JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt die mikroskopische Überwachung der Pneumokokken-Bindung an von Willebrand-Faktor-Strings, die auf der Oberfläche differenzierter menschlicher Primärendothelzellen unter Scherspannung unter definierten Strömungsbedingungen hergestellt werden. Dieses Protokoll kann auf eine detaillierte Visualisierung spezifischer Zellstrukturen und die Quantifizierung von Bakterien durch die Anwendung von Differential-Immunostaining-Verfahren erweitert werden.

Zusammenfassung

Die Wechselwirkung von Streptococcus pneumoniae mit der Oberfläche von Endothelzellen wird im Blutfluss über mechanosensitive Proteine wie den Von Willebrand Factor (VWF) vermittelt. Dieses Glykoprotein verändert seine molekulare Konformation als Reaktion auf Scherspannung und setzt so Bindungsstellen für ein breites Spektrum von Wirts-Ligand-Wechselwirkungen frei. Im Allgemeinen ist die Kultivierung von primären Endothelzellen unter einem definierten Scherfluss dafür bekannt, die spezifische zelluläre Differenzierung und die Bildung einer stabilen und eng verbundenen Endothelschicht zu fördern, die der Physiologie der inneren Auskleidung eines Blutgefäßes ähnelt. . Daher erfordert die funktionelle Analyse von Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Krankheitserregern und der Wirtsvaskulatur mit mechanosensitiven Proteinen die Etablierung von Pumpensystemen, die die physiologischen Strömungskräfte simulieren können, von denen bekannt ist, dass sie die Oberfläche Gefäßzellen.

Das in dieser Studie verwendete mikrofluidische Gerät ermöglicht eine kontinuierliche und pulslose Rückführung von Flüssigkeiten mit einer definierten Durchflussrate. Das computergesteuerte Luftdruckpumpensystem wendet eine definierte Scherspannung auf endotheliale Zelloberflächen an, indem es einen kontinuierlichen, unidirektionalen und kontrollierten mittleren Durchfluss erzeugt. Morphologische Veränderungen der Zellen und bakterielle Anhaftung können im Fluss mikroskopisch überwacht und quantifiziert werden, indem spezielle Kanalschlitten verwendet werden, die für die mikroskopische Visualisierung entwickelt wurden. Im Gegensatz zur statischen Zellkulturinfektion, die im Allgemeinen eine Probenfixierung vor der Immunkennzeichnung und mikroskopischen Analysen erfordert, ermöglichen die mikrofluidischen Dias sowohl den fluoreszenzbasierten Nachweis von Proteinen, Bakterien und zellulären Komponenten. nach der Probenfixierung; serielle Immunfluoreszenzfärbung; und direkte fluoreszenzbasierte Detektion in Echtzeit. In Kombination mit fluoreszierenden Bakterien und spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern bietet dieses Infektionsverfahren ein effizientes Mehrkomponenten-Visualisierungssystem für ein riesiges Spektrum wissenschaftlicher Anwendungen im Zusammenhang mit gefäßbedingten Prozessen.

Einleitung

Die Pathogenese von Pneumokokken-Infektionen ist durch eine facettenreiche Wechselwirkung mit einer Vielzahl von extrazellulären Matrixverbindungen und Komponenten der menschlichen Hämostase, wie Plasminogen und VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. Das Multidomain-Glykoprotein VWF dient als Hauptregulator einer ausgewogenen Hämostase durch Vermittlung von Thrombozytenrekrutierung und Fibrin-Inkorporation am Standort der vaskulären Thrombusbildung9. Wie wichtig funktionelles, aktives VWF für die Blutungskontrolle und Wundheilung ist, zeigt die von Willebrand-Krankheit, eine häufige erbliche Blutungsstörung10.

Globular VWF zirkuliert im menschlichen Blutsystem in einer Konzentration von bis zu 14,0 g/ml11,10. Als Reaktion auf Gefäßverletzungen ist die lokale Freisetzung von VWF durch endotheliale Weibel Palade Bodies (WBP) deutlich erhöht11,12. Frühere Studien zeigen, dass die Pneumokokken-Bindung an menschliche Endothelzellen und seine Produktion des porenbildenden Toxins Pneumolysin die luminale VWF-Sekretion signifikant stimuliert13. Die hydrodynamischen Kräfte des Blutflusses induzieren eine strukturelle Öffnung der mechanoreagierenden VWF-Domänen. Bei Durchflussraten von 10 Dyn/cm2 vermehrt sich der VWF zu langen Proteinsaiten von bis zu mehreren hundert Mikrometern Länge, die am Subendothel10,12befestigt bleiben.

Um die Funktion von multimerisierten VWF-Strings zu verstehen, die unter Scherspannung im Zusammenspiel von Pneumokokken mit der endotheliaalen Oberfläche erzeugt werden, wurde ein mikrofluidischer Zellkulturinfektionsansatz etabliert. Es wurde ein mikrofluidisches Gerät mit einem softwaregesteuerten Luftdruckpumpensystem eingesetzt. Dies ermöglichte eine kontinuierliche, unidirektionale Rezirkulation des Zellkulturmediums mit einer definierten Durchflussrate. Dabei wendete das System eine definierte Scherspannung auf die Oberfläche von Endothelzellen an, die in speziellen Kanalschlitten befestigt blieben. Dieser Ansatz ermöglichte die Simulation der Scherkraft innerhalb des Blutstroms des menschlichen Gefäßsystems, bei der VWF-Strings auf differenzierten Endothelzellen unter definierten konstanten Strömungsbedingungen erzeugt werden. Zu diesem Zweck wurden die Endothelzellen in spezifischen Kanalgleitern (siehe Materialtabelle) kultiviert, die für mikroskopische Analysen während des Durchflusses angepasst wurden. Das mikrofluidische Pumpensystem lieferte die hochdefinierte und kontrollierte Scherspannungssituation, die für die Bildung von verlängerten VWF-Strings auf der konfluenten Endothelzellschicht erforderlich ist. Nach der Stimulation der VWF-Sekretion von konfluent gewachsenen menschlichen Nabelvenenenen-Endothelzellen (HUVEC) durch Histamin-Supplementierung wurde die Saitenbildung durch Anwendung einer Scherspannung von 10 Dyn/cm2induziert. Die Scherspannung ist definiert als die Kraft, die auf die Zellschicht einwirkt. Es wird ungefähr nach Cornish et berechnet. 14 mit Gleichung 1:
figure-introduction-3608

Wobei die Scherspannung in Dyn/cm2, b = Viskosität in (dyn)/cm2, h = die Hälfte der Kanalhöhe, w = die Hälfte der Kanalbreite und die Durchflussrate in mL/min.

