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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine indirekte ELISA-Sandwich-Immunocapture zur Bestimmung des immunogenen Glykoproteingehalts in Tollwut-Impfstoffen. Dieser Test verwendet einen neutralisierenden monoklonalen Antikörper (mAb-D1), der Glykoproteintrimer erkennt. Es ist eine Alternative zum in vivo NIH-Test, um die Konsistenz der Impfstoff-Potenz während der Produktion zu verfolgen.

Zusammenfassung

Die wachsende globale Sorge um den Tierschutz ermutigt Hersteller und die National Control Laboratories (OMCLs), die 3R-Strategie für den Ersatz, die Reduzierung und die Verfeinerung der Labortierversuche zu befolgen. Die Entwicklung von In-vitro-Ansätzen wird auf WHO- und europäischer Ebene als Alternative zum NIH-Test zur Bewertung der Tollwut-Impfstoff-Potenz empfohlen. An der Oberfläche des Tollwutviruspartikels (RABV) bilden Trimer von Glykoprotein das Hauptimmungen, das viralneutralisierende Antikörper (VNAbs) induziert. Ein ELISA-Test, bei dem Neutralisierende monoklonale Antikörper (mAb-D1) die trimerische Form des Glykoproteins erkennen, wurde entwickelt, um den Inhalt des nativen gefalteten trimerischen Glykoproteins zusammen mit der Herstellung der Impfstoffchargen zu bestimmen. Dieser In-vitro-Potenztest zeigte eine gute Übereinstimmung mit dem NIH-Test und wurde in kollaborativen Studien von RABV-Impfstoffherstellern und OMCLs für geeignet befunden. Die Vermeidung des Einsatzes von Tieren ist in naher Zukunft ein erreichbares Ziel.

Die vorgestellte Methode basiert auf einer indirekten ELISA-Sandwich-Immunaufnahme mit dem mAb-D1, das die antigenen Stellen III (aa 330 bis 338) des trimeren RABV-Glykoproteins, d.h. des immunogenen RABV-Antigens, erkennt. mAb-D1 wird sowohl zur Beschichtung als auch zum Nachweis von Glykoproteintrimern in der Impfstoffcharge verwendet. Da das Epitop aufgrund seiner konformalen Eigenschaften erkannt wird, kann das potenziell denaturierte Glykoprotein (weniger immunogen) vom mAb-D1 nicht erfasst und nachgewiesen werden. Der zu prüfende Impfstoff wird in einer mit dem mAb-D1 sensibilisierten Platte inkubiert. Gebundene trimere RABV Glykoproteine werden durch Zugabe des mAb-D1 wieder identifiziert, mit Peroxidase gekennzeichnet und dann in Gegenwart von Substrat und Chromogen offenbart. Der Vergleich der für den getesteten Impfstoff gemessenen Absorption und des Referenzimpfstoffs ermöglicht die Bestimmung des immunogenen Glykoproteingehalts.

Einleitung

Seit mehr als 50 Jahren wird der NIH-Test1 als Goldstandard-Methode zur Bewertung der Tollwut-Impfstoff-Potenz vor der Chargenfreigabe verwendet. Dieser Test besteht aus einer intraperitonealen Immunisierung von Mäusegruppen mit dem zu testenden Impfstoff, gefolgt von einer intrazerebralen (IC) Herausforderung 14 Tage später mit dem Challenge Virus Standard (CVS) Stamm des Tollwutvirus (RABV). Die Wirksamkeit wird anhand des Anteils der Mäuse bewertet, die die IC-Herausforderung überleben. Obwohl WHO2 und European Pharmacopeia3 noch den NIH-Test zur Beurteilung der Impfstoffwirksamkeit benötigen, weist dieser Test mehrere Hürden auf: Die Ergebnisse sind hochvariabel4; infektiöse RABV wird während der Herausforderung verwendet, und dies erfordert sowohl technisches Geschick als auch strenge Biosicherheitsmaßnahmen; Eine große Anzahl von Tieren wird verwendet, und die Schwere der Herausforderung wirft ernste ethische Bedenkenauf 5. Eine weniger starke Variation dieses Tests wurde entwickelt: Zwei Wochen nach der intraperitonealen Immunisierung werden Mäuse nicht durch IC herausgefordert, sondern verbluten und auf das Vorhandensein spezifischer RABV-Neutralisationsantikörper (VNAbs) in ihrem Serum mit einem In-vitro-Neutralisationstest getestet. Dieser Test erfordert jedoch immer noch das Opfern einer großen Anzahl von Labormäusen, obwohl er bereits für die Veterinärimpfstoffe6,7 verwendet wird und für die Humanimpfstoffe8in Betracht gezogenwurde.

