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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt die Verwendung von Drahtsynografie zur Bewertung der transmural isometrischen Spannung von mesenterischen Arterien, die von Mäusen isoliert sind, unter besonderer Berücksichtigung der Modulation durch Faktoren, die aus Endothelzellen und perivaskulären Fettgewebe freigesetzt werden.

Zusammenfassung

Die geänderte Reaktion des Gefäßtons auf pathophysiologische Reize trägt zur Entwicklung einer breiten Palette von Herz-Kreislauf-und Stoffwechselerkrankungen bei. Endotheliale Dysfunktion stellt einen Hauptschuldigen für die verminderte Vasodilatation und verbesserte Vasokonstriktion der Arterien dar. Fettgewebe, das die Arterien umgibt, spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der endothelabhängigen Entspannung and/oder der Kontraktion der Gefäßglatter Muskelzellen. Die Quergespräche zwischen dem Endothel und den perivaskulären Fettgewebe können mit Hilfe von montierten Blutgefäßen durch ein Drahmyografiesystem ex vivo beurteilt werden. Für Arterien, die von Tieren verschiedener Arten, Altersgruppen, genetischer Hintergründe und/oder pathophysiologischen Bedingungen stammen, sollten jedoch optimale Rahmenbedingungen festgelegt werden.

Einleitung

Verdünnungen und Verengungen der Arterien werden durch Entspannung und Kontraktionen ihrer vaskulären glatten Muskelzellen erreicht. Veränderungen in der Gefäßreaktion kleiner Arterien tragen zur homöostatischen Regulierung des arteriellen Blutdrucks durch autonome Nerven und Hormone bei, die im Blut vorhanden sind (z.B. Katecholamine, Angiotensin II, Serotonin, Vasopressin). Auf lokaler Ebene werden die Gefäßreaktionen von glatten Muskelzellen durch Signale sowohl der Endothelzellen der Intima als auch des Fettgewebes, das die Arterien umgibt, moduliert (Abbildung1).

Das Endothel ist nicht nur eine passive Barriere, sondern dient auch als Oberfläche, um Signale zwischen dem Blut und den darunterliegenden Gefäß-glatten Muskelzellen auszutauschen. Durch die Freisetzung verschiedener vasoaktiver Substanzen spielt das Endothel eine entscheidende Rolle bei der lokalen Kontrolle der Gefäßtonreaktionen 1. Zum Beispiel wird als Reaktion auf Acetylcholin die endotheliale Stickoxid-Synthase (eNOS) im Endothel aktiviert, um Stickoxid (NO) zu produzieren, was zur Entspannung des darunter liegenden Gefäßgilm führt, indem es lösliche Guanylyl-Zyklase (SGC) aktiviert. 2. Weitere vasoaktive Substanzen sind die Produkte von zyklixygen (z. B. Prostacyclin und ThromboxaneA 2), Lipoxygenase (z.B. 12-Hydroxyeicosatetraenoic-Säuren, 12-HETE) und Cytochrom P450 monooxygenases (HETEs and Epoxyeicosatrienoziensäuren, EETs), reaktive Sauerstoffarten (ROS) und vasoaktive Peptide (z.B. Endothelin-1 und Angiotensin II) und endotheliumabgeleitete hyperpolarisierende Faktoren (EDHF) 3. Ein empfindliches Gleichgewicht zwischen Endothelabgeleiteten Vasodilatoren und Vasokonstrickern hält den lokalen Vasomotorton4,5aufrecht.

Die endotheliale Dysfunktion ist durch die Beeinträchtigung der endotheliumabhängigen Vasodilatation 6, ein Kennzeichen der Gefäßalterung7, gekennzeichnet. Mit zunehmendem Alter wird die Fähigkeit von Endothel zur Förderung der Vasodilatation nach und nach reduziert, was vor allem auf eine verminderte NO-Bioverfügbarkeit zurückzuführen ist, sowie auf die abnorme Expression und Funktion von eNOS im Endothel und sGC im Gefäßglatt. 8 , 9 , 10. Die reduzierte KEINE Bioverfügbarkeit ermöglicht die Produktion von endotheliumabhängigen Vasokonstrickern 11,12. Bei gealterten Arterien verursacht die endotheliale Dysfunktion Hyperplasie in den Medien, was sich in der deutlichen Zunahme der Wanddicke, der Anzahl der medialen Kerne widerspiegelt, die an die arterielle Verdickung in Bluthochdruck und Atherosklerose erinnern, die im Menschen beobachtet wird. Patienten13,14. Darüber hinaus beschleunigen pathophysiologische Erkrankungen wie Fettleibigkeit, Diabetes oder Bluthochdruck die Entwicklung der endothelialen Dysfunktion15,16.

Perivaskuläres Fettgewebe (PVAT) setzt zahlreiche Adipokine frei, um die Gefäßstruktur und Funktion17zu regulieren. Die kontrahrige Wirkung von PVAT wird durch entspannende Faktoren wie Adiponectin, NO, Wasserstoffperoxid und Schwefelwasserstoff18,19, 20vermittelt. Je nach Lage und pathophysiologischem Zustand kann PVAT aber auch die kontraktiven Reaktionen in verschiedenen Arterien 21 verbessern. Zu den von PVAT hergestellten Pro-Kontrahenten gehören Angiotensin-II, Leptin, Resistin undROS 22,23.  In den meisten Studien zu isolierten Blutgefäßen wurde PVAT als einfache strukturelle Stütze für die Vaskulatur betrachtet und somit bei der Vorbereitung von Blutgefäßringsegmenten entfernt. Da Fettfunktion einen unabhängigen Risikofaktor für Bluthochdruck und damit verbundene Herz-Kreislauf-Komplikationen 24 darstellt, sollte die PVAT, die die Blutgefäße umgibt, bei der Untersuchung der Gefäßreaktion von Verschiedene Arterien.

