Isolement des tissus embryonnaires et la Formation des organes chimériques caille-poulet à l’aide de l’exemple du Thymus

Résumé

Cet article fournit une méthode pour isoler les tissus embryonnaires pures de caille et poulet des embryons qui peuvent être combinés pour former ex vivo organes chimérique.

Résumé

La capacité d’isoler les tissus embryonnaires constituait une étape essentielle pour établir le système de caille-poulet chimère, qui à son tour a contribué incontesté au dévoilement des processus clés en biologie du développement.

Dans les présentes est décrit une méthode optimisée pour isoler des tissus embryonnaires de cailles et de poulets par la microchirurgie et la digestion enzymatique tout en conservant ses propriétés biologiques. Après l’isolement, les tissus de ces deux espèces sont associés lors d’un test in vitro organotypique pendant 48 h. caille et tissus de poulet peuvent être distinguées par caractéristiques nucléaires distinctes et des marqueurs moléculaires permettant l’étude de la diaphonie cellulaire entre hétérospécifiques association des tissus. Cette approche est donc un outil utile pour étudier les interactions de tissu complexe dans le processus de développement avec des modifications spatiales très dynamiques, telles que celles survenant au cours de la morphogénèse du pharynx et de la formation de l’intestin antérieur organes dérivés endoderme. Cette approche expérimentale a été développée afin d’étudier les interactions épithéliale-mésenchymateuse durant le début de la formation du thymus. À cet égard, l’endoderme dérivés de prospective rudiment thymique et dérivés mesoderm mésenchyme, ont été isolés des embryons de caille et de poulet, respectivement.

La capacité des tissus associés à produire des organes peut être analysée plus loin en leur greffant sur la membrane Chorio-(CAM) d’un embryon de poulet. La came fournit des nutriments et permet les échanges gazeux dans les tissus explantés. Après 10 jours de développement ovo, les organes chimériques peuvent être analysés dans les explants récoltés par les méthodes morphologiques classiques. Cette procédure permet également étudier des contributions spécifiques des tissus au cours de la formation des organes, de ses initial (développement in vitro) pour la phase finale de l’organogenèse (en développement ovo).

Enfin, la méthode d’isolation améliorée fournit également en trois dimensions (3D) préserver les tissus embryonnaires, qui peuvent également être utilisés pour une analyse topographique haute résolution des modèles d’expression génique spécifique aux tissus.

Introduction

Dans les années 1970, un système élégant caille-poulet chimère a été développé par Le Douarin, ouvrant de nouvelles pistes pour comprendre le rôle de la migration cellulaire et interactions cellulaires au cours du développement^1,2. Le modèle a été conçu en partant du principe qu’échange de cellules entre les deux espèces ne perturberait pas significativement l’embryogenèse, confirmé plus tard lorsqu’il est utilisé pour étudier les nombreux processus de développement, y compris la formation du système nerveux et le hématopoïétique systèmes de¹. Prendre ce dernier à titre d’exemple, les vagues cycliques de progéniteurs hématopoïétiques qui colonisent le rudiment épithélial thymique fut observée à l’aide de la chimère de la caille-poulet système³. Pour cela, le territoire prospectif du thymus, l’endoderme des troisième et quatrième du pharyngés sachets (3/4PP), a été isolé mécaniquement et enzymatiquement embryons de caille (q) de 15 à 30 - stade de segments [1,5-E2.5 jour embryonnaire (E)]. Ces trois phases correspondent au poulet Hamburger et Hamilton⁴ (HH) - étapes 12-17. Les procédures d’isolement a commencé avec l’utilisation de trypsine enzymatiquement dissocier l’endoderme du mésenchyme ci-joint. L’endoderme isolé a été greffé dans la région de somatopleura d’un embryon de poulet (c) hôte à E3-E3.5 (HH-étapes 20 et 21). Ce mésenchyme hétérologue était considéré comme « permissive » au développement de l’épithélium thymique contribuant également à l’orgue formation³. Par la suite, des vagues successives de cellules progénitrices véhiculés par le sang de poulet hôtes infiltré la caille donneur thymiques épithéliales homologue contribuant à la formation du thymus chez l’hôte embryon³.