Ab sofort ermutigen sowohl international9 als auch European10 Empfehlungen Hersteller und National Control Laboratories (Official Medicine Control Laboratories - OMCLs), die Ersatz-, Reduktions- und Verfeinerung von Labortierversuchen, die als 3R-Strategie bezeichnet wird, umzusetzen. Die Europäische Richtlinie 2010/63/EU (in Kraft seit 2013/01/01) in Bezug auf den Schutz und das Wohlergehen von Tieren hat auch die Beschränkungen für Impfstoffhersteller und Laboratorien verschärft, die an der Qualitätskontrolle von Tollwutimpfstoffen sowie an der Tollwutforschung beteiligt sind11. Infolgedessen haben die Entwicklung, Validierung und Nutzung alternativer In-vitro-Ansätze inzwischen Priorität. Diese sind nicht nur ethisch einwandfrei, sondern können auch die Kosten für Batch-Teste senken und die Zeit für die Ergebnisse auf Stunden statt Wochen3verkürzen.

An der Oberfläche des RABV-Teilchens nimmt das Glykoprotein eine trimerische Forman 12,,13,,14,,15,,16. Im Tollwut-Impfstoff stellt diese native trimerische Form das hauptwichtigste Immunogen dar, das VNAbs17 induzieren, während die monomeren, löslichen oder denaturierten Glykoproteine schlecht immunogen sind18,19. Somit ist die Erhaltung der Trimmer des Glykoproteins entlang des Impfstoffherstellungsprozesses ein guter Indikator für die Erhaltung eines optimalen immunogenen Potenzials. Mehrere immunchemische Methoden, wie der Antikörper-Bindungstest20,21, der Single Radial Immunodiffusion (SRD) Test22 und der ELISA-Test23,24,25,26,27 werden vom TECHNISCHEN Bericht der WHO2 und der europäischen Monographie3 zur Quantifizierung des Antigengehalts in Tollwutimpfstoffen empfohlen. Diese werden von Herstellern zur Überwachung der Konsistenz der Impfstoffproduktion und von der OMCL verwendet, um die konsistente Formulierung von Chargen von Humanimpfstoffen zu bewerten28, auch wenn der NIH-Test noch für die Wirksamkeit in Betracht gezogen wird.

Allerdings sind alle diese immunchemischen Methoden nicht gleichwertig. Der SRD-Test erfordert eine Vorbehandlung, die die membranverankerten Trimmer verändern und zu einer löslichen oder denaturierten Form des Glykoproteins22,29führen kann. Daher ist SRD nicht sehr effizient bei der Unterscheidung zwischen immunogenen und nicht-immunogenen Glykoproteinen, was zu einer unvollkommenen Beurteilung der Immunogenität einer Impfstoffpartie führt. Im Gegensatz dazu ist der ELISA-Test empfindlicher22, bewahrt die native Struktur des Glykoproteins und ist besser geeignet, den Gehalt der nativ gefalteten Trimer von Glykoprotein zu bestimmen. Der ELISA-Test kann entweder monoklonale oder Mausmonoklonale Antiglykoprotein-Antikörper verwenden, die gereinigt oder mit Ammoniumsulfat konzentriert sind. Studien haben eine gute Übereinstimmung zwischen dem NIH-Test und dem von ELISA in Impfstoffen bewerteten Antigengehalt gezeigt und sind zu dem Schluss gekommen, dass ELISA-Methoden für den In-vitro-Potenztest geeignet sind. Dies spricht dafür, dass ELISA-Tests den NIH-Test mindestens ergänzen oder sogar ersetzen können4,26,27,30,31,32,33. Heute empfiehlt das Europäische Arzneibuch die Verwendung validierter serologischer oder immunchemischer Assays als Alternativen zum NIH-Test3. Die vollständige Vermeidung der Verwendung von Tieren für die Impfstoffwirksamkeit ist zu einer realistischen Perspektive geworden.