Die Multi-Wire-Myographen-Systeme wurden häufig verwendet, um die Vasomotor-Funktionen einer Vielzahl von Blutgefäßen zu untersuchen, einschließlich der Aorta, Mesenterik, Nieren-, Oberschenkoral-, Gehirn-undKoronararterien 25,26. Die hier beschriebenen Protokolle werden mit Hilfe der Drahtmyographie die vaskuläre Reaktionsfähigkeit in mesenterischen Arterien bewerten, die von gentechnisch veränderten Mausmodellen isoliert sind, wobei ein besonderer Fokus auf der Modulation durch PVAT liegt.

Protokoll

Alle Tiere, die für die folgende Studie verwendet wurden, wurden von der Labortiereinheit der Medizinischen Fakultät der Universität Hongkong zur Verfügung gestellt. Die Ethikgenehmigung wurde vom Abteilungsausschuss für die Verwendung von Labortieren für Lehre und Forschung (CULATR, Nr.: 4085-16) eingeholt.

1. Zubereitung

  1. Zubereitung von Medikamenten
    1. Speichern Sie Medikamente entsprechend, wie sie im Material Safety Data Sheet (MSDS) angegeben sind, unmittelbar nach Erhalt. Lösen Sie die Medikamente in Pulverform in Lösungsmitteln als hochkonzentrierte Lagerlösungen und dann Aliquot für die Lagerung bei-20 ° C.
      NOTE: Die meisten Medikamente werden in destilliertem Wasser aufgelöst, um die Bestandslösungen vorzubereiten; Bei einigen Medikamenten kann eine Heizung oder eine Sonikation erforderlich sein. Wenn sich die Medikamente nicht vollständig im Wasser auflösen, kann ein Tropfen von 1 M NaOH hinzugefügt werden, während bei den Basismedikamenten ein Tropfen von 1 M HCl verwendet werden kann. Hydropobic kann sich in Dimethylsulfoxid (DMSO) oder absolutes Ethanol auflösen. In letzteren Fällen sollte die endgültige Badekonzentration (in M) bekannt sein und entsprechende Kontrollen durchgeführt werden, um die Wirkung der Lösungsmittel auszuschließen.
    2. Vor dem Experiment die Arzneimittelaliquoten (Materialtabelle) in Krebs-Ringer Bicarbonat-Lösung (Krebs) auflösen, die 115 mM NaCl enthält, 4.6 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.17 mM MgSO4, 1.17 mM KH2PO 4, 25 mM NaHCO3, 11.1 mM D-Glukose und 0,01 mM EDTA, pH 7.4.
    3. Für kumulierte Konzentrations-Response-Kurven, bereiten Sie die Bestände und Arbeitslösungen der verschiedenen Medikamente durch serielle Verdünnung (Tabelle 1).
  2. Aufbau des Instruments
    1. Kalibrieren Sie den Kraftwandler für alle Kanäle, bevor Sie das Myographen-System an jedem Tag oder jedes Mal verwenden, wenn das System bewegt wurde.
      Hinweis: Das detaillierte Kalibrierungsverfahren variiert je nach Modell. In der Regel wird ein ZweiGramm Gewicht auf die Kiefer aufgetragen und die entsprechende Kraft sollte 9,81 ± 0,1 mN. Wenn die Lektüre um mehr als 0,1 mN abläuft, sollte der Wandler neu kalibriert werden. Für das im vorliegenden Protokoll verwendete System (siehe Materialtabelle) sollten die Betriebswerte für den Kraftwandler während der Kalibrierung zwischen 3000 und 3500 liegen. Ist der Wert des Wandlers höher oder niedriger, muss der Kraftwandler ersetzt werden.
    2. Die Befestigungsstützen in jeder Kammer anpassen und ausrichten. Die kontinuierliche und wiederholte Verwendung der Myographen-Kammer kann zu einer Fehlausrichtung der Montagestütze führen, die vor Experimenten gelegentlich angepasst werden muss, um sicherzustellen, dass die Kiefer richtig ausgerichtet sind.
      Hinweis: Bei der Einstellung der Befestigungsstützen ist besondere Aufmerksamkeit geboten, da die Kraftwandler sehr empfindlich und zerbrechlich sind.
    3. Einschalten Sie Heizungen und Gas (95% O 2 und 5% CO2) mindestens 30 Minuten vor dem Experiment ein, damit die Kammern und Puffer bis zu 37 ± 0,1 ° C erwärmt und mit dem Gasgemisch ausgeglichen werden können.
      1. Überprüfen Sie die Temperatur auf dem Thermometer, um die Genauigkeit der Heizung zu gewährleisten. Die Temperatur kann so verändert werden, dass sie Kühl-oder wärmeneifende Experimente durchführt. Wenn die Temperatur nicht korrekt ist, wie gesetzt, wenden Sie die Offset-Funktion der Maschine an, um die Einstellungen zu erhöhen oder zu verringern, um die erforderliche Temperatur zu erreichen.
    4. Am Ende des Experiments alle Kammern reinigen und die Heizung sowie das zum Setup laufende Gas ausschalten.
      1. Schalten Sie das Gas nicht aus, bevor die gesamte Flüssigkeit in der Kammer aus dem System abgesaugt wurde, sonst kann das saure/destillierte Wasser bei der nächsten Nutzung wieder in die Orgelkammer gelangen.
      2. Um die Kammern des Drahtmyographen zu reinigen, ist der effektivste Weg, Säureswaschen mit einer verdünnten Essigsäure-Lösung durchzuführen. Reinigen Sie die Kante und das Innere der Kammern mit einem Wattestäbchen.
      3. Nach dem Waschen die Kammern gründlich mit destilliertem Wasser abspülen. Die Außenseite der Kammern mit einem nassen Tuch abwischen, um getrocknetes Salz zu entfernen. Ethanol kann auch dann eingesetzt werden, wenn während des Experiments hydrophobe Medikamente eingesetzt wurden.
      4. Ein Beispiel für den Waschvorgang ist wie folgt. Füllen Sie die Kammern mit 8% Essigsäure-Lösung und Inkubat für 2 min. Verwenden Sie einen Baumwoll-gekippten Applikator, um die Stahlkammeroberfläche mechanisch zu reinigen. Vermeiden Sie den Kontakt mit dem Aluminiumteil des Myographen.
      5. Die Essigsäure aufsaugen und die Myographen-Kammer waschen und mehrmals mit destilliertem Wasser unterstützen und die Oberflächen mit saugfähigen Papier-oder Baumwollspitzenapplikatoren trocknen.