Plus récemment, une version modifiée de cette approche s’est avérée aussi important pour étudier les interactions épithéliale-mésenchymateuse durant le début de la formation de thymus⁵. À cet égard, les tissus impliqués dans la formation du thymus ectopique dans les embryons chimères³ ont été isolés, tous deux provenant d’embryons de donneurs et hôte et associés ex vivo. Un protocole amélioré a permis d’isoler l’endoderme 3/4PP de caille (E2.5-E3) et le mésoderme somatopleura de poulet (E2.5-E3). Brièvement, les tissus embryonnaires ont été isolées par microchirurgie et sous réserve de la digestion in vitro pancréatine. Aussi, les conditions de la digestion enzymatique, température et temps d’incubation ont été optimisées selon les tissus-type et le stade de développement (tableau 1).

Ensuite, les tissus isolés étaient associés dans un organotypique système in vitro pendant 48 h, comme indiqué précédemment^5,6. L’association in vitro de tissus imite les interactions cellulaires les dans l’embryon, de surmonter certaines restrictions de la manipulation in vivo. Ce système est particulièrement utile pour étudier les interactions cellulaires dans les événements morphogène complexes, comme le développement de l’appareil pharyngien.

La contribution de chacun des tissus dans l’histogenèse du thymus, ainsi que la capacité de l’association hétérospécifiques pour générer un thymus peut être davantage explorés en utilisant la méthodologie de CAM, précédemment détaillées^5,7,8. Succinctement, les tissus cultivés ont été greffés sur la came d’embryons cE8 et laissés se développer en ovo pendant 10 jours. Ensuite, la formation du thymus a été évaluée par analyse morphologique dans les explants récoltés. Comme dans les études classiques de caille-poulet³, l’épithélium thymique caille a été colonisée par les cellules progénitrices hématopoïétiques (HPCs) provenant de l’embryon de poulet, qui s’est avéré plus tard contribuer à orgue développement^9,10 . Les bactéries hétérotrophes ont migré de l’embryon vers le thymus chimérique ectopique à le fortement vascularisé CAM^5,7,8. Caille épithélium thymique dérivée peut être identifié par immunohistochimie à l’aide d’anticorps spécifiques à l’espèce (c'est-à-dire, QCPN - MAb caille périnucléaire), surmontant le besoin de marqueurs moléculaires spécifiques des tissus.

Cette méthode expérimentale, comme l’approche en deux étapes dans la précédente publication⁸, permet la modulation des voies de signalisation par l’administration régulière d’agents pharmacologiques pendant in vitro et dans le développement d’ovo. En outre, des explants peuvent être récoltées en tout temps-point du cours de l’expérience de⁸.

Enfin, le protocole détaillé ici permet la préservation des propriétés naturelles et 3D-architecture des tissus embryonnaires, particulièrement utiles pour détailler les modèles d’expression génique in situ des territoires embryonnaires autrement inaccessibles par méthodes conventionnelles. En outre, transcriptome analysis approches, y compris les RNA-seq ou microarrays, peuvent également être appliquées dans les tissus isolés sans nécessiter de marqueurs génétiques tout en fournissant une analyse de « omiques » de tissu-spécifiques à haut débit.

Protocole

Toutes ces expériences suivent les soins aux animaux et les lignes directrices éthiques de la Centro Académico de Medicina de Lisboa.

1. fécondés d’incubation des oeufs de caille et poulet

1. Place fertilisé des oeufs de caille japonaise (Coturnix japonica coturnix) dans un incubateur humidifié à 38 ° C pendant 3 jours. Incuber les œufs (extrémité émoussée oeuf) vers le haut dans la chambre à air.
   Remarque : L’environnement humidifié est réalisé en plaçant un récipient d’eau au fond de la couveuse.
2. Incuber les œufs fécondés de poulet (Gallus gallus) 2,5 jours dans un incubateur humidifié à 38 ° C. Incuber les œufs dans une position horizontale et marquer le dessus à l’aide d’un morceau de charbon de bois pour identifier l’emplacement de l’embryon.
   Remarque : Commencez par 40 œufs de caille et 60 oeufs de poule lors de l’établissement de cette expérience.

2. isolement de l’endoderme caille contenant le domaine éventuel du rudiment du thymus

Remarque : Utiliser une hotte à flux laminaire horizontal et les instruments stérilisés et les matériaux pour les procédures de manipulation des oeufs dans des conditions stériles.

