Gesichtsnervenchirurgie im Rattenmodell zur Untersuchung der axonalen Hemmung und Regeneration

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen reproduzierbaren Ansatz zur Gesichtsnervenchirurgie im Rattenmodell, einschließlich Beschreibungen verschiedener induzierbarer Verletzungsmuster.

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt konsistente und reproduzierbare Methoden zur Untersuchung der axonalen Regeneration und Hemmung in einem Modell für Die Nervenverletzungen der Ratte. Der Gesichtsnerv kann über seine gesamte Länge, vom intrakraniellen Segment bis zu seinem extratemporalen Verlauf, manipuliert werden. Es gibt drei primäre Arten von Nervenverletzungen, die für die experimentelle Untersuchung von regenerativen Eigenschaften verwendet werden: Nervenzerkleinerung, Transektion und Nervenspalt. Die Bandbreite der möglichen Interventionen ist riesig, einschließlich chirurgischer Manipulation des Nervs, Lieferung von neuroaktiven Reagenzien oder Zellen, und entweder zentrale oder Endorgan-Manipulationen. Zu den Vorteilen dieses Modells für die Untersuchung der Nervenregeneration gehören Einfachheit, Reproduzierbarkeit, Konsistenz zwischen Denspezies, zuverlässige Überlebensraten der Ratte und eine erhöhte anatomische Größe im Vergleich zu murinen Modellen. Seine Einschränkungen beinhalten eine begrenztere genetische Manipulation im Vergleich zum Mausmodell und die regenerationsliche Fähigkeit der Ratte, so dass der Gesichtsnervenforscher die Zeitpunkte für die Genesung sorgfältig bewerten muss und ob Ergebnisse in höhere Tiere und Studien am Menschen übersetzt werden sollen. Das Rattenmodell für Gesichtsnervenverletzungen ermöglicht funktionelle, elektrophysiologische und histomorphometrische Parameter für die Interpretation und den Vergleich der Nervenregeneration. Damit bietet es ein enormes Potenzial, das Verständnis und die Behandlung der verheerenden Folgen von Gesichtsnervenverletzungen bei menschlichen Patienten zu fördern.

Einleitung

Cranial-Nervenverletzungen im Kopf- und Nackenbereich können sekundär zu angeborenen, infektiösen, idiopathischen, iatrogenen, traumatischen, neurologischen, onkologischen oder systemischen Ätiologien¹sein. Der Hirnnerv VII, oder der Gesichtsnerv, ist häufig betroffen. Die Inzidenz von Gesichtsnerven dysfunktion kann signifikant sein, da es betrifft 20 bis 30 pro 100.000 Menschen jedes Jahr². Die wichtigsten motorischen Zweige des Gesichtsnervs sind die zeitlichen, zygomatischen, bukkalen, marginalen Unterkiefer- und Zervixzweige; Je nach beteiligtem Zweig können die Folgen orale Inkompetenz oder Trunkenheit, Hornhauttrockenheit, Gesichtsfeldverstopfung sekundär zu Ptosis, Dysarthrie oder Gesichtsasymmetrie^2,,³. Langfristige Morbidität umfasst das Phänomen der Synkinese, oder unfreiwillige Bewegung einer Gesichtsmuskelgruppe, mit versuchter freiwilliger Kontraktion einer ausgeprägten Gesichtsmuskelgruppe. Okulare-orale Synkinese ist die häufigste der aberranten Regeneration als Fortsetzung der Gesichtsnervenverletzung und verursacht funktionelle Beeinträchtigung, Peinlichkeit, vermindertes Selbstwertgefühl und schlechte Lebensqualität³. Die Verletzung einzelner Zweige bestimmt die Funktionen, die selektiv kompromittiert werden.

Die klinische Behandlung von Gesichtsnervenverletzungen ist nicht gut standardisiert und bedarf weiterer Forschung, um die Ergebnisse zu verbessern. Steroide können akute Schwellung des Gesichtsnervs lindern, während Botox für die befristeung synkinetischer Bewegungen nützlich ist; aber, die primären rekonstruktiven Optionen in der Bewaffnung des Praktikers beinhalten chirurgische Intervention durch Nervenreparatur, Substitution oder Reanimation^3,4,5,6. Je nach Art der erlittenen Gesichtsnervenverletzung kann der Gesichtsnervenchirurg eine Reihe von Optionen nutzen. Für eine einfache Transektion ist Nervenreanastomose nützlich, während die Reparatur von Kabeltransplantaten besser für einen Nervendefekt geeignet ist; für eine Wiederherstellung der Funktion kann der Chirurg entweder statische oder dynamische Gesichtsreanimationsverfahren wählen. In vielen Fällen von Gesichtsnervenverletzungen und anschließender Reparatur, auch in den Händen erfahrener Gesichtsnervenchirurgen, führt das beste Ergebnis immer noch zu anhaltender Gesichtsasymmetrie und funktionellem Kompromiss⁷.