  3. Dissektion der mesenterischen Arterienringe
    NOTE: Tiere, die für die aktuelle Studie verwendet wurden, waren fettreiche Diät gefüttert männliche Adipo-SIRT1-Mäuse und wilde Typ Litterkollegen als Kontrollen. Jedes Tier zum Zeitpunkt der Versuche etwa 45 g.
    1. Sterbebegleitung der Maus durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg).
    2. Mit einer chirurgischen Schere und Zangen, führen Sie eine mittlere Linien-Laparotomie, um den Bauchgehalt zu offenbaren.
    3. Sammeln Sie die mesenterische Arkade in eine siliziumbeschichtete Petrischale.
    4. Verbreiten und kleben Sie das mesenterische Netzwerk in der Petrischale, um die Verzweigung von Mesenterie und Bindegewebsmeshwork zu zeigen.
    5. Unter dem Mikroskop (10x) und mit feiner Schere und Zange, vorsichtig zerlegen umgebende Bindegewebe. Vermeiden Sie es, die Adventsschicht zu beschädigen. Alternativ kann das umgebende Fettgewebe zum Experimentieren rund um das Blutgefäß gehalten werden.
    6. Mit der feinen Schere und den Zangen übersteigen die sekundären Zweige der mesenterischen Arterien im eiskalten Krebs.
      Hinweis: Jeder Forscher sollte sein eigenes Set von Sektionsbausätzen, Strings und Steigbügeln haben. Diese Werkzeuge sollten jedes Mal nach dem Experiment richtig aufbewahrt und gereinigt werden, da einige Medikamente schwer weggewaschen werden können und Rückstände an ihnen haften können.
      1. Halten Sie die Blutgefäße in kaltem Krebs Puffer, während Sie die umliegenden Bindegewebe, einschließlich PVAT. Während des Umgangs mit dem Blutgefäß sollten Sie sich darauf schonen, unnötige Schäden am Endothel zu vermeiden.
      2. Wenn das Experiment die Untersuchung der PVAT beinhaltet, behalten Sie eine Kugel von 1,5 bis 2 mm Durchmesser der PVAT um das Blutgefäß. Alternativ können in jeder Kammer gleiche Mengen Fettgewebe zum Experimentieren hinzugefügt werden.
    7. (Optional) Entfernen Sie das Endothel aus dem abgetrennten Blutgefäß als Kontrolle, um die Endothelabhängigkeit der Reaktionen zu bewerten. Für mesenterische Arterien das Endothel entfernen, indem man es sanft über einen Drahtsteigel oder ein Haar rollt.
    8. Schneiden Sie das Blutgefäß, das wie oben in kleine Ringe (~ 2 mm Länge) vorbereitet wurde, und legen Sie sie in eine Plastikschale voller belüfteter (95% O 2 und 5% CO2) Krebs für die anschließendeMontage in die Kammern eines Drahtmyographen 27.
    9. Übertragen Sie die Gefäßringe in eine Myographen-Kammer, die unter dem Mikroskop platziert ist. Die Ringe sollten gleichmäßig platziert werden, wobei die oberen und unteren Steigbügel parallel sind. Der Befestigungsdraht (40 μm) sollte neu vorbereitet werden, da Medikamente an die Saiten binden können.
    10. Den Blutgefäßring auf eine geeignete Länge (2 cm) des Drahtes geben und durch Schrauben an einem Kiefer der Montagekammer befestigen.
    11. Durch den Ring einen zweiten Draht passieren und an dem gegenüberliegenden Kiefer ankern.
    12. Mit Gewinden und an Kammerkiefern befestigten Ringen die Kammer auf das Myographen-Setup montieren und die Mikrometerschraube im Uhrzeigersinn drehen, um die Drähte dicht beieinander zu bewegen, bis die Kraft, die auf der Benutzeroberfläche, die der Kammer entspricht, zu lesen ist, null oder einfach nur Null ist. unter.
      Hinweis: Der am Oberkiefer befestigte Draht sollte von minimaler Länge sein, um sicherzustellen, dass die Spannung vollständig auf den Detektor übertragen werden kann.
    13. Die Präparate bei 37 ° C mindestens 30 Minuten vor der ersten Kraftanwendung mit dem einstellbaren Mikrometer ausgleichen.
    14. Die Gewebelebensfähigkeit in 115 mM hohem Kalium (NaCl ersetzt durch KCl auf molarer Basis) Krebs, der 4.6 mM NaCl enthält, 115 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1,17 mM MgSO4, 1,17 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3 Und 11,1 mM D-Glukose bei pH 7.4.
      Hinweis: Isolierte Gefäße gelten als lebensfähig, wenn die vertragliche Kraft, die in der Datenerfassungssoftware des Myographen-Systems über die Basislinie übertragen und als Ablenkung aufgezeichnet und aufgezeichnet wird, mehr als 40% ihres Ruhetons beträgt, als Reaktion auf einen vertraglichen Agenten. Wenn die Arterie nicht angemessen zusammenläuft, dann ist entweder der optimale basale Spanndruck nicht richtig eingestellt worden oder die Arterie kann bei der Isolierung oder Montage des Behälters beschädigt worden sein.
    15. (Optional) Bewerten Sie die Integrität der Endothelzellen, indem Sie Phenylephrin anwenden, um eine Kontraktion des Gefäßes auf 50% der ursprünglichen Reaktion auf KCl zu induzieren (wie von der Kraft-Transducer in der Datenerfassungssoftware aufgezeichnet), gefolgt von einem Zusatz von 1 μM Acetylcholin.
      NOTE: Eine gute Blutgefäßvorbereitung ist entscheidend, um konsistente und genaue Ergebnisse zu erzielen. Ein Präparat sollte auch dann nicht für das Experiment verwendet werden, wenn der endotheliale Integritätstest unbefriedigend ist oder nicht auf KCl reagiert, was darauf hindeutet, dass die endotheliale Funktion bzw. die vaskuläre glatte Muskelkontraktilität nicht zufriedenstellend ist. In diesem Fall sollte das Präparat durch einen neuen Ring aus dem gleichen Blutgefäß oder einem neuen Blutgefäß ersetzt werden.