1. Supprimer la région embryonnaire contenant le territoire présomptif du rudiment du thymus, de la région arche pharyngienne contenant les 3^rd et 4^ème arches (3/4PAR), comme le décrit^7,8.
   1. Remplir un bol en verre de borosilicate grand (100 x 50 mm ; 100 cm³) avec 60 mL de froide solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   2. Avec l’aide de ciseaux courbes, tap et couper un trou circulaire dans la coque d’une caille oeuf qui a été incubé pendant 3 jours. Faire le trou sur le côté opposé de le œuf émoussé et transférer le jaune (avec l’embryon) dans le bol avec du PBS froid.
   3. Retirer l’embryon du vitellus en coupant la membrane vitelline extérieurement aux vaisseaux extra embryonnaire à l’aide de ciseaux courbes.
   4. Transfert de l’embryon à un petit bol (60 x 30 mm ; 15 cm³) avec l’aide de pinces fines, rempli de 10 mL de PBS froid.
   5. Avec une écumoire, déplacer l’embryon à une boîte de pétri avec une base noire de 100 mm (voir Table des matières) contenant 10 mL de PBS froide et placez-le sous un stéréomicroscope.
   6. Disséquer le 3/4PAR, comme décrit précédemment⁸.
   7. Aspirer le 3/4PAR et les transférer dans un plat en verre trois quarts bac à froid à l’aide d’une pipette Pasteur stérile de 2 mL.
2. Isoler l’endoderme contenant le territoire présomptif du rudiment du thymus (l’endoderme 3/4PP) par digestion enzymatique avec pancréatine.
   1. Avec l’aide de la spatule et pince fine, transfert le 3/4PAR à un plat en verre trois quarts remplis de pancréatine froid (8 mg/mL ; dilution de 1:3 de 25 mg/mL avec du PBS froid).
   2. Incuber pendant 1 heure sur la glace pour la digestion enzymatique.
      NOTE : Le temps de digestion enzymatique dépend de la phase de développement (tableau 1).
   3. Placez le plat en verre sous le stéréomicroscope (grossissement de 40 x x-60) d’isoler l’endoderme de la 3/4PAR.
      NOTE : Gardez toutes les surfaces et les solutions de froid au cours de cette procédure. Changer pour une nouvelle solution de pancréatine froide si prenant beaucoup de temps à disséquer les tissus (> 15 min). Comme source d’illumination, utilisez des lumières LED incorporées dans le stéréomicroscope ou dans les fibres optiques, compte tenu de la charge de chaleur limitée.
   4. Pour isoler l’endoderme les tissus environnants, utilisez deux microscalpels inox porte-broche.
      Remarque : Utilisez microscalpels avec un diamètre compris entre 0,1 mm et 0. 2 mm et détenteurs de broche de nickel d’un diamètre d’ouverture de mâchoire de 0 mm à 1 mm.
      1. Commencez par retirer le tube neural et le mésoderme attaché à la face dorsale de l’endoderme pharyngien.
      2. Avec la face dorsale vers le haut, soigneusement détacher et enlever le mésenchyme entre les arcs pharyngiens et exposer les poches pharyngiennes. Exécutez cette procédure sur les deux côtés de la 3/4PAR.
      3. Enlever le tube de coeur et le mésenchyme entourant les sachets antérieurs.
      4. Avec la face ventrale vers le haut, coupez l’ectoderme de la 2^ème et 3^rd arcs pharyngiens et retirez avec précaution le mésenchyme attaché à ces sachets. Répétez cette procédure sur l’autre côté de la 3/4PAR. À ce stade, le rudiment de la thyroïde doit être visible.
      5. Supprimer toute cellules mésenchymateuses restants attachés à l’endoderme pharyngien avec les deux microscalpels.
      6. Faites une coupe transversale entre les 2^ème et 3^rd PP, en dissociant l’endoderme pharyngien contenant les 3^rd et 4 sachets de^th de la partie antérieure de l’endoderme ayant le rudiment de la thyroïde et 2^nd pochette du pharynx.
      7. Avec l’aide de la spatule et pince fine, transfert l’endoderme 3/4PP isolé dans un plat en verre trois quarts remplis de 100 % froid sérum bovin fœtal (SVF).
3. Garder le plat en verre avec les tissus isolés sur la glace lors de la préparation du test in vitro. Sinon, les tissus isolés peuvent être conservées en trois dimensions et analysées in situ pour l’expression génique.

