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  • Résumé
  • Résumé
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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous décrivons une immunocapture indirecte de sandwich d’ELISA pour déterminer le contenu immunogénique de glycoprotéine dans les vaccins de rage. Ce test utilise un anticorps monoclonal neutralisant (mAb-D1) reconnaissant les garnitures de glycoprotéine. Il s’agit d’une alternative au test in vivo NIH pour suivre la cohérence de la puissance vaccinale pendant la production.

Résumé

La préoccupation mondiale croissante pour le bien-être animal encourage les fabricants et les Laboratoires nationaux de contrôle (OMCLs) à suivre la stratégie 3R pour le remplacement, la réduction et le raffinement des tests de laboratoire sur les animaux. Le développement d’approches in vitro est recommandé aux niveaux de l’OMS et de l’Europe comme solutions de rechange au test des NIH pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage. À la surface de la particule du virus de la rage (RABV), les garnitures de glycoprotéine constituent l’immunogène majeur pour induire des anticorps neutralisants viraux (VNAb). Un test ELISA, où neutraliser les anticorps monoclonals (mAb-D1) reconnaître la forme trimétérique de la glycoprotéine, a été développé pour déterminer le contenu de la glycoprotéine trimérique pliée indigène avec la production des lots vaccinaux. Ce test de puissance in vitro a démontré une bonne concordance avec le test des NIH et a été jugé approprié dans les essais collaboratifs par les fabricants de vaccins RABV et les OMCLs. L’évitement de l’utilisation des animaux est un objectif réalisable dans un proche avenir.

La méthode présentée est basée sur une immunocapture indirecte de sandwich ELISA utilisant le mAb-D1 qui reconnaît les sites antigéniques III (aa 330 à 338) de la glycoprotéine rabV trimeric, c’est-à-dire, l’antigène immunogénique RABV. mAb-D1 est utilisé pour le revêtement et la détection des garnitures de glycoprotéine présentes dans le lot vaccinal. Puisque l’épitope est reconnue en raison de ses propriétés conformationnelles, la glycoprotéine potentiellement dénaturée (moins immunogène) ne peut pas être capturée et détectée par le mAb-D1. Le vaccin à tester est incubé dans une plaque sensibilisée au mAb-D1. Les glycoprotéines rabV trimeric bound sont identifiées en ajoutant le mAb-D1 encore, étiqueté avec le peroxidase et puis révélé en présence de substrat et de chromogen. La comparaison de l’absorption mesurée pour le vaccin testé et le vaccin de référence permet de déterminer la teneur en glycoprotéines immunogénique.

Introduction

Depuis plus de 50 ans, le test1 des NIH est utilisé comme méthode de référence pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage avant la libération du lot. Ce test consiste en une vaccination intrapétoninenelle de groupes de souris avec le vaccin à tester suivie d’un défi intra-cérébral (IC) 14 jours plus tard avec la souche Challenge Virus Standard (CVS) du virus de la rage (RABV). La puissance est évaluée à partir de la proportion de souris survivant au défi IC. Bien que l’OMS2 et la pharmacopée européenne3 nécessitent toujours le test niSH pour évaluer la puissance vaccinale, ce test subit plusieurs obstacles : les résultats sont très variables4; LE RABV infectieux est utilisé pendant le défi, ce qui exige à la fois des compétences techniques et des mesures de biosécurité strictes; un grand nombre d’animaux sont utilisés, et la gravité du défi soulève de sérieuses préoccupations éthiques5. Une variation moins grave de ce test a été développée : deux semaines après la vaccination intra-péritonéale, les souris ne sont pas contestées par IC mais saignées et testées pour la présence d’anticorps neutralisant RABV spécifiques (VNAbs) dans leur sérum à l’aide d’un test de neutralisation in vitro. Cependant, ce test nécessite encore de sacrifier un grand nombre de souris de laboratoire, bien qu’il soit déjà utilisé pour les vaccins vétérinaires6,7 et a été considéré pour les vaccins humains8.

À l’heure actuelle, les recommandations internationales9 et européennes10 encouragent les fabricants et les laboratoires nationaux de contrôle (Laboratoires officiels de contrôle des médicaments - OMCL) à mettre en œuvre le remplacement, la réduction et le raffinement des essais sur les animaux de laboratoire, appelé la stratégie 3R. La directive européenne 2010/63/UE (en vigueur depuis 2013/01/01) relative à la protection et au bien-être des animaux a également renforcé les contraintes pour les fabricants de vaccins et les laboratoires impliqués dans le contrôle de la qualité des vaccins antirabiques ainsi que dans la recherche sur la rage11. En conséquence, le développement, la validation et l’utilisation d’approches in vitro alternatives sont maintenant devenus une priorité. Ceux-ci sont non seulement éthiquement sains, mais peuvent également réduire les coûts de test par lots et raccourcir le temps pour les résultats à des heures au lieu de semaines3.