2. Normalisierung zur Bestimmung der optimalen Anfangsspannung

NOTE: Das Normalisierungsverfahren ermöglicht die Bestimmung des optimalen Innendurchmessers (IC) von Arterien, bei denen das Blutgefäß einen geeigneten ruhenden transmural Druck (100 mmHg oder 13,3 kPa für mesenterische Arterien) erfährt und maximal aktiv produziert. Kräfte als Reaktion auf vasoaktive Wirkstoffe.

  1. Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Software zur Datenerfassung (siehe Materialtabelle).
  2. Speichern Sie das Experiment als "LabDist-Datendatei" mit einem neuen Namen, um zu vermeiden, dass die ursprüngliche Einstellungsdatei überschrieben wird.
  3. Öffnen Sie das Fenster für die Normalisierungseinstellungen und setzen Sie den k-Faktor als 1. Akzeptieren Sie die Standardwerte für die Okkule-Kalibrierung (0,3, wenn die Gefäßlänge unbekannt ist, oder 1, wenn die Gefäßlänge bekannt ist), den Zieldruck (13,3), die Online-Durchschnittszeit (2) und die Verzögerungszeit (60). Klicken Sie auf OK, um die Einstellungen zu speichern.
  4. Wählen Sie Kanäle aus und geben Sie den Drahtdurchmesser (40 μm), Gewebeendunkte (a1:0; a2: Gewebelänge gemessen), anfängliche Mikrometer-Lesen im Normalisierungsfenster ein.
  5. Starten Sie den Normalisierungsvorgang, indem Sie die erste passive Dehnung auf das Blutgefäß auftragen (Drehen Sie die Mikrometerschraube gegen den Uhrzeigersinn).
  6. Warten Sie, bis sich das Schiff stabilisiert (3 min) und geben Sie das neue Mikrometer-Lesen in das Normalisierungsfenster ein. Die Wandspannung wird automatisch berechnet und als Punkt auf der Grafik dargestellt.
    Hinweis: Die "Schritte" des Mikrometers, die während des passiven Streckenabschnitts verwendet werden, müssen nicht gleich sein. Die ersten Strecken könnten jeweils 20 μm betragen. Wenn sich die Streckenabschnitte immer näher an die Isolar-Linie annähern, können die Schritte auf 10 μm, 5 μm, 2 μm oder sogar kleiner reduziert werden. Haben Sie das Hauptdiagramm-Fenster geöffnet, während Sie die Mikrometereinstellungen einstellen — wenn eine große Spitze, die die isobar-Linie überschreitet, auf einem Längs-/Spannungsgrafik erscheint (der Druckpunkte anzeigt, die einem vorher festgelegten Wert entsprechen), reduzieren Sie die Spannung.
  7. Ersetzen Sie nach jedem passiven Streckenabschnitt den Kontrollkraftstoff durch einen iso-osmotischen hohen Kaliumkraftstoff, der 115 mM KCl enthält. Wenn die Kontraktion ein Plateau erreicht (ca. 3 min), notieren Sie die aktive Kraft (F), indem Sie die passive Kraft bei jeder Strecke von der Kalium-aktivierten Kraft abziehen. Berechnen Sie die Wandspannung sowie die inneren Umfangswerte (IC).
    1. Messen Sie die aktive Spannung als Ablenkung über der Grundlinie. Die aktive Spannung (T) wird auf der Basis der Gleichung F (mN) = T (mN/mm) x 2 x Gefäßlänge (mm) berechnet. Der interne Umfang (IC) wird aus den Mikrometer-Daten berechnet (IC = 205,6 μm + 2 x "Lücke").
  8. Entfernen Sie den hohen Kaliumzustand, indem Sie ihn durch frischen Krebs ersetzen. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal über 5 min.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 2,5 bis 2,8 (durch die induzierende passive Dehnung, gefolgt von einer aktiven Kontraktion in wechselnden Kurven), bis die aktive Spannung zu abnehmen beginnt (Abbildung2).
  10. Nach mehreren Runden von alternativen Streckenabschnitten geben die passiven Längs-/Spannungskurven den Wert von IC100, den inneren Umfang des Gefäßes bei einem transmural Druck von 100 mmHg, als Überquerungspunkt mit der Isolar-Linie an.
    Hinweis: Jeder Mikrometer-Wert während der passiven Strecken wird manuell in das Software-Normalisierungsmoduleingeführt. Das Programm erfasst automatisch die entsprechende Kraftmessung, um die passive Längspannspannung zu erzeugen, die den Wert von IC100 als Grenzpunkt mit der isobar-Linie (Abbildung2, rechte Tafeln) angibt. Je näher der letzte Punkt an der isobar-Linie liegt, aber knapp über der besseren Normalisierung ist, ohne die Gefäße zu beschädigen. Ein Punkt zu weit über der Isobo-Leitung kann das montierte Gefäß physisch beschädigen, was während des Experiments zu unzuverlässigen Ergebnissen führt.
  11. Erstellen Sie die aktiven Längskurven/Spannung, um die IC1-Werte zu bestimmen und berechnen Sie den Normalisierungsk-Faktor als das Verhältnis von IChal-IC100, das für diese Art von Blutgefäßen in nachfolgenden Myographie-Experimenten verwendet wird.
    Hinweis: Die aktiven Längs-/Spannungskurven werden durch die Darstellung der IC-Werte erzeugt, die aus den Mikrometer-Daten auf der x-Achse und aktiven Spannungen auf der y-Achse berechnet werden. Der IC1 ist der Wert, der in der Hochebene liegt (rote Spuren in Abbildung2, rechte Tafeln). Nach der Planung der aktiven Längs-/Spannungskurven und der Bestimmung von IC1 wird der Normalisierungsk-Faktor als Verhältnis von IC1/IC100 berechnet. Basierend auf dem Normalisierungsk-Faktor zeigt sich das optimale IC für die Basislinie, das als IC1 bezeichnet wird, auf der passiven Längs-/Spannungskurve. Die Mikrometereinstellung für diesen IC erscheint unter der Kurve und sollte verwendet werden, um den Mikropositionierer für nachfolgende Myographie-Experimente einzustellen. Die Anfangsspannung (T) entspricht dem Zieldruck (Pi) x IC/2, und die optimale Kraft (F), die auf das Gefäß aufgetragen wird, entspricht T x 2 x Gefäßlänge.
  12. Den hohen Kaliumkrebs gründlich auswaschen und die Präparate um weitere 30 bis 45 min ausgleichen. Die Basalspannungen auf "Null" zurücksetzen, so dass während des anschließenden Experiments nur aktive Kontrabutionsreaktionen aufgezeichnet werden.

3. Phenylephrin-induzierte Kontraktionen

Hinweis: Medikamente, die für die induzierende vasokonstriktive Reaktionen ausgewählt werden können, sind der unspezifische Adrenalin-Agonist Norepinephrin, das selektive α-1-Adrenalin-Agonisten Phenylephrin, das Peptid-Hormon Angiotensin II und das Monoamin. Neurotransmitter 5-Hydroxytryptamin. Phenylephrin wird im vorliegenden Protokoll zur Prüfung (Materialtabelle) verwendet.