Diese suboptimalen Ergebnisse haben umfangreiche Forschung über die Regeneration der Gesichtsnerven angespornt. Zu den allgemeinen Themen von Interesse gehören die Perfektionierung und Innovierung von Nervenreparaturtechniken, die Bestimmung der Wirkung verschiedener Nervenregenerationsfaktoren und die Bewertung des Potenzials spezifischer neuronaler Inhibitoren zur Bekämpfung des langfristigen Ergebnisses der Synkinese^8,9,10,11. Während In-vitro-Modelle verwendet werden können, um einige Merkmale von Wachstums- oder Hemmfaktoren zu bewerten, lässt sich eine echte translationale Forschung zu diesem Thema am besten über übersetzbare Tiermodelle ablesen.

Die Entscheidung, welches Tiermodell verwendet werden soll, kann eine Herausforderung sein, da Forscher sowohl große Tiere wie Schafe als auch Kleintiermodelle wie Mäuse^12,13verwendet haben. Während große Tiermodelle eine ideale anatomische Visualisierung bieten, erfordert ihre Verwendung spezielle Ausrüstung und Personal, das nicht leicht oder leicht verfügbar ist. Darüber hinaus könnte die Durchführung einer Studie zum Nachweis der Wirkung sehr kostenprohibitiv sein und möglicherweise nicht im Durchführbarkeitsbereich vieler wissenschaftlicher Zentren liegen. So wird das Kleintiermodell am häufigsten genutzt. Das Mausmodell kann für die Bewertung einer Reihe von Ergebnissen im Zusammenhang mit Gesichtsnervenchirurgie verwendet werden; Die begrenzte Länge des Nervs kann jedoch die Fähigkeit des Wissenschaftlers einschränken, bestimmte Muster zu modellieren, wie z. B. eine Verletzung mit großen Lücken¹⁴.

So hat sich der Ratte murin Prototyp als Arbeitspferd-Modell, durch das der Wissenschaftler innovative chirurgische Verfahren durchführen oder hemmende oder wachstumsfördernde Faktoren nutzen und die Wirkung über eine breite Palette von Ergebnisparametern bewerten kann. Die Anatomie der Ratte im Gesichtsnerv wird vorhersehbar und leicht reproduzierbar angegangen. Seine größere Skala, im Vergleich zum Mausmodell, ermöglicht die Modellierung einer breiten Palette von chirurgischen Defekten, von einfachen Transektion bis 5 mm Lücken^15,16. Dies ermöglicht ferner die Anwendung komplexer Eingriffe an der Defektstelle, einschließlich der topischen Platzierung von Faktor, intraneuralen Injektionen des Faktors und der Platzierung von Isograften oder Brücken^{17,18,19,20,21,22,23}.

Die gefügige Natur der Ratte, ihre zuverlässige Anatomie und ihre Neigung zur effektiven Nervenregeneration ermöglicht die Sammlung vieler Ergebnismaßnahmen als Reaktion auf die oben genannten chirurgischen Muster der Verletzung²⁴. Über das Rattenmodell ist der Gesichtsnervenforscher in der Lage, elektrophysiologische Reaktionen auf Verletzungen, Nerven- und Muskelhistologische Ergebnisse über Immunhistochemie, funktionelle Ergebnisse über die Verfolgung des Vibrissalpads und die Beurteilung des Augenverschlusses sowie mikro- und makroskopische Veränderungen mittels fluoreszierender oder konfokaler Mikroskopie, unter anderem^{11,22,23,25,26,27,28,29}, zu bewerten. So wird das folgende Protokoll einen chirurgischen Ansatz für den Gesichtsnerv der Ratte und die Verletzungsmuster skizzieren, die induziert werden können.