Das Ergebnis von Gleichung 1 hängt von den verschiedenen Höhen und Breiten der verschiedenen verwendeten Folien ab (siehe Materialtabelle). In dieser Studie wurde ein Luer-Kanalschlitten von 0,4 m verwendet, was zu einem Kammerschieberfaktor von 131,6 führte (siehe Formel 2).
figure-introduction-4229

Viskosität des Mediums bei 37 °C beträgt 0,0072 Dyn/cm2 und es wurde eine Scherspannung von 10 Dyn/cm2 verwendet. Dies führte zu einem Durchfluss von 10,5 ml/min (siehe Formel 3).
figure-introduction-4508

Hier wird die Anpassung und Weiterentwicklung eines mikrofluidischen Zellkultivierungsverfahrens mit einem unidirektionalen laminaren Strömungssystem zur Untersuchung und Visualisierung bakterieller Infektionsmechanismen in der Wirtsvaskulatur ausführlich beschrieben. Die Erzeugung von VWF-Strings auf Endothelschichten kann auch durch andere Pumpensysteme angeregt werden, die eine kontinuierliche und stetige Scherspannung15auftragen können.

Nach der Kultivierung von primären Endothelzellen zur Zusammenflussung und Stimulation der VWF-Stringbildung wurden pneumokokken, die rotes Fluoreszenzprotein (RFP)16 exezieren, der Endothelzellschicht unter konstanter mikroskopischer Kontrolle zugesetzt. Die Befestigung von Bakterien an VWF-Saiten an der Oberfläche von Endothelzellen wurde mikroskopisch visualisiert und mit VWF-spezifischen fluoreszierenden Antikörpern bis zu drei Stunden in Echtzeit überwacht. Mit diesem Ansatz wurde die Rolle von VWF als Adhäsionskofaktor zur Förderung der bakteriellen Bindung an das vaskuläre Endothel bestimmt8.

Neben der mikroskopischen Visualisierung von Proteinsekretion und Konformationsveränderungen könnte diese Methode eingesetzt werden, um einzelne Schritte bakterieller Infektionsprozesse in Echtzeit zu überwachen und die Menge der angeschlossenen Bakterien zu verschiedenen Zeitpunkten von ansteckung. Das spezifische softwaregesteuerte Pumpensystem bietet zudem die Möglichkeit, die Endothelzellen in definierten konstanten Strömungsbedingungen bis zu mehreren Tagen zu kultitoren und ermöglicht eine definierte gepulste mittlere Strömungsinkubation. Darüber hinaus kann diese Methode mit verschiedenen Zelltypen angewendet werden. Die Anpassung des Färbeprotokolls ermöglicht auch die Detektion und Visualisierung von Bakterien, die in eukaryotische Zellen verinnerlicht sind.

Dieses Manuskript beschreibt dieses fortschrittliche experimentelle Protokoll, das als definierter, zuverlässiger und reproduzierbarer Ansatz für eine effiziente und vielseitige Charakterisierung pathophysiologischer Prozesse verwendet werden kann.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Die mikrofluidische Zellkultivierung wurde mit kommerziellen primären menschlichen Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVEC) durchgeführt. Das Unternehmen isolierte die Zellen mit informierter Zustimmung des Spenders. Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Ärztekammer des Landes Baden-Württemberg mit der Referenznummer 219-04 genehmigt.

HINWEIS: Siehe Tabelle der Materialien für Protokolllieferungen.

1. Präkultivierung der primären Endothelzellen

  1. Eine gefrorene Glyzerin-Durchstechflasche mit 1 x 105 primärer HUVEC von drei verschiedenen Spendern vorsichtig bei 37 °C auftauen und die Zellen in 7 ml vorgewärmten Endothelzellwachstumsmedium (ECGM, gebrauchsfertig mit Nahrungsergänzungsmitteln) in einem 25 cm2-Zellkolben aussäen.
    HINWEIS: Die primären Endothelzellen verlieren nach mehr als 5 Proliferationszyklen ihre Differenzierungsfähigkeit. Daher können nur Zellen mit weniger als 5 Passagen verwendet werden, wenn hohe Zelldifferenzierungsgrade erforderlich sind.
  2. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%CO2-Atmosphäre für 60 min, um die Oberflächenbefestigung zu ermöglichen und das ECGM-Zellkulturmedium auszutauschen, um Rückstände aus der Kryokonservierung loszuwerden.
  3. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in 5%CO2-Atmosphäre, bis sie eine subkonfluente Zellschicht bilden.
    HINWEIS: Der HUVEC darf nicht zu einer konfluenten Schicht heranwachsen, da die engen Zell-Zell-Kontakte die Bildung einer stabilen Zellschicht später im Fluss verhindern.

2. Präkultivierung von Streptococcus pneumoniae

VORSICHT: Streptococcus pneumoniae ist ein Biosicherheitsmittel der Stufe 2 und darf nur in Laboratorien der Biosicherheitsstufe 2 kultiviert werden. Verwenden Sie eine saubere Bank für Sicherheitsstufe 2 für alle bakteriellen Behandlungen klassifiziert, streng vermeiden Aerosolbildung, und verwenden Sie eine Zentrifuge mit Aerosolschutz für die Sedimentation von Bakterien.