3. isolement du mésoderme somatopleura poulet

Remarque : Effectuez des oeufs des procédures de manipulation en conditions stériles à l’aide d’une hotte à flux laminaire horizontal et les instruments stérilisés et les matériaux.

1. Retirez le territoire embryonnaire contenant le mésoderme somatopleura au niveau des somites 19-24 (ES19-24).
   1. Sortir l’oeuf de la poule de l’incubateur après 2,5 jours d’incubation.
   2. Avec des ciseaux courbes, ouvrez un petit trou dans la coque. Insérer une aiguille et aspirer 2 mL d’albumine avec une seringue de 10 mL pour diminuer le volume de l’albumine à l’intérieur de le œuf et de prévenir les dommages de l’embryon (situé au-dessous de la région marquée de la coquille). Jeter l’albumine aspiré.
   3. Couper une circulaire trou (jusqu'à deux-tiers de la surface supérieure) dans la région marquée de la coque à l’aide de ciseaux courbes.
   4. Couper la membrane vitelline extérieurement aux navires extra-embryonnaires tout en maintenant l’embryon avec une pince fine.
   5. Sous un stéréomicroscope, placer l’embryon dans une boîte de pétri de 100 mm avec une base noire contenant 10 mL de PBS froid.
      Remarque : Utilisez un stéréomicroscope à partir de ce moment pour un grossissement progressif des procédures de microchirurgie.
   6. Utilisez quatre broches insectes minces pour tenir l’embryon vers le bas de la plaque. Placer les goupilles dans la région extra-embryonnaires formant une forme carrée.
   7. Effectuer deux coupures entre les somites 19 et 24 transversalement à l’axe de l’embryon et traversant tout le territoire embryonnaire, à l’aide de ciseaux œil wecker.
   8. Libérer la section de l’embryon, ES19-24, par découpage des bords embryonnaires marginal.
   9. Aspirer l’ES19-24 tissus et le transfert à un plat en verre trois quarts bac à froid à l’aide d’une pipette Pasteur stérile de 2 mL.
2. Isoler le mésoderme latéral de la région de somatopleura (ES19-24) par digestion enzymatique avec pancréatine (8 mg/mL ; dilution de 1:3 de 25 mg/mL avec du PBS froid).
   1. Avec l’aide de la spatule et pince fine, transfert les tissus ES19-24 à un verre plat trois quarts remplis d’une solution froide pancréatine.
   2. Incuber pendant 30 minutes sur la glace pour la digestion enzymatique.
   3. Sous le stéréomicroscope, isoler le mésoderme les tissus environnants à l’aide de deux microscalpels dans un support.
      NOTE : Gardez toutes les surfaces et les solutions de froid au cours de cette procédure. Changer pour une nouvelle solution de pancréatine froide si prenant beaucoup de temps à disséquer les tissus (> 10 min.). Comme source d’illumination, utilisez des lumières LED incorporées dans le stéréomicroscope ou dans les fibres optiques, compte tenu de la charge de chaleur limitée.
   4. Lors de l’isolation du mésoderme, retirez d’abord l’ectoderme à la surface, suivie d’un détachement prudent des tissus splancnopleura situé sur le ventre.
   5. Libérer le mésoderme latéral droit de le somatopleura en le coupant dans un mouvement parallèle au tube neural.
   6. Répétez la séparation du mésoderme du côté gauche de l’embryon.
      Remarque : Faire ralentir les mouvements de microscalpel au cours de cette procédure. Les protéines de la matrice extracellulaire exposés collent aux instruments empêchant des mouvements fluides et les tissus.
   7. Avec l’aide de la spatule et pince fine transfert le mésoderme isolé dans un plat en verre trois quarts remplis de FBS froid.
3. Garder le plat en verre avec les tissus isolés sur la glace lors de la préparation du test in vitro.