Protokoll

Alle Interventionen wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) durchgeführt. Das experimentelle Protokoll wurde vor der Umsetzung vom Institutional Animal Care & Use Committee (IACUC) der University of Michigan genehmigt. Zehn Wochen alte erwachsene weibliche Sprague-Dawley Ratten wurden verwendet.

1. Vor dem operativen Tag

1. Stellen Sie vor dem Operationstag einen angemessenen Vorrat an sterilisierten chirurgischen Instrumenten, schmerzstillenden Medikamenten, Anästhesiemedikamenten und Sauerstoff sicher. Eine vollständige Liste finden Sie in der Tabelle der Materialien.

2. Präoperative Einrichtung

1. Sorgen Sie für einen angemessenen Arbeitsbereich, einschließlich Platz für mindestens zwei Personen (Chirurg und Assistent).
   HINWEIS: Es wird ein spezieller Operationstisch, Platz für den Aufbau der Anästhesiemaschine und ausreichend Stauraum für sterilisierte und Backup-Vorräte benötigt.
2. Kalibrieren Sie ein Operationsmikroskop für den Einsatz während der Verfahren. Stellen Sie sicher, dass der Chirurg die Griffe des Mikroskops und die Zoom/Fokus-Tasten einstellen kann, indem Sie eine sterilisierte Abdeckung über die Griffe/Tasten legen.
   HINWEIS: Wir verwendeten sterilisierte Aluminiumfolie über den Griffen/Knöpfen.

3. Anästhesie und Zubereitung

1. Legen Sie das Tier in die Anästhesiekammer und induzieren Sie die Vollnarkose über 1,8% Isofluran und 0,9 l/min Sauerstoff.
   1. Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesieebene durch eine Beurteilung der spontanen Atmung und eine Beurteilung des Bewusstseins, indem Sie die Grimasse des Tieres auf eine Zehenklemme bewerten.
2. Tragen Sie Augenschmierstoff bilateral auf, um vor Hornhautreizungen oder Trockenheit zu schützen.
3. Rasieren Sie die operative Site(n) mit einem Rasiermesser oder einem automatischen Clipper.
   1. Legen Sie zu diesem Zeitpunkt eine Methode zur Rattenidentifikation fest, entweder über ein Ohrschild oder eine Schwanzkennzeichnung/-markierung.
4. Verabreichen Sie eine subkutane Injektion von 0,05 mg/kg Buprenorphin auf dem Rücken des Tieres zur Prophylaxe gegen postoperative Schmerzen.

