Methoden zur biomechanischen Prüfung von BrachialPlexus in In Vivo bei neonatalen Ferkeln

Zusammenfassung

Hier werden Methoden zur Durchführung biomechanischer In-vivo-Tests an Brachialplexus in einem neonatalen Ferkelmodell vorgestellt.

Zusammenfassung

Neonatale Brachialplexuslähmung (NBPP) ist eine Dehnungsverletzung, die während des Geburtsprozesses in Nervenkomplexen im Nacken- und Schulterbereich auftritt, die kollektiv als Brachialplexus (BP) bezeichnet wird. Trotz der jüngsten Fortschritte in der geburtshilflichen Versorgung ist das Problem der NBPP nach wie vor eine globale Gesundheitsbelastung mit einer Inzidenz von 1,5 Fällen pro 1.000 Lebendgeburten. Schwerere Arten dieser Verletzung können zu einer dauerhaften Lähmung des Arms von der Schulter nach unten führen. Die Prävention und Behandlung von NBPP erfordert ein Verständnis der biomechanischen und physiologischen Reaktionen von neugeborenen BP-Nerven, wenn sie sich dehnen. Aktuelle Seuchenkenntnisse des neugeborenen BP werden aus erwachsenem tierischem oder kadaverischem BP-Gewebe anstelle von in vivo neonatalem BP-Gewebe extrapoliert. Diese Studie beschreibt ein mechanisches Prüfgerät und Verfahren in vivo zur Durchführung biomechanischer In-vivo-Tests an neugeborenen Ferkeln. Das Gerät besteht aus einem Klemmen-, Aktor-, Wägezellen- und Kamerasystem, das In-vivo-Stämme und -Lasten bis zum Ausfall auflädt und überwacht. Das Kamerasystem ermöglicht auch die Überwachung der Fehlerstelle während des Bruchs. Insgesamt ermöglicht die vorgestellte Methode eine detaillierte biomechanische Charakterisierung von neonatalem BP, wenn sie sich dehnen.

Einleitung

Trotz der jüngsten Fortschritte in der Geburtshilfe ist das Problem der NBPP, das durch Dehnungsverletzungen am BP-Komplex verursacht wird, nach wie vor eine globale Gesundheitsbelastung, mit einer Inzidenz von 1,5 Fällen pro 1.000 Lebendgeburten^1,2. Assoziierte Risikofaktoren können mütterlicherseits (d. h. übermäßiges Gewicht, mütterlicher Diabetes, Gebärmutteranomalien, Geschichte der BP-Lähmung), fetal (d. h. fetale Makrosomie) oder geburtsbedingt (d. h. Schulterdystozie, längere Arbeit, assistierte Entbindung mit Zangen oder Vakuumextraktoren, Breech-Präsentation³) sein. Während diese Komplikationen unter bestimmten Umständen unvermeidbar sind, rechtfertigt die Prävention und Behandlung von NBPP ein Verständnis der biomechanischen und physiologischen Reaktionen des neonatalen BP, wenn es sich erstreckt.

Berichtete biomechanische Studien über die BP haben erwachsene Tiere und menschliches kadaverisches Gewebe verwendet und zeigen erhebliche Diskrepanzen^{4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}. Die klinische Relevanz der biomechanischen Eigenschaften des komplexen BP-Gewebes rechtfertigt ein neonatales Tiermodell sowie einen biomechanischen Testansatz in vivo. Darüber hinaus erhöhen Einschränkungen bei der Untersuchung von BP-Stretch-Verletzungen in komplizierten realen Lieferszenarien die Abhängigkeit von Computermodellen, die Methoden bereitstellen, die die Untersuchung der Auswirkungen verschiedener Lieferkomplikationen und -techniken ermöglichen. Der Schlüssel zur klinischen Relevanz dieser Modelle ist ihre Biotreue (menschenähnliche Reaktion). Verfügbare Rechenmodelle von Gonik et al.¹⁶ und Grimm et al.¹⁷ basieren auf Kaninchen- und Rattennervengewebe, aber nicht auf neonatalem BP-Gewebe. Die Durchführung biomechanischer In-vivo-Tests in einem klinisch relevanten neonatalen Tiermodell kann die kritische Lücke nicht verfügbarer neonataler BP-Daten füllen.