Die nachfolgend vorgestellte Methode basiert auf einer indirekten ELISA-Sandwich-Immunaufnahme mit einem mausmonoklonalen Antikörperklon (mAb-D1), der die antigenen Stellen III (aa 330 bis 338) des trimeren RABV-Glykoproteins15,34erkennt. Diese Methode wurde zunächst im Institut Pasteur26,30 entwickelt und dann vom Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) Labor, d.h. dem französischen OMCL4,33, optimiert und validiert. Der mAb-D1 wird sowohl zur Sensibilisierung der Platte als auch anschließend zur Erkennung des erfassten Antigens eingesetzt. Dies ermöglicht die spezifische Quantifizierung der Glykoproteintrimer, d.h. des immunogenen RABV-Antigens. Das für den Nachweis verwendete mAb-D1 ist mit Peroxidase gekennzeichnet, die sich in Gegenwart des Substrats und Chromogens zeigt. Der Vergleich der für den getesteten Impfstoff gemessenen Absorption und des Referenzimpfstoffs ermöglicht die Bestimmung des immunogenen Glykoproteingehalts. Es ist erwähnenswert, dass die gleiche Art von Assay für verschiedene mAbs angewendet werden kann, die verschiedene antigene Stellen des RABV Glykoproteins35erkennen. Die Methode zur Gewinnung und Reinigung oder Konzentrat mit Ammoniumsulfat Anti-Glykoprotein Polyklonal Kaninchen Immunglobuline G (IgG) oder monoklonale Mausglobuline wurden ausführlich beschrieben zuvor36 zusammen mit dem Verfahren zur Konjugatierung von Antikörpern mit Peroxidase37.

Protokoll

1. Sicherheitsvorkehrungen

HINWEIS: Diese Methode gilt sowohl für lebende RABV als auch für inaktivierte Impfstoffe.

  1. Verwenden Sie gute Laborpraxis- und Sicherheitsverfahren.
  2. Tragen Sie eine angemessene persönliche Schutzausrüstung (PSA) einschließlich Einwegmantel, Handschuhe, Maske, Brille usw.
  3. Wenn das lebende Virus titriert wird, verwenden Sie einen biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II.
    1. Betrachten Sie jedes Material, das mit den Proben in Berührung kommen (Reagenzien, Waschlösungen usw.), als infektiöses Material.
    2. Behandeln Sie das kontaminierte Material, indem Sie 30 min zur Dekontamination in die Bleichlösung (2,5% Natriumhypochlorit) eintauchen.
  4. Behandeln Sie Chemikalien in Übereinstimmung mit der Guten Laborpraxis.

2. Vorbereitung

  1. Verwenden Sie analytische Reagenzien, wo immer möglich.
  2. Vorbereiten Sie frische Lösungen des Beschichtungspuffers/Carbonatpuffers, des Passivationspuffers, des Verdünnungs- und Citratpuffers (Tabelle 1), filtern Sie durch 0,45 oder 0,22 m Filter und lagern Sie sie einen Tag vor dem Einsatz bei 4 °C, um ihre analytische Reinheit zu erhalten.
  3. Reagenzien 30 min vor der Anwendung auf Die Raumtemperatur (+18 °C bis +25 °C) erreichen und vor dem Gebrauch durch sanftes Mischen homogenisieren.

3. Mikroplatten-Sensibilisierung

HINWEIS: Verwenden Sie 96 Well Adsorption Immunoassay-Platten, die optimiert sind, um hohe Mengen an Immunglobulinen zu binden (z. B. siehe Tabelle der Materialien).

  1. Zu jedem Brunnen 200 l des monoklonalen Antikörpers (mAb-D1) im Karbonatpuffer verdünnt hinzufügen.
    ANMERKUNG: Eine optimale Konzentration von ca. 1 g/ml wurde experimentell ermittelt und entspricht einer ungefähren Verdünnung des gereinigten mAb-D1 von ca. 1/2000. Diese empfohlene Konzentration wird für jede mAb-D1-Charge angegeben und muss regelmäßig mit der Positivkontrolle überprüft werden.
  2. Die Platte mit einem Klebefilm bedecken und die Mikroplatte 3 h bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre bebrüten.
  3. Den Brunnengehalt vorsichtig ansaugen und in einen Empfänger übertragen, der 2,5% Natriumhypochloritlösung enthält.
  4. Invertieren Sie die Mikroplatte und lassen Sie sie auf einem adsorbierenden Papier bei Raumtemperatur für 5 min trocknen.

4. Mikroplatten-Passivierung

  1. Fügen Sie jedem Brunnen 300 L des Passivierungspuffers hinzu.
  2. Die Platte mit einer Klebefolie bedecken und 30 min bei 37 °C bebrüten.
  3. Saugen Sie sorgfältig und übertragen Sie den Brunnengehalt in einen Empfänger, der 2,5% Natriumhypochloritlösung enthält.
  4. Invertieren Sie die Mikroplatte und lassen Sie sie auf einem adsorbierenden Papier bei Raumtemperatur für 1 min trocknen.
    HINWEIS: Die Mikroplatte kann bis zur Verwendung sofort verwendet oder bei -20 °C versiegelt gelagert werden.