À la surface de la particule RABV, la glycoprotéine adopte une forme trimétérique12,13,14,15,16. Dans le vaccin contre la rage, cette forme trimériique indigène constitue l’immunogène majeur induisant VNAbs17 tandis que les glycoprotéines monomériques, solubles ou dénaturées sont mal immunogéniques18,19. Ainsi, la préservation des garnitures de la glycoprotéine le long du processus de production du vaccin est un bon indicateur pour la préservation d’un potentiel immunogène optimal. Plusieurs méthodes immunochimiques, telles que l’anticorps-contraignant-test20,21, letest d’immunodiffusion radiale unique (SRD) et le test ELISA23,24,25,26,27 sont recommandés par le rapport technique de l’OMS Série2 et la monographie européenne3 pour quantifier la teneur en antigènes dans les vaccins contre la rage. Ceux-ci sont utilisés par les fabricants pour surveiller l’uniformité de la production de vaccins et par l’OMCL pour évaluer la formulation cohérente de lots de vaccins humains28, même si le test des NIH est toujours considéré pour la puissance.

Cependant, toutes ces méthodes immunochimiques ne sont pas équivalentes. Le test SRD nécessite un pré-traitement qui peut modifier les garnitures à la membrane et entraîner une forme soluble ou dénaturée de la glycoprotéine22,29. Par conséquent, SRD n’est pas très efficace en discriminant entre les glycoprotéines immunogéniques et non immunogènes résultant en une évaluation imparfaite de l’immunogénicité d’un lot vaccinal. En revanche, le test ELISA est plus sensible22, préserve la structure indigène de la glycoprotéine, et est plus approprié pour déterminer le contenu des garnitures pliées indigènes de glycoprotéine. Le test ELISA peut utiliser soit des anticorps anti-glycoprotéines monoclonals de lapin ou de souris purifiés ou concentrés avec du sulfate d’ammonium. Des études ont démontré une bonne concordance entre le test des NIH et le contenu antigène évalué par ELISA dans les vaccins et ont conclu que les méthodes ELISA conviennent au test de puissance in vitro. Cela préconise que les tests ELISA pourraient au moins compléter ou même remplacer le test des NIH4,26,27,30,31,32,33. Aujourd’hui, la Pharmacopoeia européenne recommande l’utilisation d’essais sérologiques ou immunochimiques validés comme alternatives au test des NIH3. L’évitement complet de l’utilisation animale de la puissance vaccinale est devenu une perspective réaliste.

La méthode présentée ci-dessous est basée sur une immunocapture indirecte de sandwich ELISA utilisant un clone d’anticorps monoclonal de souris (mAb-D1) qui reconnaît les sites antigéniques III (aa 330 à 338) de la glycoprotéine rabVtrimeric 15,34. Cette méthode a d’abord été développée à l’Institut Pasteur26,30 puis optimisée et validée par le laboratoire de l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), c’est-à-dire le Français OMCL4,33. Le mAb-D1 est utilisé à la fois pour sensibiliser la plaque et par la suite pour détecter l’antigène capturé. Cela permet la quantification spécifique des garnitures de glycoprotéine, c’est-à-dire l’antigène RABV immunogénique. Le mAb-D1 utilisé pour la détection est étiqueté avec peroxidase, qui se révèle en présence du substrat et du chromogen. La comparaison de l’absorption mesurée pour le vaccin testé et le vaccin de référence permet de déterminer la teneur en glycoprotéines immunogénique. Il est à noter que le même type d’essai peut être appliqué pour différents mAbs reconnaissant différents sites antigéniques de la glycoprotéine RABV35. La méthode pour obtenir et purifier ou se concentrer avec l’ammonium sulfate anti-glycorotein polyclonal rabbit immunoglobulins G (IgG) ou globulines monoclonal de souris ont été largement décrits précédemment36 avec la méthode pour conjuguer des anticorps avec peroxidase37.

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Protocole

1. Précautions de sécurité

REMARQUE : Cette méthode s’applique à la fois au RABV vivant et au vaccin inactivé.

  1. Utilisez de bonnes procédures de pratique et de sécurité en laboratoire.
  2. Portez un équipement de protection personnelle (EPI) adéquat, y compris un manteau jetable, des gants, un masque, des lunettes, etc.
  3. Lorsque le virus vivant est titré, utilisez un coffret biologique de sécurité de classe II.
    1. Considérez tout matériau en contact avec les échantillons (réactifs, solutions de lavage, etc.) comme matière infectieuse.
    2. Traiter le matériau contaminé en immergeant dans la solution d’eau de Javel (2,5% d’hypochlorite de sodium) pendant 30 min pour la décontamination.
  4. Manipuler les produits chimiques conformément à la pratique du bon laboratoire.