4. Chirurgische Annäherung und Verletzungsmuster

1. Übertragen Sie das Tier auf den Operationstisch und setzen Sie den Gasstrom über einen Nosecone fort. Stellen Sie sicher, dass ein Wärmepolster unter dem Tier und dem sterilen Feld positioniert ist, um seine Körpertemperatur zu halten.
2. Setzen Sie sterilisierte Gaze (aufgerollt und mit Klebeband befestigt), um als Halsrolle für die Ratte zu verwenden; dies wird eine verbesserte Exposition des chirurgischen Feldes bieten. Beachten Sie, dass die angemessene Positionierung des Tieres für eine effiziente Nervenidentifikation und -sektion von größter Bedeutung ist.
3. Bereiten Sie die Gesichtshaut des Tieres für den Eingriff vor. Verwenden Sie Chlorhexidin oder eine Jodlösung, um die chirurgische Stelle 3x, abwechselnd mit 70% Ethanol, zu schrubben, um eine Desinfektion zu gewährleisten.
4. Planen und markieren Sie den chirurgischen Schnitt auf Wunsch. Manipulieren Sie das ipsilaterale Ohr in vorder-posteriorer Richtung, um die natürliche Faltung der postauricularen Haut zu bestimmen.
5. Mode einen 4-5 mm Schnitt in der postauricularen Falte mit scharfen Irisschere oder einer Nummer 15 Klinge. Dies kann später im Verfahren bei Bedarf erweitert werden.
6. Sezieren Sie stumpf durch die sofortige subkutane Faszien und platzieren Sie einen Mikro-Weitlaner-Retraktor, um die Exposition zu verbessern. Beachten Sie, dass es in diesem Bereich kleinkalibrige Blutgefäße geben kann; diese werden am besten vermieden, indem man sich über den Weitlaner Retraktor überlegen oder minderwertig zurückzieht.
7. Identifizieren Sie den vorderen Gturastric Muskel, während er sich in einer schlechteren bis überlegenen Richtung in Richtung seiner Einfügung entlang der Schädelbasis bewegt.
   1. Verteilen Sie sanft durch den Muskelbauch entlang seiner Einfügemarke, um die Sehne des vorderen Digastric Bauch zu offenbaren. Beachten Sie, dass die Sehne als filmy weißer Prozess erscheint, der vom Muskel mit einer festen Einfügung auf die Schädelbasis ausgeht.
8. Nach der Identifizierung des vorderen Digastric Muskels und seiner Sehne, passen Sie den Weitlaner Retraktor an, um den Muskelbauch weiter zurückzuziehen. Beachten Sie, dass der anschließend exponierte Bereich der dreidimensionale Raum ist, in dem der Hauptstamm des Gesichtsnervs liegt.
   HINWEIS: Dieser Bereich wird überlegen und medial durch die Schädelbasis begrenzt, seitlich durch den vorderen Digastric Muskel, posteromedial durch den Gehörgang und minderwertig durch die Strukturen des Halses, einschließlich der oberflächlichen temporalen Arterie.
9. Nach ausreichender Exposition, identifizieren Sie den Hauptstamm des Gesichtsnervs, wie es sich minderwertig unter der Sehne des Gortes muskel bewegt, wo es das Stylomastoid Foramen von der Schädelbasis verlässt. Beachten Sie, dass der Nerv als perlweiße Schnur erscheint, eingehüllt in die parotis-masseterische Faszie des Tieres. Üben Sie Vorsicht, wenn Sie den Nerv weiter aussetzen, aus den folgenden Gründen.
   1. Vermeiden Sie aggressive Sezieren, oder senkrechte Ausbreitungen, um vor Stretch-vermittelten Neuropraxie Verletzungen zu schützen.
   2. Vermeiden Sie eine aggressive hintere und medial gerichtete Sezierung, um sich vor einer Verletzung der dünnen Gewebe, die den Gehörgang überlagern, zu schützen, da dies die Mittelohrflora in den chirurgischen Bereich einführen könnte.
   3. Vermeiden Sie es, die oberflächliche zeitliche Arterie durch eine breite mediale und minderwertig eitel ierte Zerlegung zu beschädigen. Beachten Sie, dass eine Verletzung durch lebhafte, pulsatile Blutungen identifiziert wird.
      1. Wenn die Arterie verletzt ist, üben Sie prompten Druck mit einem Baumwoll-Applikator oder sterilen Gaze über Zange. Hämostatische Mittel oder flüssiges Fibrin-Dichtmittel können in unmittelbarer Nähe platziert werden. Beachten Sie, dass das Tier eine subkutane Injektion von 0,9% steriler Saline zur Flüssigkeitsstabilisierung benötigen kann.
10. Verfolgen Sie den Hauptstamm disistally, indem Sie entlang des Nervs in eine unterlegene Richtung, distally vom Ausgang des Stylomastoid Foramen.
    1. Erweitern Sie den ursprünglichen Schnitt, um eine vollständige Exposition des Nervs und seiner Zweige zu ermöglichen. Achten Sie darauf, eine Störung der Ohrspeicheldrüse zu vermeiden, da dies zu postoperativer Sialocele führen könnte.
11. Induzieren Sie die gewünschten Verletzungsmuster wie folgt.
    1. Für eine Quetschverletzung verwenden Sie glatte Oberfläche Juwelier Zange, um den Nerv fest zu greifen und komprimieren Sie es⁹. Tragen Sie einen konstanten und reproduzierbaren Druck auf den Nerv für einen Zeitraum von 30 s auf, um eine angemessene Zerkleinerungsverletzung zu gewährleisten.
    2. Für eine einfache Transektion, greifen Sie die Faszie über den Nerv, oder das unmittelbare Epineurium, mit feinverzahnten Zangen, und verwenden Scharfe Mikroschere, um den Nerv an der gewünschten Stelle mit einem einzigen Schnitt sauber zu transsektieren. Achten Sie darauf, übermäßige Traktion auf den Nerv mit der Zange zu vermeiden.
    3. Erstellen Sie für ein Nervenspaltmodell den gewünschten Nervenspalt mit einer ähnlichen Methode wie die einfache Transektionsverletzung. Verwenden Sie den sterilisierten Schaft eines baumwollgekippten Applikators, der auf den gewünschten Nervenspalt längenintraoperativ geschnitten wird, um eine Ähnlichkeit des Verletzungsmusters zwischen Tieren zu gewährleisten.