Die aktuelle Studie beschreibt ein mechanisches Prüfgerät und Verfahren in vivo zur Durchführung biomechanischer Tests an drei- bis fünf Tage alten männlichen Yorkshire Neonatalferchen. Das Gerät besteht aus einem Klemmen-, Aktor-, Wägezellen- und Kamerasystem, das bei Ausfall belastungen und Lasten in vivo auflädt und überwacht. Das Kamerasystem ermöglicht auch die Überwachung der Fehlerstelle während des Bruchs. Insgesamt ermöglicht das System eine detaillierte biomechanische Charakterisierung des neonatalen BP, wenn es sich dehnen lässt, wodurch die Schwellenbelastungen und Belastungen des BP für mechanisches Versagen in vivo zur Verfügung gestellt werden. Die gewonnenen Daten können das menschenähnliche Verhalten (Biotreue) der bestehenden Rechenmodelle weiter verbessern, die entwickelt wurden, um die Auswirkungen exogener und endogener Kräfte auf BP-Dehnen in Lieferszenarien im Zusammenhang mit NBPP zu untersuchen.

Protokoll

Institutional Animal Care and Use Committee an der Drexel University genehmigte alle Verfahren (#20704).

1. Ankunft und Akklimatisierung der Tiere

1. Quarantäne 1-2 Tage alte Ferkel für mindestens 24 h nach der Ankunft.
2. Hausferkel in sauberen und sanierten Edelstahlkäfigen (36 in x 48 in x 36 Zoll) auf Espen-Chip-Bettwäsche und Füttern ad libitum mit Schweinemilchersatz.
3. Halten Sie die Raumtemperatur bei 85 °F, um eine thermoneutrale Umgebung zu gewährleisten.

2. Tag des Experiments

1. Entfernen Sie den Feed 2 h vor dem Experiment.
2. Ferkel mit einer intramuskulären Injektion von Ketamin (10–40 mg/kg)/Xylazin (1,5–3,0 mg/kg IM) injizieren und über einen Transportkäfig in den Operationsraum transportieren.

3. Induktion und Wartung der Anästhesie

1. Verabreichen Sie 4% Isofluran-Inhalationsanästhetikum in Sauerstoff durch Nasenkegel gemischt und bestätigen, dass das Tier tief beästhetisiert ist, indem das Fehlen von Palpebral und Entzugsreflexe bewertet wird.
2. Intubieren Sie das Tier, indem Sie es in die Supine-Position legen und verwenden Sie ein Laryngoskop (gerade Klinge), um das Intubationsrohr (Durchmesser 2,5–2 mm) in die Luftröhre zu führen.
3. Legen Sie das Tier auf das Beatmungsgerät, sobald die Intubationsröhre gesichert ist.
4. Stellen Sie sicher, dass Ferkel eine Mischung aus Isofluran (0,25%–3% Wartung), Sauerstoff und Lachgas erhalten.
5. Geben Sie eine Dosis Fentanyl (10 g/kg) und geben Sie weiterhin eine Dosis alle 1–2 h, um eine weiterhin ausreichende Tiefe der Analgesie und Sedierung zu gewährleisten und Bewegungsartefakte zu vermeiden, die eine Auflösung des Endotrachealrohrs riskieren könnten.
6. Stellen Sie intravenösen (IV) Zugang in der subkutanen Bauchvene oder einer anderen peripheren Vene fest.
7. Etablieren Sie die arterielle Linie durch die Femoralarterie. Dies kann nicht-invasiv oder durch Durchführung einer Kürzung erfolgen.

4. Überwachung und Pflege

1. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie das Fehlen von Canthal-Reflex und das Fehlen einer Entzugsreaktion auf Zehenkneifung bestätigen.
2. Führen Sie eine kontinuierliche Überwachung der physiologischen Parameter während der Anästhesie und während des gesamten Experimentsdurch, die arteriellen Blutdruck, Elektrokardiographie (EKG), Endgezeiten-CO2, Pulssoximetrie und Körpertemperatur umfasst.
3. Überwachen Sie Blutgase und Blutzucker alle 0,5–1 h und geben Sie bei Bedarf intravenöse Flüssigkeiten (50 % Dextrose und 50 % normale Kochsalzlösung) an Tiere, die länger als 1 h bei 100 ccm/kg/Tag anbeästigt werden, um eine Euglykämie zu gewährleisten.
4. Überwachen Sie die Anästhesieebene des Tieres genau und häufig. Analgesie und/oder Erhöhung der anhalativen Anästhesie.
5. Halten Sie das Tier bei normaler Sauerstoffspannung, indem Sie die Beatmungsparameter und Medikamentendosierungen nach Bedarf kontrollieren, um Normoxia zu gewährleisten, und legen Sie das Tier dann auf eine temperaturgeregelte Wasserdecke, so dass die normale Körpertemperatur bei 39 °C gehalten wird. für die Dauer des Experiments.

5. Brachial-Plexus-Chirurgie

1. Legen Sie das Tier in einer Supine-Position auf dem Operationstisch nach ordnungsgemäßer Anästhesie, wie in Abschnitt 3 beschrieben, mit der oberen Extremität in Entführung, die die Achselregion freisetzen.
2. Verwenden Sie jeden chirurgischen Vorhang, um das Tier zu bedecken. Verwenden Sie saubere, aber nicht-sterile Techniken.
3. Setzen Sie den Brachialplexuskomplex auf beiden Seiten der Wirbelsäule aus, indem Sie einen Mittellinienschnitt (mit einem #10 Klinge) über die Haut und Faszien über der Luftröhre, bis zum oberen Drittel des Brustbeins, entsprechend den Wirbelsäulenspiegeln zwischen C3–T3, machen.
4. Extrapolieren Sie den Schnitt mit den Zangen und hämostat horizontal auf jeder Seite von der suprasternalen Kerbe entlang der Kante des Schlüsselbeins bis zum Oberarm, während die cephalischen und basilischen Venen zu schonen.
5. Lösen Sie die überlegenen und minderwertigen Klappen durch stumpfe Zerlegung mit Schere und Zange, so dass der Zugang zu den zervikalen und brustförmigen Bereichen des Brachialplexus bzw. ermöglicht wird.
6. Identifizieren Sie die Achse (C2) und die erste Rippe am T1. Anhand dieser Landmarken die unteren drei Zervix (C6–C8) und zuerst die Brust (T1) Spinalwirbelforamen identifizieren, dann den Plexus sorgfältig untersuchen, um Bifurkationen der Teilungen (M-Form) zu lokalisieren, um eine Exposition zu erreichen.
7. Beschriften Sie (mit Nervenschlaufen) die Brachialplexusbereiche oberhalb dieser Bifurkationen näher an der Wirbelsäule als Wurzel/Stamm und beschriften Sie die unterhalb dieser Bifurkationen als Akkord, gefolgt vom Nerv, der sich näher am Arm befindet.