2. Préparation

  1. Utilisez des réactifs de qualité analytique lorsque c’est possible.
  2. Préparer de nouvelles solutions de tampon de revêtement/tampon carbonate, tampon de passivation, diluant et tampon de citrate(tableau 1), filtrer à travers 0,45 ou 0,22 m filtres et stocker à 4 oC pendant une journée avant l’utilisation pour préserver leur pureté analytique.
  3. Permettre aux réactifs d’atteindre la température ambiante (18 à 25 oC) 30 min avant l’utilisation et homogénéiser par un mélange doux avant l’utilisation.

3. Sensibilisation aux microplaques

REMARQUE : Utilisez 96 plaques d’immunoassay d’adsorption qui sont optimisées pour lier de grandes quantités d’immunoglobulines (p. ex., voir Tableau des matériaux).

  1. À chaque puits, ajouter 200 L de l’anticorps monoclonal (mAb-D1) dilué dans le tampon de carbonate.
    REMARQUE : Une concentration optimale d’environ 1 g/mL a été déterminée expérimentalement et correspond à une dilution approximative de 1/2000 du mAb-D1 purifié. Cette concentration recommandée est indiquée pour chaque lot mAb-D1 et doit être vérifiée périodiquement avec le contrôle positif.
  2. Couvrir la plaque d’un film adhésif et incuber la microplaque pendant 3 h à 37 oC dans une atmosphère humidifiée.
  3. Aspirez soigneusement et transférez la teneur en puits dans un destinataire contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,5 %.
  4. Inverser la microplaque et laisser sécher sur un papier adsorbent à température ambiante pendant 5 min.

4. Passivation microplaque

  1. À chaque puits, ajoutez 300 L du tampon de passivation.
  2. Couvrir la plaque d’un film adhésif et incuber pendant 30 minutes à 37 oC.
  3. Aspirez soigneusement et transférez la teneur en puits dans un destinataire contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,5 %.
  4. Inverser la microplaque et laisser sécher sur un papier adsorbent à température ambiante pendant 1 min.
    REMARQUE : La microplaque peut être immédiatement utilisée ou stockée scellée à -20 oC jusqu’à 3 mois jusqu’à l’utilisation.

5. Analyse ELISA

REMARQUE : Pour établir la courbe de contrôle du vaccin de référence, l’étape 5.3 n’est pas requise; pour titrer le vaccin testé toutes les étapes 5.1 à 5.6 sont nécessaires.