  1. Impfen Sie eine columbiaische Blut-Agar-Platte mit Streptococcus pneumoniae klinischem Isolat ATCC11733, das aus einem Glyzerinbestand gewonnen wird, der ständig bei -80 °C gelagert wird, und kultivieren Sie die Agarplatte über Nacht bei 37 °C und 5%CO2.
  2. Bereiten Sie 40 ml Todd Hewitt flüssige Brühe mit 1% Hefeextrakt (THY) und 15 ml steriler Phosphat-gepufferter Kochchen (PBS) pH 7.4 für die bakterielle Kultivierung und Waschschritte vor.
  3. Verwenden Sie eine sterile Röhre für die bakterielle Kultivierung und impfen Sie die flüssige Kulturbrühe mit Bakterienmasse. Kontrollieren Sie die Impfmenge durch photometrische Messung von 1 ml Aliquots bei 600 nm gegen nicht geimpfte flüssige Brühe als Referenz. Füllen Sie die bakterielle Masse in die flüssige Brühe ein, bis sie eine optische Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,15 erreicht.
  4. Inkubieren Sie die geimpfte flüssige Brühe ohne Schütteln bei 37 °C und 5%CO2 und bestimmen Sie die OD600 alle 30 min, indem Sie 1 ml Aliquots mit Kunststoffküvetten messen.
  5. Sobald die Bakterienkultur eine OD600 von 0,4 erreicht hat, was der exponentiellen Wachstumsphase entspricht, zentrifugiert die bakterielle Kultursuspension für 10 min bei 1.000 x g bei Raumtemperatur (RT).
    HINWEIS: Erlauben Sie nicht, dass eine Pneumokokkenkultur eine OD600 von mehr als 1,0 erreicht, da eine hohe Pneumokokken-Kulturdichte bekanntermaßen eine bakterielle Autolyse auslöst, die die allgemeine bakterielle Fitness beeinträchtigen könnte.
  6. Das bakterielle Sediment vorsichtig mit 10 ml PBS und Sediment wieder für 10 min bei 1.000 x g bei RT aussetzen.
  7. Setzen Sie das gewaschene bakterielle Sediment vorsichtig in 1 ml PBS wieder auf und bestimmen Sie die OD600 von 10 l der bakteriellen Suspension mit 1 ml PBS als Referenz.
  8. Stellen Sie die Bakterienmenge in PBS auf eine OD600 von 2,0 ein. Nach zuvor ermittelter bakterieller Zählung entspricht eine OD600 von 2,0 2 x 109 koloniebildenden Einheiten (CFU). Gehen Sie sofort mit dem Infektionsverfahren fort, um eine bakterielle Autolyse zu verhindern.