5. ELISA-Test

ANMERKUNG: Für die Ermittlung der Kontrollkurve des Referenzimpfstoffs ist Schritt 5.3 nicht erforderlich; um den getesteten Impfstoff zu tittieren, sind alle Schritte 5.1 bis 5.6 erforderlich.

  1. Waschen der sensibilisierten Mikroplatte
    1. Zu jedem Brunnen 300 l des Waschpuffers hinzufügen.
    2. Saugen Sie sorgfältig und übertragen Sie den Brunnengehalt in einen Empfänger, der 2,5% Natriumhypochloritlösung enthält.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 5.1.1 und 5.1.2 noch fünfmal, um die sensibilisierte Platte ausgiebig zu waschen.
    4. Invertieren Sie die Mikroplatte und lassen Sie sie auf einem adsorbierenden Papier bei Raumtemperatur für 1 min trocknen.
  2. Verdünnungen des Referenzimpfstoffs für die Kontrollkurve
    1. Rekonstituieren Sie den Referenzimpfstoff (Validierungsantigen Lot 09) in 1 ml destilliertem Wasser, das einer Konzentration von 10 g/ml tollwutes Virusglykoprotein entspricht.
    2. Bereiten Sie eine zehnfache Verdünnung des rekonstituierten Referenzimpfstoffs im Verdünnungsprodukt vor, um 1 g/ml Tollwutvirus-Glykoprotein zu erreichen.
    3. Bereiten Sie 6 serielle zweifache Verdünnungen dieses Referenzimpfstoffs im Verdünnungsstoff gemäß Tabelle 1vor.
    4. Verteilen Sie 200 l des Verdünnungsverdünnungswerts in Duplikat (Bohrungen 1H/2H), um als Blanko-Kontrolle zu dienen.
    5. Verteilen Sie 200 l pro Bohrung jeder Referenzimpfstoffverdünnung in doppelter Weise (Bohrungen G1/G2 bis A1/A2).
  3. Verdünnungen des getesteten Impfstoffs für seine Titration
    1. Bereiten Sie eine zehnfache Verdünnung des getesteten Impfstoffs im Verdünnungsstoff vor.
    2. Bereiten Sie 7 zweifache serielle Verdünnungen des getesteten Impfstoffs in Verdünnungsstoff vor, wie in Tabelle 2angegeben.
    3. Verteilen Sie 200 l pro Bohrung jeder getesteten Impfstoffverdünnung in doppelter Weise (Bohrungen H3/H4 bis A3/A4).
  4. Inkubation/Waschen der ELISA-Platte
    1. Die Mikroplatte mit einer Klebefolie bedecken und 1 h bei 37 °C inkubieren.
    2. Entfernen Sie den Film, aspirieren Sie sorgfältig und übertragen Sie den Inhalt jedes Brunnens in einen Empfänger, der 2,5% Natriumhypochloritlösung enthält.
    3. Zu jedem Brunnen fügen Sie 300 l Waschpuffer.
    4. Saugen Sie sorgfältig und übertragen Sie den Inhalt jedes Brunnens in einen Empfänger, der 2,5% Natriumhypochloritlösung enthält.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 5.4.3 und 5.4.4 fünfmal, um das ungebundene Antigen zu entfernen und die an den beschichteten Antikörper gebundenen G-Proteintrimer zu konservieren (mAb D1).
    6. Invertieren Sie die Mikroplatte und lassen Sie sie auf einem adsorbierenden Papier bei Raumtemperatur für 1 min trocknen.
  5. Bindung der peroxidase konjugierten mAb-D1
    1. Verteilen Sie 200 l pro Bohrung der empfohlenen Verdünnung (1/2000) von peroxidase-markiertem mAb-D1 in Verdünnungsmittel (ungefähre Konzentration von 1 g/ml). Für jede mAb-D1-Charge wird eine empfohlene Konzentration angegeben, die regelmäßig mit der Positivkontrolle überprüft werden muss.
    2. Die Mikroplatte mit einer Klebefolie bedecken und 1 h bei 37 °C inkubieren.
    3. Entfernen Sie den Film, aspirieren Sie sorgfältig und übertragen Sie den Inhalt jedes Brunnens in einen Empfänger, der 2,5% Natriumhypochloritlösung enthält.
    4. Zu jedem Brunnen 300 l des Waschpuffers hinzufügen.
    5. Saugen Sie sorgfältig und übertragen Sie den Inhalt jedes Brunnens in einen Empfänger, der 2,5% Natriumhypochloritlösung enthält.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 5.5.4 und 5.5.5 fünfmal, um ungebundene peroxidase-markierte Antikörper (mAb D1) zu entfernen.
    7. Invertieren Sie die Mikroplatte und lassen Sie sie auf einem adsorbierenden Papier bei Raumtemperatur für 1 min trocknen.
  6. Offenbarung mit substrat-chromogen
    1. Verteilen Sie 200 l pro Bohrung substrat-chromogener Lösung.
    2. Versiegeln Sie die Mikroplatte mit einer Folie und brüten Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min. Eine gelb-orange Farbe entwickelt die Intensität, deren Intensität proportional zur Menge des gebundenen peroxidase-markierten Antikörpers (mAb D1) ist.
    3. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie pro Bohrgut 50 l Stopplösung hinzufügen.
    4. Wischen Sie den Boden der Mikroplatte vorsichtig ab und legen Sie ihn in ein Spektralphotometer, um die optische Dichte (OD) bei 492 nm aller verwendeten Brunnen zu bestimmen: Negativkontrolle (leer), Referenzimpfstoff und getesteter Impfstoff.
    5. Sammeln Sie OD-Daten als .xls oder .xlsx Dateiformat für die Analyse.
  7. Zeichnen Sie die Referenz-Impfstoffkurve, den trimerischen Glykoproteingehalt, in Abhängigkeit von der optischen Dichte (492 nm)
    1. Berechnen Sie den mittleren OD bei 492 nm für jedes Duplikat bei den verschiedenen Verdünnungen des Referenzimpfstoffs (Bohrungen G1/G2 bis A1/A2 in Tabelle 2)
    2. Subtrahieren Sie den mittleren OD des Leer (Bohrungen, H1/H2 in Tabelle 2) von jedem berechneten mittleren OD.
    3. Zeichnen Sie die resultierenden OD-Werte auf der vertikalen Achse (lineare Skala) und die entsprechende Konzentration in Glykoproteintrimern (ng/mL) auf der horizontalen Achse (logarithmische Skala).
    4. Zeichnen Sie die Referenzkurve durch Verbindungspunkte (Abbildung 1).