5. Wundverschluss

1. Die Wunde mit steriler Herzwäsche bewässern und mit steriler Gaze trocknen.
2. Nähern Sie die Hautränder in einer einfachen, subcuticular Art und Weise mit resorbierbaren Nähten, oder verwenden Sie Hautkleber oder Wundclips, die auch für Wundverschluss akzeptabel sind. Legen Sie einen vergrabenen Stich, indem Sie einen tiefen bis oberflächlichen Biss von einer Hautkante und dann einen anschließenden oberflächlichen bis tiefen Biss der gegenüberliegenden Hautkante.

6. Postoperative Erholung

1. Verabreichen Sie eine subkutane Injektion von nichtsteroidalen entzündungshemmenden Analgetika (wie 0,05 mg/kg Buprenorphin und 0,5 mg/kg Carprofen) zur postoperativen Schmerzkontrolle. Legen Sie die Injektion entlang des Rückens des Tieres.
2. Beenden Sie die Verabreichung des Anästhetikums und lassen Sie das Tier Sauerstoff für weitere 1 min einatmen.
3. Legen Sie das Tier in eine erwärmte (über eine Wärmelampe), aseptischen Käfig ohne Einstreumaterial, um versehentliche Einnahme zu vermeiden. Beachten Sie, dass das Tier in der Regel Anzeichen einer Erholung innerhalb von 1-2 min zeigt und orientierungslos erscheinen kann, mit einer verzögerten Wiederherstellung der Hinterbeinfunktion.
4. Bringen Sie die Tiere in ihre Käfige in der entsprechenden Wohneinheit zurück und verabreichen Sie postoperative Schmerzmittel am postoperativen Tag #1, um eine kontinuierliche Prophylaxe gegen Schmerzen zu gewährleisten.
5. Überwachen Sie die Tiere 2x pro Tag, um Anzeichen von Unterernährung, Hornhautreizungen oder chirurgischen Infektionen an der Stelle zu bewerten und geeignete chirurgische Protokolle aufrechtzuerhalten.
   1. Verabreichen Sie 0,9% sterile Saline in subkutaner Weise, wenn es signifikante Gewichtsverlust.
   2. Schmieren dein Auge Salbe täglich auftragen, bis der Blinkreflex des Tieres wieder hergestellt ist.

Ergebnisse

Nach dem ersten chirurgischen Eingriff gibt es zwei Haupttypen von Ergebnismessungen: serielle Messungen im lebenden Tier und Messungen, die ein Opfer des Tieres erfordern. Beispiele für serielle Messungen sind elektrophysiologische Assays, wie eine zusammengesetzte Muskelwirkungspotentialmessung³⁰, Bewertungen der Gesichtsmuskelbewegung mittels laserunterstützter oder Videografie bedeutet⁹, oder sogar repetitive Live-Bildgebung des Nachwa...

Diskussion

Das Modell der Gesichtsnervenverletzung der Ratte hat sich aufgrund seiner chirurgischen Zugänglichkeit, seines Verzweigungsmusters und seiner physiologischen Bedeutung^{27,29,33,34,35,36}als das vielseitigste System für die Bewertung neurotropher Faktoren herauskristallisiert. Die Kombination von Videodemonstration und Anwend...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.8% isoflurane	VetOne	13985-030-40
11-0 nylon microsutures	AROSuture	TK-117038
4-0 monocryl suture	VWR	75982-084
Buprenorphine SR	ZooPharm	MIF 900-006
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
Chlorhexidine	VWR	IC19135805
Jeweler forceps	VWR	21909-458
Micro Weitlaner retractor	VWR	82030-146
Micro-scissors	VWR	100492-348
Mini tenotomy scissors	VWR	89023-522
Number 15 scalpel blade	VWR	102097-834
Operating microscope	Leica
Petrolatum eye gel	Pharmaderm	B002LUWBEK
Sterile water	VWR	89125-834
Tissue adhesive	Vetbond, 3M	NC9259532
Water conductor pad	Aqua Relief System	ARS2000B
Bupivacaine			Use as a local analgesic