3. Endotheliale Zellkultivierung von HUVEC unter mikrofluidischen Bedingungen

  1. Lösen Sie die primären Endothelzellen durch kontrollierte Proteolyse vom Zellkulturkolben. Führen Sie die folgenden Schritte in einer sterilen Umgebung mit einer sauberen Bank aus. Bereiten Sie ein Volumen von 15 ml sterilem PBS für die Waschschritte vor.
    1. Entfernen Sie die ECGM aus einer subkonfluent gewachsenen HUVEC-Schicht und waschen Sie die Zellschicht mit 10 ml PBS mit einer serologischen Pipette, um das Zellkulturmedium loszuwerden.
    2. Inkubieren Sie den gewaschenen HUVEC mit 3 ml 37 °C vorgewärmten Zelldissoziationslösung zur Zellablösung für 5 min bei 37 °C. Beobachten Sie die proteolytische Zellablösung durch mikroskopische Überwachung jede Minute.
    3. Pipette die abgelöste Zellsuspension in ein Rohr mit 7 ml ECGM ergänzt mit 2% fetalem Kalbsserum (FCS) zum Stoppen der Proteolyse und Sediment der Zellen für 3 min bei 220 x g bei RT.
    4. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie den HUVEC in 250 l ECGM, ergänzt mit 5% FCS und 1 mM MgSO4,wieder aus. Verwenden Sie 10 l der Zellsuspension für die Zellzählung mit einer Neubauer-Zellzählkammer und passen Sie die Zellzahl auf 4 x 106 Zellen/ml ECGM an, ergänzt durch 5% FCS und 1 mM MgSO4.
      HINWEIS: Für jedes Strömungsexperiment werden 30 ml ECGM-Medium mit 5% FCS und 1 mM MgSO4 benötigt. Von nun an heißt diese mittlere Zusammensetzung ECGMS-medium. Die Erhöhung der FCS-Konzentration im Kulturmedium von 2% auf 5% unterstützt die Zellanhaftung und Zelllebensfähigkeit von HUVEC, das im Kanalschlitten gesät wird. Das Medium ergänzt FCS und MgSO4 stabilisiert die Zellanhaftung von HUVEC unter Scherspannungsbedingungen wesentlich.
  2. Säen und kultivieren Sie den HUVEC in einer Kanalrutsche. Arbeiten Sie in einer sterilen Umgebung mit einer sauberen Bank. Die Zellen werden unter Scherstress für 2 Tage kultiviert werden, gefolgt von einer Infektion mit Bakterien und mikroskopische Überwachung für weitere 2 h.
    1. Ausgleich eines Kanalschlittens, eines Perfusionssatzes von 1,6 mm Durchmesser und 50 cm Länge, eines Aliquots des ECGMS-Mediums und eines Luer-Kanalschlittens 0,4 m in der Höhe, für 24 h in einem Inkubator mit 5 %CO2-Atmosphäre bei 37 °C, um die Anzahl der Luftblasen zu reduzieren.
      HINWEIS: Dieses Verfahren wird empfohlen, um die Kunststoffausrüstung zu entgasen und das Medium, die Perfusionsrohre und die Reservoirs vorzuwärmen. Wenn Materialien oder Flüssigkeiten bei RT oder im Kühlschrank gelagert wurden, werden im Kunststoff gelöste Gase und Flüssigkeiten freigesetzt, wenn sie während des Experiments im Inkubator erhitzt werden. Dann werden Gasblasen auftreten. Die Entgasung aller Kunststoffkomponenten vor dem Experiment wird diesen Effekt eliminieren. Jedes Mal, wenn das System aus dem Inkubator genommen wird, beginnt der Prozess der Gasaufnahme wieder. Arbeiten Sie daher schnell bei RT und lassen Sie die Fluideinheit nie für längere Zeiträume außerhalb des Inkubators.
    2. Verwenden Sie eine Pipette, um 100 l einer 2% sterilgefilterten Schweinegelatinelösung in PBS-Lösung in eines der Reservoirs eines temperaturgleich geausgleichten Kanalschlittens zu injizieren. Inkubieren Sie die Gelatinelösung für 1 h bei 37 °C und spülen Sie den Kanal des Dias mit 1 ml PBS unter sterilen Bedingungen mit einer 1 ml Luer Spritze ab.
    3. Legen Sie den gelatinebeschichteten Kanalschlitten auf eine dünne Polystyrol- oder Styroporplatte, um einen Rückgang der Gleittemperatur zu verhindern. Fügen Sie 100 l der 4 x 106/ml HUVEC Suspension mit einer 1 ml Luer Spritze in das Dia ein.
      HINWEIS: Das Platzieren des Kanalschlittens auf der kalten Metalloberfläche der sauberen Bank könnte die Temperatur des Gleitbodens verringern und dadurch kalte Belastung der Endothelzellen erzeugen. Halten Sie während der Zellpipettierung die Folie ein wenig nach oben, um Luftblasen aufsteigen zu lassen und aus dem Inneren des Dias verschwinden zu lassen.
    4. Inkubieren Sie den Kanalschlitten mit dem HUVEC für 60 min bei 37 °C und 5%CO2 und füllen Sie die mittleren Reservoirs an beiden Enden des Kanalschlittens mit je 60 l ECGMS-Medium. 1 h bei 37 °C und 5%CO2inkubieren.
  3. Passen Sie die mikrofluidische Pumpe und die Softwareeinstellungen an.
    1. Schließen Sie den ausgeglichenen Perfusionssatz an die Pumpeneinheit an, füllen Sie ihn mit 13,6 ml ECGMS-Medium aus, und starten Sie die Pumpensteuerungssoftware. Wählen Sie den geeigneten Perfusionssatz und die Art der Kammerrutsche mithilfe der Scroll-Down-Fenster im Menü der eingerichteten Fluideinheit aus. Wählen Sie 0.007 (dyn/cm2) in der Software für mittlere Viskosität. (Siehe die Druckpumpen-Softwareeinstellungen, die in Der Zusätzlichen Abbildung 1mit roten Pfeilen markiert sind).
    2. Schließen Sie außerhalb des Inkubators eine mit trocknenden Kieselsäureperlen gefüllte Glasflasche an die Luftdruckschläuche an (siehe Abbildung 1, Inset 3). Die Luft der Druckpumpe zirkuliert zwischen den Perfusionsbehältern und der Pumpe und muss vor dem Wiedereintritt in das Pumpengerät trocken sein. Wählen Sie Im Softwaremenü Strömungsparameter aus, stellen Sie den Druck auf 40 mbar ein, und spülen Sie die Pumpenrohre mit dem flüssigen Medium, indem Sie den kontinuierlichen mittleren Durchfluss starten. (Diese Einstellungen werden auch durch rote Pfeile in Der Zusatzabbildung 1angezeigt).
    3. Programmieren Sie die gewünschten Scherspannungszyklen der Strömungskultivierung. Beginnen Sie mit 5dyn/cm2 , steuern Sie symmetrische Reservoir pumpinng und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Pumpensystem zirkulieren.
      HINWEIS: Die Wandscherspannung in einem Kanalschlitten hängt von der Durchflussrate und der Viskosität des Perfusionsmediums ab. Wenn Sie ein anderes Pumpensystem verwenden, lesen Sie bitte die in der Einleitung beschriebenen Gleichungen, um einen Durchfluss festzulegen, der den gewünschten Scherspannungspegel erzeugt. Die beschriebenen Einstellungen entsprechen einer Durchflussrate von 5,42 ml/min. (Ein beispielhafter Screenshot, der die entsprechenden Durchflussparametereinstellungen in der Druckpumpensoftware zeigt, ist in Der Zusatzabbildung 2dargestellt).
    4. Stoppen Sie die Durchflusszirkulation in der Pumpensteuerungssoftware und halten Sie den mittleren Durchfluss im Perfusionsschlauch, indem Sie die Rohre in der Nähe der Luer-Verbindungen spannen. Schließen Sie den Kanalschlitten an, wodurch Luftblasen vermieden werden, und legen Sie die Fluideinheit mit dem angeschlossenen Kanalschlitten in einenCO2-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2. Beginnen Sie die Scherspannung bei 5 Dyn/cm2 für 30 min, um die Zellen reibungslos an die durch die Scherspannung erzeugten Kräfte anzupassen, bevor Sie den Scherspannungspegel beschleunigen (siehe Ergänzende Abbildung 3).
      HINWEIS: Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen im Rohrsystem oder im Schlitten nach dem Anschluss an das Rohrsystem verbleiben, da die Bewegung von Luftblasen im Durchfluss zu einer Zellablösung führen kann.
    5. Beschleunigen Sie die Scherspannung auf 10 Dyn/cm2 (die in dieser Strömungseinstellung 10,86 ml/min entsprechen) und inkubieren Sie den Kanalschlitten in kontinuierlicher Scherspannung für 48 h in einem kleinenCO2-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2, um eine Zelldifferenzierung zu ermöglichen ( Die jeweiligen Software-Settinngs sind in Der Ergänzungsabbildung 4mit roten Pfeilen gekennzeichnet.
      HINWEIS: HUVEC-Zellen neigen dazu, sich von der Kanaloberfläche zu lösen, wenn die Strömungskultivierung direkt bei 10 dyn/cm2gestartet wird. Die Zellen bleiben an der Kammeroberfläche befestigt, wenn die Strömungskultivierung mit weniger Scherspannung mit 5 Dyn/cm2 für mindestens 30 min begonnen wird, gefolgt von einer langsamen Erhöhung der Scherspannung auf die gewünschten 10 dyn/cm2. Eine Scherspannung von 10 Dyn/cm2 ist der Mindestwert in dieser Perfusionseinstellung, der für die VWF-Stringbildung erforderlich ist.
    6. Stoppen Sie nach 24 h mikrofluidischer Zellkultivierung den mittleren Durchfluss mit der Pumpensteuerungssoftware genau dann, wenn in beiden mittleren Reservoirs ein ausgeglichener mittlerer Pegel erreicht wird. Legen Sie die Fluideinheit in eine saubere Bank und entfernen Sie 10 ml des zirkulierenden Anbaumediums der Perfusionsreservoirs mit einer 10 ml serologischen Pipette. Fügen Sie 10 ml ECGMS-Medium in die Reservoirs, um das Medium zu erneuern, legen Sie die Fluideinheit wieder in denCO2-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2, und starten Sie den flüssigen Anbau mit der Pumpensteuerungssoftware neu.
      HINWEIS: Die Funktion der Druckpumpe kann plötzlich durch Labormaschinen wie große Zentrifugen gestört werden, was zu einer starken Magnetfeldstörung führen kann. Diese plötzliche Störung kann zu einer Zellablösung führen. Achten Sie darauf, dass solche Maschinen während des Experiments nicht in der Nähe der Druckpumpe aktiv sind.
    7. Beginnen Sie die Vorwärmung der Temperaturinkubationskammer, die das Stadium des Fluoreszenzmikroskops auf 37 °C für temperaturausgleich 24 h abdeckt, bevor die mikroskopische Visualisierung. Nachdem das Mikroskop vorgewärmt ist, starten Sie die Steuerung der Mikroskopsoftware und passen Sie die Haupteinstellungen für die fluoreszenzmikroskopische Überwachung an, indem Sie die entsprechenden Filtereinstellungen (540 nm/590 nm für die Detektion der RFP-exemitten Bakterien und 470 nm/515 nm zum Nachweis der Fluorescein-Emission der FITC-konjugierten VWF-spezifischen Antikörper). Vorwärme neine zusätzliche Heizkammer zur Inkubation der Fluideinheit bei 37 °C.
      HINWEIS: Während der Infektionsanalysen und der mikroskopischen Überwachung sollte die Temperatur des Kanalschlittens und des zirkulierenden Mediums nicht wesentlich abnehmen, da dies kalte Belastung der Zellen erzeugen würde. Im Allgemeinen reicht die Größe der Temperaturkammern, die die Mikroskopstufe abdecken, nicht aus, um die gesamte Fluideinheit abzudecken. Daher wird die Verwendung einer zusätzlichen Heizkammer empfohlen, die auf 37 °C vorgewärmt ist.
    8. Zur mikroskopischen Visualisierung legen Sie die Fluideinheit in die 37 °C vorgewärmte Heizkammer und stellen Sie den Kanalschlitten auf eine Stufe des 37 °C vorgewärmten Mikroskops.
      HINWEIS: Für die mikroskopische Visualisierung mussten die Fluideinheit und der Kanalschlitten aufgrund der begrenzten Länge der Perfusionsschläuche aus dem CO2-Inkubator entfernt werden. Wenn Infektionszeiten und mikroskopische Überwachung enußerhalb der 5%CO2-Atmosphäre für die pH-Pufferung erforderlich sind, sollte ein pH-gepuffertes Medium für den mikrofluidischen Anbau verwendet werden.
    9. Kontrollieren Sie die Zellmorphologie und die Integrität der HUVEC-Schicht vor der Injektion von Histamin und Bakterien in die Durchflusszirkulation während der gesamten Zeit des Strömungsexperiments und nach Abschluss des Strömungsexperiments mit dem Hellenfeldmodus des Mikroskops.