  1. Bereiten und montieren Sie gepaarte Arterienringe, wie in Abschnitt 1.3 beschrieben, einer mit PVAT intakt und der andere mit PVAT entfernt, aus den angrenzenden Abschnitten jeder Arterie für das Experiment.
  2. Nach der Normalisierung (beschrieben in Abschnitt 2) die arteriellen Segmente mit hohem Kaliumkraftstoffpuffer vorkontrahieren, indem man der Kammer, die Krebs enthält, 115 mM KCl-Lösung hinzufügt.
  3. Warten Sie auf die Kontraktion auf Plateau (3 min), waschen Sie das hohe Kalium und ersetzen Sie durch frisch belüfteten Krebs Puffer. Wiederholen Sie das Waschen dreimal über 5 min.
  4. Wiederholen Sie dreimal die KCl-Stimulation und das Waschen und zeichnen Sie die maximale vertragliche Reaktion auf KCl auf, indem Sie die Grundspannung von der Spannung durch KCl-Stimulation abziehen.
  5. Nach der letzten Kontraktion und Wäsche die Kammer mit warmem, belüftetem Krebspuffer auffüllen und die Arterie ca. 30 Minuten erholen lassen, bevor Sie die nächste Aufgabe ausführen.
  6. Addieren Sie jeder Kammer kumulative Mengen Phenylephrin (Halbprotokoll-Zuwächse von 10-10 bis 10-4 M), um die konzentrationsabhängigen Steigerungen der isometrischen Spannung der stilistizierenden Präparate zu induzieren.
  7. Beginnen Sie mit der Aufnahme einer geringen Konzentration des Agonisten in die Kammer. Nachdem genügend Zeit für eine stabile Kontraktion (3 – 5 min) gegeben ist, fügen Sie die nächste Konzentration hinzu. Wiederholen Sie die Schritte mit zunehmender Konzentration von Phenylephrin.
  8. Nach dem Hinzufügen der letzten Dosis des Agonisten (Phenylephrin), waschen Sie das Medikament gründlich aus und füllen Sie die Kammer mit frischem Krebs-Puffer. Die konzentrationsabhängigen Reaktionen werden als steigende Prozentsätze der KCl-induzierten Maximalkontraktionen (Abbildung3) dargestellt.
  9. (Optional) Um den Beitrag von NO zu beurteilen, inkubieren Sie die Präparate mit dem NO-Synthase-Inhibitor L-NAME (10-4 M ) 30 Minuten vor dem Zusatz von Phenylephrin. L-NAME verstärkt phenylephrinfinduzierte Kontraktionen in den stilistigen Präparaten von mesenterischen Arterien (Abbildung 4).
    Hinweis: Die Inhibitoren oder Antagonisten müssen genügend Zeit haben, um ein Gleichgewicht zu erreichen, in der Regel 30 – 45 min (für jede Reihe von Experimenten konsistent sein).
  10. Um eine zweite Konzentrationsreaktionskurve nacheinander durchzuführen, waschen Sie die Kammer komplett und wiederholt, um alle bisherigen Agonisten zu entfernen, bis keine weiteren Klangveränderungen zu beobachten sind.
    Hinweis: Parallelexperimente setzen mindestens zwei Ringe, die aus dem gleichen Blutgefäß gewonnen werden, dem Agonisten aus, einer unter Kontrollbedingungen und einer in Anwesenheit des Inhibitors (en); In jedem Ring wird die Konzentrationsreaktionskurve nur einmal durchgeführt. Es wird bevorzugt, parallele Experimente durchzuführen, da dies eine bessere Kontrolle der Wirkung des Medikaments und der Blutgefäßempfindlichkeit ermöglicht. Serielle Experimente erhalten eine Konzentrationsreaktionskurve auf einen Agonisten in einem einzigen Ring; Auswaschen, Versuchsbedingungen ändern (z.B. Inhibitor hinzufügen), und dann die Konzentrationsreaktionskurve auf dem gleichen Ring wiederholen. In diesem Fall sind Zeitkontrollen nötig, um zu zeigen, dass die Arzneimittelreaktionen nicht auf Gewebeveränderungen im Laufe der Zeit zurückzuführen sind. Man kann nie sicher sein, dass sich das Gewebe