestimmt, Begrenzung der Verwendung von gentechnisch veränderten T...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)	Pintobar, Portugal		Poultry farm
Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)	Interaves, Portugal		Bird farm
15 mL PP centrifuge tubes	Corning	430052
50 mL PP centrifuge tubes	Corning	430290
60 x 20 mm pyrex dishes	Duran group	21 755 41
100 x 20 mm pyrex dishes	Duran group	21 755 48
Metal grid	Goodfellows		fine meshed  stainless steel grid
Membrane filter	Millipore	DTTP01300	0.6 mm Isopore membrane filter
Petri dish, 35 x 10 mm	Sigma-Aldrich	P5112
60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)			from supermarket
100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)			from supermarket
Transfer pipettes	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	2041S	2 mL plastic pipet
Glass pasteur pipette	Normax	5426015
Clear plastic tape			from supermarket
Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5	BMA Biomedicals	T-1302
Fetal Bovine Serum	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific		Standart FBS
Pancreatin	Sigma-Aldrich	P-3292	Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	GIBCO, Thermo Fisher Scientific	10010023
QCPN antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	QCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	GIBCO, Thermo Fisher Scientific	61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit	ELKEM/Silmid	RH141001KG	To prepare the back base for petri dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Thin forceps
Extra fine Bonn scissors, curved	Fine Science Tools	14085-08	Curved scissors
Insect pins	Fine Science Tools	26001-30	0.3 mm Stainless steel pin
Micro spatula	Fine Science Tools	10087-12	Transplantation spoon
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-20	0.2 mm Stainless steel microscalpel
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10	0.1 mm Stainless steel microscalpel
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Nickel plated pin holder
Moria Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-17	Skimmer
Wecker Eye Scissor	Fine Science Tools	15010-11
Camera	Leica Microsystems	MC170 HD
Microscope	Leica Microsystems	DM2500
NanoZoomer S360 Digital slide scanner	Hamamatsu Photonics	C13220-01
Stereoscope	Leica Microsystems	Leica M80