  1. Lavage de la microplaque sensibilisée
    1. À chaque puits, ajoutez 300 lil du tampon de lavage.
    2. Aspirez soigneusement et transférez la teneur en puits dans un destinataire contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,5 %.
    3. Répétez les étapes 5.1.1 et 5.1.2 cinq fois de plus pour laver largement la plaque sensibilisée.
    4. Inverser la microplaque et laisser sécher sur un papier adsorbent à température ambiante pendant 1 min.
  2. Dilutions du vaccin de référence pour la courbe de contrôle
    1. Reconstituer le vaccin de référence (antigène de validation Lot 09) dans 1 ml d’eau distillée correspondant à une concentration de 10 g/mL de glycoprotéine du virus de la rage.
    2. Préparer une dilution décuplée du vaccin de référence reconstitué dans le diluant pour atteindre 1 g/mL de glycoprotéine du virus de la rage.
    3. Préparer 6 dilutions doubles séries de ce vaccin de référence dans le diluant comme indiqué dans le tableau 1.
    4. Distribuez 200 L du diluant en double (puits 1H/2H) pour servir de contrôle vierge.
    5. Distribuer 200 ll par puits de chaque dilution vaccinale de référence en double (puits G1/G2 à A1/A2).
  3. Dilutions du vaccin testé pour sa titration
    1. Préparer une dilution décuplée du vaccin testé dans le diluant.
    2. Préparer 7 dilutions en série doubles du vaccin testé dans le diluant comme indiqué dans le tableau 2.
    3. Distribuer 200 ll par puits de chaque dilution vaccinale testée en double (puits H3/H4 à A3/A4).
  4. Incubation/lavage de la plaque ELISA
    1. Couvrir la microplaque d’un film adhésif et incuber pendant 1 h à 37 oC.
    2. Retirez le film, aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un destinataire contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,5 %.
    3. À chaque puits, ajoutez 300 L de tampon de lavage.
    4. Aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un destinataire contenant 2,5 % de solution d’hypochlorite de sodium.
    5. Répétez les étapes 5.4.3 et 5.4.4 cinq fois pour enlever l’antigène non lié et conserver les garnitures de protéines G liées à l’anticorps enduit (mAb D1).
    6. Inverser la microplaque et laisser sécher sur un papier adsorbent à température ambiante pendant 1 min.
  5. Liaison du peroxidase conjugué mAb-D1
    1. Distribuez 200 ll par puits de la dilution recommandée (1/2000) de mAb-D1 étiqueté peroxidase dans le diluant (concentration approximative de 1 g/mL). Une concentration recommandée est indiquée pour chaque lot mAb-D1 et doit être vérifiée périodiquement avec le contrôle positif.
    2. Couvrir la microplaque d’un film adhésif et incuber pendant 1 h à 37 oC.
    3. Retirez le film, aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un destinataire contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,5 %.
    4. Ajouter à chaque puits, 300 l de la mémoire tampon de lavage.
    5. Aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un destinataire contenant 2,5 % de solution d’hypochlorite de sodium.
    6. Répétez les étapes 5.5.4 et 5.5.5 cinq fois pour enlever l’anticorps non lié étiqueté peroxidase (mAb D1).
    7. Inverser la microplaque et laisser sécher sur un papier adsorbent à température ambiante pendant 1 min.
  6. Révélation à l’aide d’un substrat-chromogen
    1. Distribuer 200 ll par puits de solution substrat-chromogène.
    2. Sceller la microplaque avec un film et incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min. Une couleur jaune-orange développe l’intensité de ce qui est proportionnelle à la quantité d’anticorps peroxidase lié (mAb D1).
    3. Arrêtez la réaction en ajoutant 50 L de solution d’arrêt par puits.
    4. Essuyez soigneusement le fond de la microplaque et placez-la dans un spectrophotomètre pour déterminer la densité optique (OD) à 492 nm de tous les puits utilisés : contrôle négatif (blanc), vaccin de référence et vaccin testé.
    5. Recueillir des données OD comme format de fichier .xlsx ou .xlsx pour analyse.
  7. Dessiner la courbe vaccinale de référence, la teneur en glycoprotéines trimériques, en fonction de la densité optique (492 nm)
    1. Calculer la moyenne de la DMO à 492 nm pour chaque double aux différentes dilutions du vaccin de référence (puits G1/G2 à A1/A2 dans le tableau 2)
    2. Soustrayez la moyenne de la DMO du Blank (puits, H1/H2 dans le tableau 2)de chaque OD moyen calculé.
    3. Tracez les valeurs oD qui en résultent sur l’axe vertical (échelle linéaire) et la concentration correspondante dans les garnitures de glycoprotéine (ng/mL) sur l’axe horizontal (échelle logarithémique).
    4. Dessinez la courbe de référence en joignant des points(figure 1).

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Résultats

Dans l’exemple suivant, le vaccin de référence Lot 09, composé de particules purifiées du virus de la rage inactivée (souche vaccinale photovoltaïque), est utilisé. La teneur en glycoprotéines (10 g/ml) a été établie après la détermination de la quantité totale de protéines virales (test BCA) et l’évaluation du pourcentage de glycoprotéine par l’électrophoresis du gel SDS-polyacrylamide. Alternativement, un vaccin de référence calibré, par exemple, la norme...

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Discussion

L’épitope reconnu par le mAb-D1 est situé dans le site antigénique III de la glycoprotéine RABV qui est non seulement immuno-dominant pour l’induction de VNAbs, mais aussi impliqué dans la neurovirulence, la pathogène40,41 et la reconnaissance des récepteurs42. Il ya un autre site antigénique important le long de la glycoprotéine, site II43, contre lequel plusieurs MAbs ont été isolés tels que mAb-WI...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

La Dre Sylvie Morgeaux et le Dr Jean-Michel Chapsal doivent être reconnus pour leur participation clé à l’établissement de l’analyse ELISA sur les lots de vaccins et à l’organisation d’ateliers internationaux et d’études collaboratives. Nous remercions Sabrina Kali pour la lecture critique du manuscrit. Le Dr Pierre Perrin était responsable de l’isolement et de la caractérisation de mAb-D1. Ce travail a été principalement soutenu par le financement de l’Institut Pasteur.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Class II Biological Safety CabinetThermoFisher Scientific10445753if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORPThermoFisher Scientific439454good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume HoodThermoFisher Scientific12576606for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		Dutscher55303good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets)ThermoFisher Scientific15036
Microplate  single mode reader SunriseTECAN
Microplate shaker-incubatorDutscher441504
Microplate washer WellwashThermoFisher Scientific5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channelsThermoFisher Scientific4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL)ThermoFisher Scientific4700880

Références

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