Ergebnisse

Im folgenden Beispiel wird der Referenzimpfstoff Lot 09 verwendet, der aus gereinigten inaktivierten Tollwutviruspartikeln (PV-Impfstoffstamm) besteht. Der Glykoprotein-Trimergehalt (10 g/ml) wurde nach der Bestimmung der Gesamtmenge an viralen Proteinen (BCA-Test) und der Bewertung des Prozentsatzes des Glykoproteins durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ermittelt. Alternativ kann ein kalibrierter Referenzimpfstoff, z.B. der WHO 6th International Standard (IS) für Tollwut...

Diskussion

Das vom mAb-D1 anerkannte Epitop befindet sich an der antigenen Stelle III des RABV-Glykoproteins, das nicht nur immundominant für die Induktion von VNAbs ist, sondern auch an Neurovirulenz, Pathogenität40,,41 und Rezeptorerkennung42beteiligt ist. Es gibt eine weitere wichtige antigene Stelle entlang des Glykoproteins, Stelle II43, gegen die mehrere MAbs isoliert wurden, wie mAb-WI-111235. ...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Dr. Sylvie Morgeaux und Dr. Jean-Michel Chapsal müssen für ihre wichtige Beteiligung an der Einrichtung des ELISA-Assays zu Impfstoffchargen und der Organisation internationaler Workshops und kollaborativer Studien anerkannt werden. Wir danken Sabrina Kali für die kritische Lektüre des Manuskripts. Dr. Pierre Perrin war verantwortlich für die Isolierung und Charakterisierung von mAb-D1. Diese Arbeit wurde hauptsächlich durch fördermittel des Institut Pasteur unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Class II Biological Safety CabinetThermoFisher Scientific10445753if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORPThermoFisher Scientific439454good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume HoodThermoFisher Scientific12576606for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		Dutscher55303good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets)ThermoFisher Scientific15036
Microplate  single mode reader SunriseTECAN
Microplate shaker-incubatorDutscher441504
Microplate washer WellwashThermoFisher Scientific5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channelsThermoFisher Scientific4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL)ThermoFisher Scientific4700880

Referenzen

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