6. Biomechanische Prüfung

1. Aufbau des biomechanischen Prüfgeräts
   HINWEIS: Ein maßgeschneidertes mechanisches Prüfgerät wurde entwickelt und hergestellt, um in vivo-Strecke des BP durchzuführen (Abbildung 1).
   1. Befestigen Sie die Basis des Setups an einem Warenkorb.
   2. Befestigen Sie den elektromechanischen Aktuator mit großen C-Klemmen an der Basis. Der Aktuator ist in der Lage, 150 lb Kraft, 10" Hub und Geschwindigkeit von 15 mm/s zu liefern. Die Geschwindigkeit kann auf 0,2 mm/s reduziert werden und funktioniert trotzdem nach Belieben.
   3. Befestigen Sie die 200 N Wägezelle an den Aktor.
   4. Befestigen Sie (einschrauben) eine Klemme an der Wägezelle, die aus gepolsterten Plexiglas besteht, die die Spannungskonzentration an der Spannstelle verhindert.
   5. Befestigen Sie eine Kamera an einem Stativ. Stellen Sie sicher, dass die Kamera bis zu 120 f/s mit einer Auflösung von 658 x 4926 Pixeln aufnehmen kann.
   6. Schließen Sie USB-Kabel von Kamera, Aktor und Wägezelle an den Computer an, um alle Komponenten des Setups zu integrieren und zu synchronisieren.
   7. Schließen Sie den Computer, den Aktor und die Wägezelle an eine Stromquelle an.
2. Kalibrieren Sie die Wägezelle, bevor Sie die angewendeten Lasten aufzeichnen. Führen Sie dazu die folgenden Schritte aus:
   1. Stellen Sie den Aktuator mit dem verstellbaren Griff in einen 90°-Winkel ein und überprüfen Sie den Winkel mit einem Winkelmesser.
   2. Öffnen Sie die Software, die mit der Wägezelle (Tabelle der Materialien )arbeitet. Drücken Sie die Start-Taste, um eine Live-Anzeige der Spannung anzuzeigen.
   3. Hängen Sie Gewichte von der Klemme von 0–1.000 g in Schritten von 100 g aus dem Setup und zeichnen Sie die gemessenen Spannungen auf.
   4. Berechnen Sie die lineare Gleichung der Spannungen und Gewichte, indem Sie die Steigung (m) und (b) finden. Dies geschieht mit einem Tabellenkalkulationsprogramm und der mitgelieferten Neigungsfunktion, um b aus der Folgenden-Gleichung zu berechnen. Fügen Sie Gleichung 2, die unten gezeigt wird, in den mechanischen Einrichtungscode ein.
      Gleichung 1: b = y - mx
      Wobei: y das Gewicht ist, x die Spannung, m die Steigung und b der Abfang (konstant).
      Gleichung 2: y = mx + b
      Wobei: y das Gewicht ist, x die Spannung, m die Steigung und b die Konstante.
3. Prüfung: Der BP-Nerv wird durch eine kundenspezifische Klemme geschnitten und am Testaufbau verankert.
   1. Schneiden Sie den BP-Nerv mit einer feinen Schere.
   2. Klemmen Sie die schnittige Seite des BP-Nervs in der kundenspezifischen Klemme, wie in Abbildung 1dargestellt.
   3. Legen Sie schwarze Acrylfarbe oder Indientinte manuell auf das geklemmte BP-Segment (Abbildung 2).
   4. Platzieren Sie ein Kalibrierraster, das ein 1 cm Lineal ist, flach innerhalb des Tieres, um den Maßstab für die Datenanalyse festzulegen.
   5. Verwenden Sie die Software der Kamera, um die Platzierung der Kamera direkt über den getesteten Segmenten zu sehen, wodurch die Überwachung der Bewegung/Verschiebung der Marker und die Bestimmung der tatsächlichen Gewebebelastung zu jedem beliebigen Zeitpunkt ermöglicht werden.
   6. Zeichnen Sie erste Messungen auf, z. B. die Höhe, bei der der Nerv vom Tisch in den Körper einfügt, und die Höhe der Klemme vom Tisch, den Winkel des Aktors und die gesamte Länge des Gewebes.
   7. Öffnen Sie die Programmiersoftware (Tabelle mit der grafischen Benutzeroberfläche [GUI] wie in Abbildung 3dargestellt).
   8. Führen Sie die GUI aus, indem Sie die Schaltfläche Ausführen drücken.
   9. Initialisieren Sie das System, indem Sie die Initialize-Taste drücken.
   10. Tare das System durch Drücken der Tare-Taste.
   11. Dehnen Sie das BP-Segment, indem Sie die Starttesttaste drücken. Dadurch wird das Gewebe mit einer zugewiesenen Rate von 500 mm/min gezogen, bis in einem Segment des BP ein vollständiger Ausfall auftritt. Diese Dehnungsrate wird basierend auf der verfügbaren Literatur^4,8,18ausgewählt. Das Programm speichert auch eine Videodatei, die angewendete Zuglast, Verschiebung des Gewebes und Dauer des Tests.
   12. Zeichnen Sie die Fehlerstelle auf, d. h. den Punkt, an dem das Gewebe bricht.
4. Euthanasie: Einschläfer am Ende des Experiments mit einer tödlichen Dosis Pentobarbital (120 mg/kg i.v.).
5. Datenanalyse: Verwenden Sie Motion-Tracking-Software für die Analyse der während des Testens aufgenommenen Videos.
   1. Öffnen Sie die Videodatei aus dem Experiment in der Motion Tracking-Software, indem Sie Datei | Öffnen Sie die Videodatei.
   2. Verwenden Sie das Kalibrierungsraster, um den Maßstab in der Motion-Tracking-Software mithilfe des Linienwerkzeugs einzurichten, mit der rechten Maustaste auf die Linie zu klicken, nachdem sie gezeichnet wurde, wählen Sie Kennzahl kalibrierenund geben Sie einen bekannten Wert inZentimetereinsparungein ( Abbildung 4 ).
   3. Verfolgen Sie die Marker auf dem Gewebe innerhalb der Motion-Tracking-Software, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Video klicken und Track Path auswählen und die Mitte des Markers mit dem Marker auf dem Gewebe ausrichten und bis zum Bruch heften.
   4. Exportieren Sie die x- und y-Koordinaten aus den Markern, indem Sie Dateiexport in Tabellenkalkulation auswählen, damit sie zur Berechnung der Dehnungen verwendet werden können.
   5. Importieren Sie die Daten in eine Programmiersoftware, um den Abstand zwischen den x- und y-Koordinaten im Zeitverlauf zu berechnen, um die Dehnungen zu berechnen.
   6. Berechnen Sie Dehnungswerte zu jedem Zeitpunkt, indem Sie die Änderung der Entfernung durch den ursprünglichen Abstand dividieren, nachdem Änderungen der Neigung während der Dehnung berücksichtigt wurden. Die tatsächlichen Dehnungswerte werden zwischen jedem Paar benachbarter Marker zu jedem Zeitpunkt bestimmt. Der Durchschnitt dieser Stämme wird ebenfalls berechnet.

Ergebnisse

Abbildung 5 bzw. Abbildung 6zeigt ein repräsentatives Lastzeitdiagramm und Dehnungen aus vier Segmenten von BP-Plexus (zwischen vier Markern). Die erhaltene Ausfalllast von 8,3 N bei 35% durchschnittlicher Ausfallbelastung meldet die biomechanischen Reaktionen von neonatalem BP, wenn sie sich dehnen. Einige Regionen des Nervs unterliegen höheren Belastungen als andere, was auf eine ungleichmäßige Verletzung entlang der Länge...

Diskussion

Verfügbare Literatur über die biomechanischen Reaktionen der Dehnung auf das BP-Gewebe weisen eine breite Palette von Schwellenwerten sowie methodische Diskrepanzen^{4,6,8,18,19,20,21,22,23}. Abweichungen in den veröffentl...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Omega Subminature Tension & Compression Load Cell	Omega	LCM201-200N	200N load cell
Basler acA640-120uc camera	Basler	acA640-120uc
Feedback Linear Actuator	Progressive Automations	PA-14P	10" stroke, 150lb force, 15mm/s speed
Motion Tracking Software	Kinovea	N/A	Open Source
Proramming Software - MATLAB	Mathworks	N/A	version 2018A
Surgical instruments
Forceps	Fine Science Tools Inc	11006-12 and 11027-12 or 11506-12
Hemostats	Fine Science Tools Inc	13009-12
Scissors	Fine Science Tools Inc	14094-11 or 14060-09