nach der Exposition bei einem Konzentrationsreaktionsexperiment in genau demselben Zustand befindet. Es muss genügend Zeit (mindestens 30 – 60 min) angegeben werden, damit die Gefäßsegmente zu ihrer ruhenden (basalen) Spannung zurückkehren können, obwohl dies in einigen Fällen nach der Trennung des hohen Affinitätsagonisten von den Rezeptoren nicht sofort geschehen kann. Darüber hinaus kann zwischen den kumulativen Konzentrations-Response-Kurven ein hoher KaliumKrebs eingesetzt werden, um die Desensibilisierung 28 zu reduzieren. Denken Sie daran, dass die meisten Antagonisten nicht vollständig ausgewaschen werden können, so dass es für den Rest des Experiments immer wieder hinzugefügt werden.

4. Endotheliumabhängige Entspannungen

  1. Vorvertraglich wird ein frisch montiertes Arteriensegment (wie in den Schritten 3.2 bis 3,5 beschrieben) vorkontrahiert. Notieren Sie auch hier die maximale vertragliche Reaktion auf KCl, indem Sie die Grundspannung von der Spannung durch KCl-Stimulation abziehen.
  2. (Optional) Inkubieren Sie die Präparate mit dem NO-Synthase-Inhibitor L-NAME (10-4 M ) für 30 Minuten vor dem Zusatz von U46619.
  3. Fügen Sie die vorberechneten Konzentrationen von U46619 in die Kammer ein und ermöglichen Sie eine stabile, nachhaltige Kontraktion der Arteriensegmente.
    Hinweis: Vasodilatorale Reaktionen werden in mesenterischen Arterien induziert, die auf etwa 80% der maximalen Reaktionen auf 115 mM KCl voreingegangen sind. Hier werden die Blutgefäßsegmente mit oder ohne PVAT mit U46619 (1 – 3 x 10- 8 M vorgebunden; Ein Thromboxan A2 Rezeptor-Agonist, um stabile und nachhaltige, glatte Muskelkontraktionen zu erzeugen.
  4. Die kumulierte Konzentration von Acetylcholin (10-10 bis 10- 4 M) wird in die Orgelkammer gegeben. Konzentrationsabhängige vasodilatorische Reaktionen von Arteriensegmenten werden als Prozentsatz der U46619-induzierten Kontrabutionsreaktionen dargestellt (Abbildung5).
    Hinweis: Bei den meisten Experimenten sollte sofort die nächste Konzentration des Entspannungs-Agonisten hinzukommen, wenn ein Plateau beobachtet wird, um eine Erholung in Spannung zu verhindern. Die kontationsabhängigen vasodilatorischen Reaktionen der Arteriensegmente werden als Prozentsatz der U46619-induzierten Kontrabutionen normalisiert, um sich auf geringfügige Unterschiede in der Innervation und im Durchmesser zwischen den Arteriesegmenten einzustellen (Abbildung5). Kleine Abweichungen in der Reaktionsfähigkeit zwischen den einzelnen Ringen, die aus dem gleichen Blutgefäß gewonnen werden, werden minimal, wenn eine Gruppe von sechs oder mehr Experimenten statistisch analysiert wird. Bei der Äußerung von Antworten als Prozentsatz der eigenen maximalen Kontraktionen des einzelnen Gewebes ist es angebracht, eine gepaarten Analyse (z.B. paarweise Studententest) zu verwenden, um Antworten der gleichen Art von Geweben von verschiedenen Tieren zu vergleichen, wie zum Beispiel Reaktionen eines einzelnen Gewebes vor und nach einer Intervention. Bei der Analyse der Auswirkungen von PVAT wird die Zwei-Wege-ANOVA mit anschließendem Multivergleichstest verwendet.
  5. Nach dem Hinzufügen der letzten Dosis des entspannenden Agonisten, entfernen Sie das Medikament aus jeder Kammer und füllen Sie mit frischem Krebs Puffer. Waschen Sie die Kammer gründlich mit Krebs Puffer und lassen Sie die Arterie für mindestens 45 Minuten stabilisieren, bevor Sie zusätzliche Experimente durchführen.

Ergebnisse

Untersuchung der Längs-/Spannungsverhältnisse, um den Normalisierungsfaktor zu erhalten k

Die Dehnungsmenge, die auf ein Gefäßsegment angewendet wird, beeinflusst das Ausmaß der actin-myosin-Interaktion und damit die maximal aktive Kraft. Daher ist für jede Art von Blutgefäß die Bestimmung der Dehnungsmenge erforderlich, die für eine maximale aktive Kraft benötigt wird, für die richtigen Myog...

Diskussion

Neben den Endothelzellenspielen Signale ausPVAT eine wichtige Rolle bei der Regulierung der glatten Muskeltonreaktion 30. Gesunde PVAT setzt NEIN und entzündliches Adiponektin frei, um eine kontrahrige Wirkung auf Arterien zu erzielen, die unter krankhaften Bedingungen wie Fettleibigkeitundmetabolischem Syndrom 31,32 verloren geht. In Krankheitszuständen trägt PVAT zur Entwicklung von endothelialer Dysfunktion und anderen kardiovaskulä...

Offenlegungen

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt durch die Zuschüsse des Research Grant Council of Hong Kong [17124718 und 17171714], des Hong Kong Health and Medical Research Fund [13142651 und 131441], des Sonderforschungsfonds von Hongkong [C7055-14G] und des National Basic. Forschungsprogramm China [973 Programm 2015CB553603].

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetylcholineSigma-AldrichA6625Stock concentration: 10-1 M
Working concentration: 10-10 to 10-5 M
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)Sigma-AldrichN5751Stock concentration: 3 x 10-2 M
Working concentration: 10-4 M
PhenylephrineSigma-AldrichP6126Stock concentration: 10-2 M
Working concentration: 10-10 to 10-5 M
U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α)EnzoBML-PG023-0001Stock concentration: 10-5 M
Working concentration: 1-3 x 10-8 M
Multiwire myographDanish MyoTechnology (DMT)620M
PowerLab 4/26ADInstrumentsML848
Labchart7ADInstruments-
Adipo-SIRT1 wild type miceLaboratory Animal Unit, The University of Hong KongCULATR NO.: 4085-16
Silicon-coated Petri dishesDanish MyoTechnology (DMT)
Tungsten wiresDanish MyoTechnology (DMT)300331
Surgical tools

Referenzen

  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
  2. Furchgott, R. F., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. The FASEB Journal. 3 (9), 2007-2018 (1989).
  3. Feletou, M., Kohler, R., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived vasoactive factors and hypertension: possible roles in pathogenesis and as treatment targets. Current Hypertension Reports. 12 (4), 267-275 (2010).
  4. Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction: the first step toward coronary arteriosclerosis. Circulation Journal. 73 (4), 595-601 (2009).
  5. Feletou, M., Huang, Y., Vanhoutte, P. M. Endothelium-mediated control of vascular tone: COX-1 and COX-2 products. British Journal of Pharmacology. 164 (3), 894-912 (2011).
  6. Harrison, D. G. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 100 (9), 2153 (1997).
  7. Vanhoutte, P. M., Shimokawa, H., Tang, E. H., Feletou, M. Endothelial dysfunction and vascular disease. Acta physiologica. 196 (2), 193-222 (2009).
  8. Klöß, S., Bouloumié, A., Mülsch, A. Aging and chronic hypertension decrease expression of rat aortic soluble guanylyl cyclase. Hypertension. 35 (1), 43-47 (2000).
  9. Csiszar, A., et al. Aging-induced phenotypic changes and oxidative stress impair coronary arteriolar function. Circulation Research. 90 (11), 1159-1166 (2002).
  10. Guo, Y., et al. Endothelial SIRT1 prevents age-induced impairment of vasodilator responses by enhancing the expression and activity of soluble guanylyl cyclase in smooth muscle cells. Cardiovascular Research. , (2018).
  11. Auch-Schwelk, W., Katusic, Z. S., Vanhoutte, P. M. Nitric oxide inactivates endothelium-derived contracting factor in the rat aorta. Hypertension. 19 (5), 442-445 (1992).
  12. Tang, E. H., Feletou, M., Huang, Y., Man, R. Y., Vanhoutte, P. M. Acetylcholine and sodium nitroprusside cause long-term inhibition of EDCF-mediated contractions. American Journal of Physiology - Heart and Circulation Physiology. 289 (6), H2434-H2440 (2005).
  13. Ghiadoni, L., et al. Endothelial function and common carotid artery wall thickening in patients with essential hypertension. Hypertension. 32 (1), 25-32 (1998).
  14. Xu, X., et al. Age-related Impairment of Vascular Structure and Functions. Aging and Disease. 8 (5), 590-610 (2017).
  15. Tabit, C. E., Chung, W. B., Hamburg, N. M., Vita, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus: Molecular mechanisms and clinical implications. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 11 (1), 61-74 (2010).
  16. Tanaka, K., Sata, M. Roles of perivascular adipose tissue in the pathogenesis of atherosclerosis. Frontiers in Physiology. 9, 3 (2018).
  17. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  18. Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. The FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
  19. Gálvez-Prieto, B., et al. A reduction in the amount and anti-contractile effect of periadventitial mesenteric adipose tissue precedes hypertension development in spontaneously hypertensive rats. Hypertension research. 31 (7), 1415 (2008).
  20. Gao, Y. J., Lu, C., Su, L. Y., Sharma, A., Lee, R. Modulation of vascular function by perivascular adipose tissue: the role of endothelium and hydrogen peroxide. British Journal of Pharmacology. 151 (3), 323-331 (2007).
  21. Gao, Y. -. J., et al. Perivascular adipose tissue promotes vasoconstriction: the role of superoxide anion. Cardiovascular Research. 71 (2), 363-373 (2006).
  22. Szasz, T., Webb, R. C. Perivascular adipose tissue: more than just structural support. Clinical Science (London). 122 (1), 1-12 (2012).
  23. Ramirez, J. G., O'Malley, E. J., Ho, W. S. V. Pro-contractile effects of perivascular fat in health and disease. Brish Journal of Pharmacology. 174 (20), 3482-3495 (2017).
  24. Hajer, G. R., van Haeften, T. W., Visseren, F. L. Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases. European Heart Journal. 29 (24), 2959-2971 (2008).
  25. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
  26. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
  27. del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods in Molecular Biology. 1339, 255-276 (2015).
  28. Dobrin, P. B. Influence of initial length on length-tension relationship of vascular smooth muscle. American Journal of Physiology. 225 (3), 664-670 (1973).
  29. Xu, C., et al. Calorie restriction prevents metabolic aging caused by abnormal SIRT1 function in adipose tissues. Diabetes. 64 (5), 1576-1590 (2015).
  30. Sheykhzade, M., Nyborg, N. C. Caliber dependent calcitonin gene-related peptide-induced relaxation in rat coronary arteries: effect of K+ on the tachyphylaxis. European Journal of Pharmacology. 351 (1), 53-59 (1998).
  31. Soltis, E. E., Cassis, L. A. Influence of perivascular adipose tissue on rat aortic smooth muscle responsiveness. Clinical and Experimental Hypertension A. 13 (2), 277-296 (1991).
  32. Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
  33. Fesus, G., et al. Adiponectin is a novel humoral vasodilator. Cardiovascular Research. 75 (4), 719-727 (2007).
  34. Greenstein, A. S., et al. Local inflammation and hypoxia abolish the protective anticontractile properties of perivascular fat in obese patients. Circulation. 119 (12), 1661-1670 (2009).
  35. Yudkin, J. S., Eringa, E., Stehouwer, C. D. "Vasocrine" signalling from perivascular fat: a mechanism linking insulin resistance to vascular disease. Lancet. 365 (9473), 1817-1820 (2005).
  36. Xia, N., et al. Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase in perivascular adipose tissue of diet-induced obese mice. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 36 (1), 78-85 (2016).
  37. Xia, N., Forstermann, U., Li, H. Effects of resveratrol on eNOS in the endothelium and the perivascular adipose tissue. Annals of the New York Academy of Sciences. 1403 (1), 132-141 (2017).
  38. Schinzari, F., Tesauro, M., Cardillo, C. Endothelial and perivascular adipose tissue abnormalities in obesity-related vascular dysfunction: novel targets for treatment. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 69 (6), 360-368 (2017).
  39. Liu, J. T., et al. Lipocalin-2 deficiency prevents endothelial dysfunction associated with dietary obesity: role of cytochrome P450 2C inhibition. British Journal of Pharmacology. 165 (2), 520-531 (2012).
  40. Martinez-Quinones, P., et al. Hypertension induced morphological and physiological changes in cells of the arterial wall. American Journal of Hypertension. 31 (10), 1067-1078 (2018).
  41. Outzen, E. M., et al. Translational value of mechanical and vasomotor properties of mouse isolated mesenteric resistance-sized arteries. Pharmacology Research and Perspectives. 3 (6), e00200 (2015).
  42. Sheykhzade, M., Simonsen, A. H., Boonen, H. C., Outzen, E. M., Nyborg, N. C. Effect of ageing on the passive and active tension and pharmacodynamic characteristics of rat coronary arteries: age-dependent increase in sensitivity to 5-HT and K+. Pharmacology. 90 (3-4), 160-168 (2012).

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