4. Induktion von VWF-Release und Visualisierung von Multimerized VWF Strings

  1. Halten Sie die Strömungseinstellung aufrecht, da eine Scherspannung von 10 dyn/cm2 erforderlich ist, um die Multimerisierung von VWF auf lange Saiten von bis zu 200 MDa auszulösen. Induzieren Sie die Freisetzung von VWF aus endothelialem WPB, indem Sie 136 l einer 100 mM Histamin-Stammlösung in das ECGMS-Medium in jizieren, das in den Perfusionsschläuchen über einen Injektionsanschluss zirkuliert. Die endgültige Konzentration von Histamin im Strömungsmedium wird 1 mM betragen. Wenn kein Injektionsanschluss verfügbar ist, kann das Histamin alternativ durch Pipettieren in das Medium der Pumpenbehälter hinzugefügt werden.
  2. Zur Immunfluoreszenzdetektion von mehrfach verkörnten VWF-Strings den Fluss stoppen, wenn ein ausgeglichener mittlerer Pegel in den Reservoirs erreicht wird, und 20 g eines VWF-spezifischen FITC-konjugierten Antikörpers in einem Volumen von 200 l PBS (pH 7,4) in die zirkulierenden 13,6 ml ECGMS-Medium mit einem Injektionsanschluss. Wenn kein Injektionsanschluss verfügbar ist, kann der Antikörper alternativ durch Pipettieren in das Medium der Pumpenbehälter hinzugefügt werden. Daraus ergibt sich eine endende Antikörperkonzentration von 1,3 g/ml.
  3. Verwenden Sie für das mikroskopische Scannen mehrerer Sichtfelder in kurzer Zeit die Fluoreszenzeinheit des Mikroskops mit einem Xenon-Fluoreszenzgerät mit 30 % Leistung und einer Epifluoreszenzkamera. Überwachen Sie die Form und Morphologie der HUVEC-Schicht mit dem hellen Feldmodus, um repräsentative Zellen auszuwählen, die für die Visualisierung von VWF-Strings geeignet sind.
  4. Zur Visualisierung von grünen fluoreszierenden VWF-Strings wählen Sie im Fluoreszenzeinheitsmenü der Mikroskopsoftware (LasX) ein 63x/1,40 Ölobjektiv und einen 470 nm Detektionsfilter aus. Erstellen Sie Snapshots von Z-Stacks mit mindestens 50 repräsentativen Feldansichten, die jeweils etwa 10 morphologisch intakte HUVEC enthalten. Zur Quantifizierung der grünen fluoreszierenden VWF-Strings zu verschiedenen Zeitpunkten scannen Sie mehrere Sichtfelder.