4. In vitro organotypique dosage : association hétérospécifique de cailles 3/4PP endoderme et mésoderme somatopleura poulet

1. Préparer le milieu de culture avec milieu RPMI-1640 additionné de 10 % de SVF et 1 % Pen/Strep^3,5.
2. Placer une grille métallique dans un 35 mm boîte de pétri avec 5 mL de milieu de culture.
   NOTE : Enlever l’excès de liquide pour niveler la surface moyenne au dessus de la grille.
3. Avec l’aide de pinces fines, trempez une membrane filtrante dans le milieu de culture et puis placez-le sur le dessus de la grille pour avoir une surface de contact de l’air.
   Remarque : Un quart de la surface de la membrane (avec 13 mm de diamètre) est suffisant pour l’association de tissu.
4. Sous le stéréomicroscope, associer les tissus isolés sur le dessus de la membrane filtrante. Tout d’abord transférer l’endoderme 3/4PP (étape 2) du verre plat en glissant doucement à l’aide d’une cuillère de transplantation (ou une spatule) et mince forceps. Répétez cette procédure pour le mésoderme isolé (étape 3).
   Remarque : Avec l’aide d’un microscalpel, mélanger les tissus afin de maximiser son association.
5. Placer soigneusement les tissus associés dans un incubateur à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ à humidifié pour tissus cultivés de 48 h. peuvent être greffés sur la membrane Chorio-(CAM).
   NOTE : Formation des organes ectopique dans la came a été détaillé précédemment⁸.

Résultats

Le protocole décrit une méthode pour isoler les tissus embryonnaires aviaires pour être utilisé dans plusieurs approches de techniques de biologie cellulaire et du développement. Cette méthode a été précédemment employée pour étudier les interactions épithéliale-mésenchymateuse durant les premiers stades de formation de thymus⁵. Dans les présentes, nouveaux résultats sont indiqués dans la Figure 1 et

Discussion

La technique d’isolation de tissu embryonnaire détaillée ici a été améliorée depuis les précédentes techniques pour produire des embryons chimériques caille-poulet dans différents contextes biologique^3,5,6.

Cette approche consiste d’isoler des tissus embryonnaires pures sans nécessiter de manipulation génétique ou l’utilisation de marqueurs spécifiques des tissus, qui sont souvent ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chicken fertilized eggs (Gallus gallus)	Pintobar, Portugal		Poultry farm
Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix)	Interaves, Portugal		Bird farm
15 mL PP centrifuge tubes	Corning	430052
50 mL PP centrifuge tubes	Corning	430290
60 x 20 mm pyrex dishes	Duran group	21 755 41
100 x 20 mm pyrex dishes	Duran group	21 755 48
Metal grid	Goodfellows		fine meshed  stainless steel grid
Membrane filter	Millipore	DTTP01300	0.6 mm Isopore membrane filter
Petri dish, 35 x 10 mm	Sigma-Aldrich	P5112
60 x 30 mm pyrex bowls (Small size)			from supermarket
100 x 50 mm pyrex bowls (Large size)			from supermarket
Transfer pipettes	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	2041S	2 mL plastic pipet
Glass pasteur pipette	Normax	5426015
Clear plastic tape			from supermarket
Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5	BMA Biomedicals	T-1302
Fetal Bovine Serum	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific		Standart FBS
Pancreatin	Sigma-Aldrich	P-3292	Prepare a 25 mg/mL solution according to manufacturer's instructions; centrifuge and filter prior to aliquote and store at -20ºC. Aliquots can be kept frozen for several years.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	15140-122
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	GIBCO, Thermo Fisher Scientific	10010023
QCPN antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	QCPN
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	GIBCO, Thermo Fisher Scientific	61870010
Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit	ELKEM/Silmid	RH141001KG	To prepare the back base for petri dish
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-30	Thin forceps
Extra fine Bonn scissors, curved	Fine Science Tools	14085-08	Curved scissors
Insect pins	Fine Science Tools	26001-30	0.3 mm Stainless steel pin
Micro spatula	Fine Science Tools	10087-12	Transplantation spoon
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-20	0.2 mm Stainless steel microscalpel
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10	0.1 mm Stainless steel microscalpel
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12	Nickel plated pin holder
Moria Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-17	Skimmer
Wecker Eye Scissor	Fine Science Tools	15010-11
Camera	Leica Microsystems	MC170 HD
Microscope	Leica Microsystems	DM2500
NanoZoomer S360 Digital slide scanner	Hamamatsu Photonics	C13220-01
Stereoscope	Leica Microsystems	Leica M80