5. Mikroskopische Bewertung der bakteriellen Befestigung an VWF-Saiten in Flow in Echtzeit

  1. Quantifizieren Sie die pneumokokkende Befestigung an den AUF HUVEC-Zelloberflächen erzeugten VWF-Strings durch Immunfluoreszenznachweis.
    1. Halten Sie den Durchfluss und injizieren Sie 1,35 x 108 KKR/mL RFP-exezierende Pneumokokken in einem maximalen Volumen von 1 ml in das ECGMS-Medium mit dem Injektionsanschluss. Alternativ pipette die Bakterien in das Medium im Pumpenreservoir. Starten Sie die Scherspannung bei 10 Dyn/cm2 neu, um die Bakterien im Pumpensystem zirkulieren zu lassen.
    2. Wählen Sie ein 63-faches Öl-Immersion-Objektiv für die Mikroskopvergrößerung und passen Sie die Fluoreszenzfiltereinstellungen in der Mikroskopsoftware an den RFP-Kanal (540 nm Detektionsfilter) zur Detektion von RFP-exezierenden Pneumokokken an.
    3. Zur Quantifizierung der bakteriellen Befestigung an den VWF-Strings stoppen Sie den Fluss und erstellen Sie Momentaufnahmen von Z-Stacks von mindestens 30 repräsentativen Feldansichten, die jeweils etwa 10 morphologisch intakte HUVEC enthalten, und zählen die Menge an Pneumokokken.
    4. Verwenden Sie den einfaktoriellen Statistikalgorithmus ANOVA, um die Daten auszuwerten, gefolgt von einem post hoc zweischwanzigen, nicht gepaarten Stichprobentest für einen detaillierten statistischen Vergleich. P-Werte von <0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

6. Mikroskopische Bewertung der bakteriellen Befestigung an VWF-Saiten nach Probenfixierung

  1. Probe der Fixierung vor der Immunfluoreszenzfärbung.
    1. Stoppen Sie den Durchfluss, entfernen Sie 10 ml ECGMS-Medium aus den Pumpenbehältern und fügen Sie 10 ml PBS hinzu, ergänzt durch 5% Paraformaldehyd (PFA). Lassen Sie die PFA-Lösung 10 min bei einer Scherspannung von 10 Dyn/cm2zirkulieren.
    2. Trennen Sie den Kanalschlitten von der Pumpeneinheit.
  2. Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen auf der Zelloberfläche und führen Sie die Immundetektion von VWF-Strings und angehängten Bakterien durch.
    1. Bereiten Sie 4 ml einer Waschlösung mit 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) vor, ergänzt mit 4% Saccharose für alle Waschschritte. Bereiten Sie 1 ml einer Blockierlösung vor, die 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) enthält, ergänzt durch 4% Saccharose und 2% Rinderserumalbumin (BSA) zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen.
    2. Waschen Sie den PFA-inkubierten Kanalschlitten 3x mit einer 1 ml Luer-Spritze, um 200 l der Waschlösung zu injizieren und den Schlitten 120 min bei RT mit 200-L-Blockierlösung zu inkubieren.
    3. Bereiten Sie 4 ml einer anderen Blockierlösung vor, die 100 mM Na2CO3enthält (pH 9.2), ergänzt durch 4% Saccharose und 0,5% BSA zur Verdünnung der Antikörper. Verwenden Sie 200 l dieser Blockierlösung, um das Pneumokokken-spezifische Kaninchenantiserum 1:100 zu verdünnen. Verdünnen Sie den VWF-spezifischen Mausantikörper 1:50 mit 200 l dieser Blockierlösung, um eine VWF-spezifische Antikörperkonzentration von 4 g/ml zu erzielen. Verdünnen Sie den AlexaFluor488-konjugierten Sekundärantikörper aus einer 2 mg/ml-Stammlösung 1:100 in 200 l PBS (pH 7,4), um eine Endkonzentration von 20 g/ml zu erzeugen.
      HINWEIS: In den beschriebenen Immunfluoreszenzeinstellungen lieferte der Antikörpernachweis optimale Ergebnisse, wenn die Antikörper im oben genannten alkalischen Karbonatpuffer verdünnt wurden. Basierend auf den bisherigen Ergebnissen sind die empfohlenen Blockierlösungen und die Menge an Antikörpern für viele Anwendungen geeignet. Verschiedene Experimente erfordern jedoch möglicherweise eine individuelle Optimierung der Antikörperkombination, der Antikörperkonzentration, der Inkubationszeit und der Konstitution des Blockierpuffers. Alternativ könnte ein phosphatgepuffertes System mit neutralem pH-Bereich als Inkubationspuffer geeignet oder sogar bevorzugt sein. Bei schwachen Fluoreszenzsignalen sollte die Konzentration von Sekundärantikörpern erhöht werden. Wenn zu viel unspezifischefluoreszenz-Hintergrundgeräusche festgestellt werden, sollte die Menge der blockierenden Substanzen erhöht werden.
    4. Für die VWF-Immunfluoreszenzfärbung den Kanalschlitten mit einer 1 ml Luer-Spritze durch Injektion von 200 l der Waschlösung 3x waschen und den Schlitten mit dem 1:50 verdünnten VWF-spezifischen Antikörper 30 min bei RT inkubieren. Danach den Kanalschlitten wieder 3x mit 200 waschen L der Waschlösung und inkubieren Sie die Rutsche mit dem 1:100 verdünnten AlexaFluor488-konjugierten mausspezifischen Antikörper für 30 min bei RT. Waschen Sie schließlich die Kanalrutsche 3x mit 200 l der Waschlösung erneut.
      HINWEIS: Die AlexaFluor-Fluorophore sind empfindlich gegenüber Bleichen. Daher sollte die Rutsche geschützt werden, indem sie während der Inkubationsschritte mit den fluorophorkonjugierten Antikörpern in einer dunklen Kammer gehalten wird.
    5. Zur Immundetektion der Pneumokokken die Rutsche mit einem 1:100 verdünnten Pneumokokken-spezifischen Kaninchenantikörper 30 min bei RT inkubieren. Anschließend die Kanalrutsche 3x mit 200 l der Waschlösung waschen und die Rutsche mit 1:100 verdünnt inkubieren. AlexaFluor568-konjugierter kaninchenspezifischer Antikörper für 30 min bei RT. Waschen Sie den Kanalschlitten wieder 3x mit 200 l der Waschlösung.
    6. Um das zelluläre Aktin-Zytoskelett mit fluoreszierendem Phalloidin zu färben, durchpermeabilisieren Sie den HUVEC durch Inkubation mit 120 l von 0,1% Triton X-100 für 5 min bei RT. Waschen Sie den Kanalschlitten 3x mit 200 l der Waschlösung und inkubieren Sie die Rutsche mit 120 l von 1:1.000 verdünnt AlexaFluor350-konjugiertes Phalloidin. Dieser Inkubationsschritt wird das polymerisierte Aktin-Zytoskelett visualisieren und die Überwachung der Zellform und möglicher stressinduzierter morphologischer Veränderungen ermöglichen.
    7. Waschen Sie den Kanalschlitten 3x mit 200 l der Waschlösung. Waschen Sie schließlich den Schlitten 4x mit 200 l ddH2O und visualisieren Sie die grünen fluoreszierenden VWF-Strings, die roten fluoreszierenden Bakterien und das blaue fluoreszierende Aktin-Zytoskelett mit den entsprechenden Filtereinstellungen am Fluoreszenzmikroskop.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Die Kultivierung von primärer HUVEC in einem konstanten unidirektionalen Fluss führt zur Bildung einer konfluenten und dicht gepackten Zellschicht, die die Erzeugung von zellulären WPBs fördert, die mit dem mechanosensitiven VWF13,14gefüllt sind. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines luftdruckpumpenbasierten, pulslosen Rezirkulationssystems für die Infektionsanalyse, das die Scherstresssituation im menschlichen Blutfluss nachahmt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Die Simulation der bakteriellen Interaktion mit mechanosensitiven Wirtsproteinen wie VWF erfordert ein durchwegsnutzbares Zellkultursystem, das die Erzeugung eines definierten, unidirektionalen und kontinuierlichen Flüssigkeitsflusses ermöglicht und so eine zuverlässige Scherspannung erzeugt. . Mehrere mikrofluidische Pumpensysteme wurden bereits beschrieben. Ein ausführlicher Überblick von Bergmann et al. fasst die Wesentlichen Aspekte verschiedener zwei- und dreidimensionaler Zellkulturmodellezus...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Das Projekt wurde von der DFG (BE 4570/4-1) an S.B. gefördert.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Luer-syringeFisher Scientific10303002with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringeSarstedt9077136For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
AccutaseeBioscience now thermo fisher00-4555-56protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated PhalloidinAbcamab176751no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibodyThermo Fisher SientificA11001stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibodyThermo Fisher ScientificA-11011stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-BrothBecton Dickinson GmbHBD 249210complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA2153-25Gsolubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filterTPP90026subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12RBeckman Coulter Life Sciences392304spinning down of bacteria (volumes of >2mL)
Centrifuge Allegra X-30Beckman Coulter Life SciencesB06314spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MKHermle305.00 V05 - Z 216 Mspinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
ChloramphenicolCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3886.2used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubingibidi10821for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-IncubatorFisher ScientificMIDI 40incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2
CO2-IncubatorSanyoMCO-18 AICfor incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C
Colombia blood agar platesBecton Dickinson GmbHPA-254005.06agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
ComputerDellLatitude 3440Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)LeicaDMi8An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3904.1used for PBS buffer
Drying materialMerck101969orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement MixPromocellC-39215supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone
ECGMSPromocellC-22010ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)PromocellC-22010culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS)biochrome now MerckS 0415supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibodyAbcamab8822stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unitibidi10903fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG-1890-100gfor precoating of microslide channel surface
Histamine dihydrochlorideSigma AldrichH-7250-10MGfor induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)PromocellC-12203 Lot-Nr. 396Z042primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)Santa Cruzsc73268stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Portibidi10820for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscopeZeissAxiovert 35Minverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)ibidi80176physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)Sigma AldrichM7506-500GFor preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pumpibidi10905air pressure pump
Neubauer cell counting chamberKarl Hecht GmbH&Co KG40442002microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA)Electron Microscopy Sciences15710-Sfor cross linking of samples
Perfusion Setibidi10964Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS)the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettesSarstedt67,741(2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserumPinedaraised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam platethis is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe6781.1used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)ibidiv1.5.4Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
Reaction tubes 1.5/2.0 mLSarstedt72.706/ 72.695.500required for antibody dilutions
Reaction tubes with 50 mL volumeSarstedt6,25,48,004
RFP-expressing pneumococciNational Collection of Type Cultures, Public Health England10,319Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
Serological pipets 5, 10 mLSarstedt86.1253.025/ 86.1254.025for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)Sigma Aldrich451614-25Gfor preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, KarlsruheP030.2used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22Biochrom80-2115-20measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
SucroseSigma AldrichS0389-500Gfor preparation of blocking buffer
Triton X-100Sigma AldrichT9284-500MLUsed in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extractoxoidLP0021bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY

Referenzen

  1. Weiser, J. N., Ferreira, D. M., Paton, J. C. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nature Reviews Microbiology. 16 (6), 355-367 (2018).
  2. Bergmann, S., Hammerschmidt, S. Versatility of pneumococcal surface proteins. Microbiology. 152, 295-303 (2006).
  3. Bergmann, S., et al. Integrin-linked kinase is required for vitronectin-mediated internalization of Streptococcus pneumoniae by host cells. Journal of Cell Science. 122, 256-267 (2009).
  4. Bergmann, S., Schoenen, H., Hammerschmidt, S. The interaction between bacterial enolase and plasminogen promotes adherence of Streptococcus pneumoniae to epithelial and endothelial cells. International Journal of Medical Microbiology. 303, 452-462 (2013).
  5. Bergmann, S., Rohde, M., Chhatwal, G. S., Hammerschmidt, S. Alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae is a plasmin(ogen)-binding protein displayed on the bacterial cell surface. Molecular Microbiology. 40, 1273-1287 (2001).
  6. Bergmann, S., et al. Identification of a novel plasmin(ogen)-binding motif in surface displayed alpha-enolase of Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 49, 411-423 (2003).
  7. Bergmann, S., Rohde, M., Preissner, K. T., Hammerschmidt, S. The nine residue plasminogen-binding motif of the pneumococcal enolase is the major cofactor of plasmin-mediated degradation of extracellular matrix, dissolution of fibrin and transmigration. Thrombosis and Haemostasis. 94, 304-311 (2005).
  8. Jagau, H., et al. Von willebrand factor mediates pneumococcal aggregation and adhesion in flow. Frontiers in Microbiology. 10, 511(2019).
  9. Tischer, A., et al. Enhanced local disorder in a clinically elusive von willebrand factor provokes high-affinity platelet clumping. Journal of Molecular Biology. 429, 2161-2177 (2017).
  10. Ruggeri, Z. M. Structure of von willebrand factor and its function in platelet adhesion and thrombus formation. Best Practice Research Clinical Haematology. 14, 257-279 (2001).
  11. Spiel, A. O., Gilbert, J. C., Jilma, B. Von willebrand factor in cardiovascular disease: Focus on acute coronary syndromes. Circulation. 117, 1449-1459 (2008).
  12. Springer, T. A. Von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124, 1412-1425 (2014).
  13. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of weibel-palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cellular Microbiology. 14, 210-225 (2012).
  14. Cornish, R. J. Flow in a Pipe of Rectangular Cross-Section. Proceedings of the Royal Society A. 786, 691-700 (1928).
  15. Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. Journal of Visualized Experiments. 14 (126), (2017).
  16. Kjos, M., et al. fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of Bacteriology. 197, 807-818 (2015).
  17. Bergmann, S., Steinert, M. From single cells to engineered and explanted tissues: New perspectives in bacterial infection biology. International Reviews of Cell and Molecular Biology. 319, 1-44 (2015).
  18. Harrison, D. J., et al. Micromachining a miniaturized capillary electrophoresis-based chemical analysis system on a chip. Science. 261 (5123), 895-897 (1993).
  19. Magnusson, M. K., Mosher, D. F. Fibronectin: Structure, assembly, and cardiovascular implications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18, 1363-1370 (1998).
  20. Zerlauth, G., Wolf, G. Plasma fibronectin as a marker for cancer and other diseases. The American Journal of Medicine. 77 (4), 685-689 (1984).
  21. Li, X. J., Valadez, A. V., Zuo, P., Nie, Z. 2012. Microfluidic 3D cell culture: potential application for tissue-based bioassays. Bioanalysis. 4, 1509-1525 (2019).
  22. Fiddes, L. K., et al. A circular cross-section PDMS microfluidics system for replication of cardiovascular flow conditions. Biomaterials. 31, 3459-3464 (2010).
  23. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab on a Chip. 13, 3588-3598 (2013).
  24. Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128, 50-59 (2013).
  25. Schneider, S. W., et al. Shear-induced unfolding triggers adhesion of von willebrand factor fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 7899-7903 (2007).
  26. Reneman, R. S., Hoek, A. P. G. Wall shear stress as measured in vivo: consequences for the design of the arterial system. Medical & Biological Engineering & Computing. 46 (5), 499-507 (2008).
  27. Valentijn, K. M., Sadler, J. E., Valentijn, J. A., Voorberg, J., Eikenboom, J. Functional architecture of Weibel- Palade bodies. Blood. 117, 5033-5043 (2011).
  28. Freshney, R. I. Culture of animal cells: A manual of basic Technique, 5th edition. , Wiley-Liss Publication, Wiley-Blackwell. (2005).
  29. Shaw, J. A. Epithelial cell culture- a practical approach. Shaw, A. J. , IRL Press at Oxford University Press. 218(1996).
  30. Elm, C., et al. Ectodomains 3 and 4 of human polymeric Immunoglobulin receptor (hpIgR) mediate invasion of Streptococcus pneumoniae into the epithelium. Journal of Biological Chemistry. 279 (8), 6296-6304 (2004).
  31. Nerlich, A., et al. Invasion of endothelial cells by tissue-invasive M3 type group A streptococci requires Src kinase and activation of Rac1 by a phosphatidylinositol 3-kinase-independent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20319-20328 (2009).
  32. Ho, C. T., et al. Liver-cell patterning lab chip: mimicking the morphology of liver lobule tissue. Lab on a Chip. 13, 3578-3587 (2013).
  33. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328, 1662-1668 (2010).
  34. Harink, B., Le Gac, S., Truckenmuller, R., van Blitterswijk, C., Habibovic, P. Regeneration-on-a-chip? The perspectives on use of microfluidics in regenerative medicine. Lab on a Chip. 13, 3512-3528 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

Immunologie und InfektionAusgabe 152Streptococcus pneumoniaemikrofluidischeendotheliale ZellenMikroskopieFluoreszenzScherspannungHaftung

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten