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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo studio descrive il monitoraggio microscopico dell'aderenza allo pneumococco alle stringhe del fattore von Willebrand prodotte sulla superficie di cellule endoteliali primarie umane differenziate sotto stress da taglio in condizioni di flusso definite. Questo protocollo può essere esteso alla visualizzazione dettagliata di specifiche strutture cellulari e alla quantificazione dei batteri applicando procedure di immunostaining differenziale.

Abstract

L'interazione di Streptococcus pneumoniae con la superficie delle cellule endoteliali è mediata nel flusso sanguigno attraverso proteine meccanosensibili come il Von Willebrand Factor (VWF). Questa glicoproteina cambia la sua conformazione molecolare in risposta allo stress da taglio, esponendo così i siti di legame per un ampio spettro di interazioni ospite-ligando. In generale, la coltura delle cellule endoteliche primarie sotto un flusso di taglio definito è nota per promuovere la differenziazione cellulare specifica e la formazione di uno strato endoteliale stabile e strettamente collegato simile alla fisiologia del rivestimento interno di un vaso sanguigno . Pertanto, l'analisi funzionale delle interazioni tra patogeni batterici e la vascolatura ospite che coinvolge proteine meccanosensibili richiede l'istituzione di sistemi di pompaggio in grado di simulare le forze di flusso fisiologico note per influenzare la superficie cellule vascolari.

Il dispositivo microfluidico utilizzato in questo studio consente un ricircolo continuo e senza impulsi dei fluidi con una portata definita. Il sistema di pompaggio a pressione dell'aria controllato dal computer applica una sollecitazione di taglio definita sulle superfici delle cellule endote generando un flusso medio continuo, unidirezionale e controllato. I cambiamenti morfologici delle cellule e dell'attaccamento batterico possono essere monitorati e quantificati al microscopio nel flusso utilizzando speciali vetrini di canale progettati per la visualizzazione microscopica. A differenza dell'infezione da coltura cellulare statica, che in generale richiede una fissazione del campione prima dell'etichettatura immunitaria e delle analisi microscopiche, i vetrini microfluidici consentono sia il rilevamento basato sulla fluorescenza di proteine, batteri e componenti cellulari dopo la fissazione del campione; colorazione dell'immunofluorescenza seriale; e rilevamento diretto basato sulla fluorescenza in tempo reale. In combinazione con batteri fluorescenti e anticorpi specifici con etichettatura a fluorescenza, questa procedura di infezione fornisce un efficiente sistema di visualizzazione di componenti multipli per un enorme spettro di applicazioni scientifiche relative ai processi vascolari.

Introduzione

La patogenesi delle infezioni da pneumococco è caratterizzata da un'interazione sfaccettata con una diversità di composti di matrice extracellulare e componenti dell'emostasi umana, come plasminogen e VWF1,2, 3,4,5,6,7,8. La VWF glicoproteina multidominio funge da regolatore chiave di un'emostasi bilanciata mediando il reclutamento di trombociti e l'incorporazione di fibrina nel sito di formazione di trombosi vascolare9. L'importanza del VWF funzionale e attivo per il controllo delle emorragie e la guarigione delle ferite è dimostrata dalla malattia di von Willebrand, un comune disturbo ereditario del sanguinamento10.

Il VWF globulare circola nel sistema sanguigno umano ad una concentrazione fino a 14,0 g/mL11,10. In risposta alle lesioni vascolari, il rilascio locale di VWF da parte di Weibel Palade Bodies (WBP) endoteliale è notevolmente aumentatodi 11,12. Studi precedenti dimostrano che l'aderenza allo pneumococco alle cellule endoteliali umane e la sua produzione della pneumolysin tossina che formano i pori stimola noannamente la secrezione VWF luminale13. Le forze idrodinamiche del flusso sanguigno inducono un'apertura strutturale dei domini VWF meccanorenti. Con una portata di 10 dyn/cm2 il VWF si multimerisce a lunghe stringhe proteiche fino a diverse centinaia di micrometri di lunghezza che rimangono attaccate al subendotelio10,12.

Per comprendere la funzione delle stringhe VWF multimeriche generate sotto stress da taglio nell'interazione dello pneumococco con la superficie endoteliale, è stato stabilito un approccio di infezione da coltura cellulare basato su microfluidica. È stato utilizzato un dispositivo microfluidico con un sistema di pompa a pressione dell'aria controllato dal software. Ciò ha permesso un continuo, unidirezionale ricircolo del mezzo di coltura cellulare con una portata definita. Di conseguenza, il sistema ha applicato una sollecitazione di taglio definita sulla superficie delle cellule endoteliali, che sono rimaste attaccate all'interno di vetrini di canale specializzati. Questo approccio ha permesso la simulazione della forza di taglio all'interno del flusso sanguigno del sistema vascolare umano, in cui le stringhe VWF vengono generate su cellule endoteliali differenziate in condizioni di flusso costante definite. A tale scopo, le cellule endoteliali sono state coltivate in specifici vetrini di canale (vedi Tabella dei materiali), che sono stati adattati per analisi microscopiche durante il flusso. Il sistema di pompaggio microfluidico ha fornito la situazione di sollecitazione di taglio altamente definita e controllata necessaria per la formazione di corde VWF estese sullo strato di cellule endoteliali confluenti. Dopo la stimolazione della secrezione di VWF delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) coltivate confluentemente dal completamento dell'istamina, la formazione delle corde è stata indotta applicando uno stress da taglio di 10 disiniettorio2. La sollecitazione di taglio è definita come la forza che agisce sul livello della cella. Viene calcolato approssimativamente secondo Cornish et. al.14 con l'equazione 1:
figure-introduction-3793

Dove , e lo stress da taglio in dyn/cm2, la viscosità (dyn s)/cm2, h , la metà dell'altezza del canale, la larghezza del canale e la metà della larghezza del canale e la linea di flusso in mL/min.

Il risultato dell'equazione 1 dipende dalle diverse altezze e larghezze delle diverse diapositive utilizzate (vedere Tabella dei materiali). In questo studio è stata utilizzata una diapositiva di canale Luer di 0,4 m risultante in un fattore di scorrimento della camera di 131,6 (vedere la formula 2).
figure-introduction-4476

La viscosità del mezzo a 37 gradi centigradi è 0,0072 dynos/cm2 ed è stata utilizzata una sollecitazione di taglio di 10 dini/cm2. Ciò ha comportato una portata di 10,5 mL/min (vedi formula 3).
figure-introduction-4769

Qui, l'adattamento e l'avanzamento di una procedura di coltura cellulare microfluidica utilizzando un sistema di flusso laminare unidirezionale per l'indagine e la visualizzazione dei meccanismi di infezione batterica nella vascolatura ospite è descritto in dettaglio. La generazione di stringhe VWF su strati endoteliali può essere stimolata anche utilizzando altri sistemi di pompaggio in grado di applicare una sollecitazione di taglio continua e costante15.

Dopo la coltivazione di cellule endoteliali primarie alla confluenza nel flusso e nella stimolazione della formazione delle corde VWF, gli pneumococci che esprimono la proteina di fluorescenza rossa (RFP)16 sono stati aggiunti allo strato di cellule endoteliali sotto costante controllo microscopico. L'attaccamento dei batteri alle stringhe VWF sulla superficie delle cellule endoteliali è stato visualizzato e monitorato al microscopio per un massimo di tre ore in tempo reale utilizzando anticorpi con etichettafluenza specifica VWF. Con questo approccio, il ruolo del VWF come cofattore di adesione che promuove l'attaccamento batterico all'endotelio vascolare è stato determinato8.

Oltre alla visualizzazione microscopica della secrezione proteica e ai cambiamenti conformazionali, questo metodo potrebbe essere utilizzato per monitorare singoli passaggi dei processi di infezione batterica in tempo reale e per quantificare la quantità di batteri collegati in diversi punti temporali di infezione. Lo specifico sistema di pompe software-controllato offre anche la possibilità di coltura le cellule endoteliali in condizioni di flusso costante definite per un massimo di diversi giorni e consente un'incubazione a flusso medio pulsato definito. Inoltre, questo metodo può essere applicato utilizzando diversi tipi di cella. L'adattamento del protocollo di colorazione consente anche il rilevamento e la visualizzazione di batteri interiorizzati in cellule eucariotiche.

Questo manoscritto descrive questo protocollo sperimentale avanzato che può essere utilizzato come approccio definito, affidabile e riproducibile per una caratterizzazione efficiente e versatile dei processi patofisiologici.

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Protocollo

La coltivazione delle cellule microfluidiche è stata eseguita con cellule endoteliali otiliarie primarie commerciali (HUVEC). L'azienda ha isolato le cellule con il consenso informato del donatore. Questo studio è stato approvato dalla Camera etica dei medici del Baden-Wuerttemberg dello Stato federale con il numero di referenza 219-04.

NOT: Vedere Tabella dei materiali per le forniture di protocollo.

1. Precoltivazione delle cellule primarie

  1. Scongelare una fiala glicerol congelata contenente 1 x 105 HUVEC primario da tre donatori diversi delicatamente a 37 s e seminare le cellule in 7 mL di mezzo di crescita delle cellule endoteliali preriscaldate (ECGM, pronto per l'uso con integratori) in un flacone di 25 cme 2.
    NOT: Le cellule endoteliali primarie perdono capacità di differenziazione dopo più di 5 cicli di proliferazione. Pertanto, solo le cellule con meno di 5 passaggi possono essere utilizzate se sono necessari alti gradi di differenziazione cellulare.
  2. Coltivare le cellule a 37 gradi centigradi in un'atmosfera di CO2 del 5% per 60 min per consentire l'attaccamento superficiale e scambiare il mezzo di coltura cellulare ECGM per eliminare i residui della crioconservazione.
  3. Continuare a coltivare le cellule a 37 gradi centigradi nell'atmosfera di CO2 del 5% fino a formare uno strato di cellule subconfluenti.
    NOT: L'HUVEC non deve crescere fino a diventare uno strato confluente poiché i contatti cellulari stretti impediscono la formazione di uno strato cellulare stabile in seguito nel flusso.

2. Precoltivazione di Streptococcus pneumoniae

AVVISO: Streptococcus pneumoniae è un agente di livello 2 di biosicurezza e può essere coltivato solo nei laboratori di livello 2 di biosicurezza. Utilizzare una panca pulita classificata per il livello di sicurezza 2 per tutti i trattamenti batterici, evitare rigorosamente la formazione di aerosol e utilizzare una centrifuga con protezione dagli aerosol per la sedimentazione dei batteri.

  1. Inoculare una piastra di agar di sangue Columbia con Streptococcus pneumoniae clinica isolaATCC11733 derivata da uno stock di glicerolo costantemente conservato a -80 gradi centigradi e coltivare la piastra di agar durante la notte a 37 e 5% CO2.
  2. Preparare 40 mL di brodo liquido Todd Hewitt integrato con 1% di estratto di lievito (THY) e 15 mL di sterile fosfato-buffered (PBS) pH 7.4, per la coltivazione batterica e passaggi di lavaggio.
  3. Utilizzare un tubo sterile per la coltivazione batterica e inoculare il brodo di coltura liquida con massa batterica. Controllare la quantità di inoculazione mediante misurazione fotometrica di 1 mL aliquote a 600 nm rispetto al brodo liquido non inoculato come riferimento. Riempire la massa batterica nel brodo liquido fino a raggiungere una densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,15.
  4. Incubare il brodo liquido inoculato senza agitare a 37 e 5% di CO2 e determinare l'OD600 ogni 30 min misurando 1 mL di aliquote con cuvette di plastica.
  5. Non appena la coltura batterica ha raggiunto un OD600 di 0,4, che corrisponde alla fase di crescita esponenziale, centrifugare la sospensione della coltura batterica per 10 min a 1.000 x g a temperatura ambiente (RT).
    NOT: Non permettere a una coltura di pneumococco di raggiungere un OD600 di più di 1,0, perché un'alta densità di coltura dello pneumococco è noto per innescare l'autolisi batterica, che potrebbe influenzare la forma fisica batterica complessiva.
  6. Risospendere delicatamente i sedimenti batterici con PBS da 10 mL e di nuovo i sedimenti per 10 min a 1.000 x g a RT.
  7. Risospendere delicatamente i sedimenti batterici lavati in PBS da 1 mL e determinare l'OD600 di 10 -L della sospensione batterica utilizzando 1 mL di PBS come riferimento.
  8. Regolare la quantità di batteri in PBS in base a un OD600 di 2.0. Secondo il conteggio batterico precedentemente determinato, un OD600 di 2.0 corrisponde a 2 x 109 unità formanti colonia (CFU). Procedere immediatamente con la procedura di infezione per prevenire l'autolisi batterica.

3. Coltivazione di cellule endoteliali di HUVEC in condizioni microfluidiche

  1. Staccare le cellule endoteliali primarie dal pallone di coltura cellulare mediante proteolisi controllata. Eseguire i seguenti passaggi in un ambiente sterile utilizzando un banco pulito. Preparare un volume di 15 mL di PBS sterile per le fasi di lavaggio.
    1. Rimuovere l'ECGM da uno strato HUVEC coltivato in modo subconfluente e lavare lo strato cellulare con 10 mL PBS utilizzando una pipetta sierologica per sbarazzarsi del mezzo di coltura cellulare.
    2. Incubare l'HUVEC lavato con 3 mL di 37 gradi centigradi, soluzione di dissociazione cellulare preriscaldata per il distacco cellulare per 5 min a 37 gradi centigradi. Osservare il distacco delle cellule proteolitiche monitorando microscopico ogni minuto.
    3. Pipetta la sospensione cellulare staccata in un tubo contenente 7 mL di ECGM integrato con 2% siero di vitello fetale (FCS) per fermare la proteolisi e sedimentare le cellule per 3 min a 220 x g a RT.
    4. Rimuovere il supernatante e risospendere l'HUVEC in 250 gradi l di ECGM integrato con 5% FCS e 1 mM MgSO4. Utilizzare 10 volte la sospensione cellulare per il conteggio cellulare utilizzando una camera di conteggio delle celle Neubauer e regolare il numero di celle a 4 x 106 celle/mL ECGM integrato con 5% FCS e 1 mM MgSO4.
      NOT: Per ogni esperimento di flusso saranno necessari 30 mL di mezzo ECGM integrati con 5% FCS e 1 mM MgSO4. Da qui in questo medio composizionino si chiama ECGMS-medium. L'aumento della concentrazione di FCS nel mezzo di coltura dal 2% al 5% supporta l'attaccamento cellulare e la vitalità cellulare delle semi HUVEC nella diapositiva del canale. Il mezzo integratori FCS e MgSO4 sostanzialmente stabilizzare l'attaccamento cellulare di HUVEC in condizioni di stress taglio.
  2. Seme e coltivare l'HUVEC in uno scivolo di canale. Lavorare in un ambiente sterile utilizzando un banco pulito. Le cellule saranno coltivate sotto stress da taglio per 2 giorni seguite da infezione da batteri e monitoraggio microscopico per altri 2 h.
    1. E' uno scivolo a canale, un set di perfusione di 1,6 mm di diametro e 50 cm di lunghezza, un'aliquota del mezzo ECGMS e un canale di Luer di 0,4 m di altezza, per 24 h in un'incubatrice con 5% di CO2 atmosfera a 37 gradi centigradi per ridurre il numero di bolle d'aria.
      NOT: Questa procedura è consigliata per degas l'apparecchiatura plastica e per preriscaldare il mezzo, i tubi di perfusione, ei serbatoi. Se materiali o liquidi sono stati immagazzinati in RT o in frigorifero, i gas disciolti nella plastica e i liquidi saranno rilasciati quando vengono riscaldati nell'incubatrice durante l'esperimento. Appariranno poi le bolle di gas. Degassare tutti i componenti in plastica prima dell'esperimento eliminerà questo effetto. Ogni volta che il sistema viene estratto dall'incubatrice, il processo di assorbimento del gas ricomincia. Pertanto, lavorare rapidamente alla RT e non lasciare mai l'unità fluida al di fuori dell'incubatrice per periodi di tempo più lunghi.
    2. Utilizzare una pipetta per iniettare 100 -L di una soluzione di gelatina di porcivi filtrata sterile del 2% in soluzione PBS in uno dei serbatoi di uno scivolo di canale equilibrato a temperatura. Incubare la soluzione di gelatina per 1 h a 37 gradi centigradi e sciacquare il canale del vetrino con 1 mL di PBS in condizioni sterili utilizzando una siringa Luer da 1 mL.
    3. Posizionare il vetrino a canale rivestito di gelatina su una sottile piastra di polistirolo o polistirolo per evitare un calo della temperatura della diapositiva. Aggiungere 100 l of the 4 x 106/mL SUSPENSION HUVEC con una siringa Luer da 1 mL nello scivolo.
      NOT: Posizionare il vicolo di canale sulla superficie metallica fredda del banco pulito potrebbe diminuire la temperatura del fondo di scorrimento, generando così stress da freddo alle cellule endoteliali. Durante la pertintura cellulare tenere la diapositiva un po 'verso l'alto per consentire bolle d'aria salire e scomparire dall'interno della diapositiva.
    4. Incubare il vetrino del canale con l'HUVEC per 60 min a 37 e 5% di CO2 e riempire i serbatoi medi ad entrambe le estremità del vetrino del canale con 60 ECGMS-medium ciascuno. Incubare per 1 h a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.
  3. Regolare la pompa microfluidica e le impostazioni del software.
    1. Collegare il set di perfusione equilibrata all'unità pompa, riempire con 13,6 mL di ECGMS-medio, e avviare il software di controllo della pompa. Selezionare il set di perfusione adeguato e il tipo di diapositiva della camera utilizzando le finestre scorrevoli verso il basso nel menu dell'unità fluidica impostata. Scegliete 0,007 (dyn s/cm2) nel software per una viscosità media. (Fare riferimento alle impostazioni del software della pompa di pressione contrassegnate con frecce rosse nella figura 1 supplementare).
    2. Al di fuori dell'incubatrice, collegare una bottiglia di vetro riempita con perline di silice essiccanti al tubo di pressione dell'aria (fare riferimento alla Figura 1, Inset 3). L'aria della pompa di pressione circola tra i serbatoi di perfusione e la pompa e deve essere asciutta prima di rientrare nel dispositivo di pompaggio. Selezionare Parametri di flusso nel menu del software, impostare la pressione a 40 mbar e lavare i tubi della pompa con il mezzo liquido avviando il flusso medio continuo. (Queste impostazioni sono indicate anche da frecce rosse nella figura supplementare 1).
    3. Programmare i cicli di sollecitazione di taglio desiderati di coltivazione del flusso. Iniziare con 5 dyn/cm2, controllare pompaggio serbatoio bilanciato e assicurare che nessuna bolla d'aria circolano nel sistema di pompaggio.
      NOT: La sollecitazione di taglio a parete in una diapositiva di canale dipende dalla portata e dalla viscosità del mezzo perfusione. Se si utilizza un altro sistema di pompaggio, fare riferimento alle equazioni descritte nell'introduzione per impostare una portata che genera il livello di sollecitazione di taglio desiderato. Le impostazioni descritte corrispondono a una portata di 5,42 mL/min. (una schermata esemplare che mostra le impostazioni appropriate dei parametri di flusso nel software della pompa di pressione è mostrata nella figura supplementare 2).
    4. Arrestare la circolazione del flusso nel software di controllo della pompa e mantenere il flusso medio nel tubo di perfusione bloccando i tubi vicino ai collegamenti Luer. Collegare lo scivolo del canale, evitando così le bolle d'aria, e posizionare l'unità fluida con la diapositiva di canale collegata in un'incubatrice di CO2 a 37 gradi centigradi e 5% di CO2. Iniziare la sollecitazione di taglio a 5 dyn/cm2 per 30 min per adattare agevolmente le cellule alle forze generate dallo stress di taglio prima di accelerare il livello di sollecitazione di taglio (vedere Figura supplementare 3).
      NOT: Fare attenzione che nessuna bolla d'aria rimanga nel sistema di tubi o nel vetrino dopo il collegamento al sistema di tubi perché il movimento delle bolle d'aria nel flusso potrebbe portare al distacco delle cellule.
    5. Accelerare lo stress di taglio a 10 dyn/cm2 (che corrispondono a 10,86 mL/min in questa impostazione di flusso) e incubare il flusso del canale in sollecitazione di taglio continua per 48 h in una piccola incubatrice di CO2 a 37 e 5% CO2 per consentire la differenziazione cellulare ( i rispettivi settinngs software sono indicati con frecce rosse nella Figura 4 supplementare).
      NOT: Le cellule HUVEC tendono a staccarsi dalla superficie del canale se la coltivazione del flusso viene avviata direttamente a 10 dyn/cm2. Le cellule rimangono attaccate alla superficie della camera se la coltivazione del flusso viene avviata con meno sollecitazione di taglio utilizzando 5 dyn/cm2 per un minimo di 30 min seguito aumentando lentamente lo stress di taglio fino al desiderato 10 dyn/cm2. Una sollecitazione di taglio di 10 dyn/cm2 è il valore minimo in questa impostazione di perfusione necessaria per la formazione di stringhe VWF.
    6. Dopo 24 h di coltivazione cellulare microfluidica, arrestare il flusso medio con il software di controllo della pompa esattamente quando viene raggiunto un livello medio bilanciato in entrambi i serbatoi medi. Mettere l'unità fluidica in un panca pulito e rimuovere 10 mL del mezzo di coltivazione circolato dei serbatoi di perfusione utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL. Aggiungere 10 mL di ECGMS-medium nei serbatoi per rinnovare il mezzo, rimettere l'unità fluida nell'incubatrice di CO2 a 37 e 5% di CO2e riavviare la coltivazione fluidica utilizzando il software di controllo della pompa.
      NOT: La funzione della pompa di pressione può essere improvvisamente interrotta da macchine di laboratorio come grandi centrifughe, che potrebbero creare un forte disturbo del campo magnetico. Questa improvvisa interruzione potrebbe portare al distacco delle cellule. Fare attenzione che tali macchine non siano attive vicino alla pompa di pressione durante l'esperimento.
    7. Iniziare il preriscaldamento della camera di incubazione della temperatura che copre lo stadio del microscopio a fluorescenza a 37 gradi centigradi per l'equilibratura della temperatura 24 h prima della visualizzazione microscopica. Dopo aver preriscaldato il microscopio, avviare il controllo software del microscopio e regolare le impostazioni principali per il monitoraggio microscopico a fluorescenza selezionando le impostazioni di filtro appropriate (540 nm/590 nm per il rilevamento dei batteri che esprimono RFP e 470 nm/515 nm per il rilevamento dell'emissione di fluoresceina degli anticorpi specifici di VWF coniugati FITC). Preriscaldare una camera di riscaldamento supplementare per l'incubazione dell'unità fluidica a 37 gradi centigradi.
      NOT: Durante l'infezione analisi e monitoraggio microscopico la temperatura del vetrino del canale e il mezzo circolante non dovrebbe diminuire in modo sostanziale, perché questo genererebbe stress da freddo sulle cellule. In generale, la dimensione delle camere di temperatura che coprono lo stadio del microscopio non è sufficiente a coprire l'intera unità fluidica. Pertanto, si raccomanda l'uso di una camera di riscaldamento supplementare preriscaldata a 37 gradi centigradi.
    8. Per la visualizzazione microscopica, posizionare l'unità fluida nella camera di riscaldamento preriscaldata da 37 gradi centigradi e posizionare lo scivolo del canale su uno stadio del microscopio preriscaldato a 37 gradi centigradi.
      NOT: Per la visualizzazione microscopica, l'unità fluidica e lo scivolo canale dovevano essere rimossi dall'incubatrice di CO2 a causa della lunghezza limitata del tubo perfusione. Se i tempi di infezione e il monitoraggio microscopico superiore a 180 min sono necessari al di fuori dell'atmosfera di CO2 del 5% per il buffering del pH, è necessario utilizzare un mezzo tamponato per il pH per la coltivazione microfluidica.
    9. Controllare la morfologia cellulare e l'integrità dello strato HUVEC prima dell'iniezione di istamina e batteri alla circolazione del flusso durante il tempo dell'esperimento di flusso e dopo aver terminato l'esperimento di flusso utilizzando la modalità campo luminoso del microscopio.

4. Induzione del rilascio VWF e visualizzazione di stringhe VWF multimerizzate

  1. Mantenere l'impostazione del flusso, poiché è necessaria una sollecitazione di taglio di 10 dyn/cm2 per attivare la multimerizzazione di VWF a stringhe lunghe fino a 200 MDa. Indurre il rilascio di VWF da WPB endoteliale iniettando 136 -L di una soluzione di stock di istamina da 100 mM nel mezzo ECGMS circolante nel tubo di perfusione utilizzando una porta di iniezione. La concentrazione finale di istamina nel mezzo di flusso sarà di 1 mM. Se non è disponibile alcuna porta di iniezione, l'istamina può essere aggiunta alternativamente pipettando nel mezzo dei serbatoi di pompaggio.
  2. Per il rilevamento immunofluorescenza di stringhe VWF multimerizzate, arrestare il flusso quando viene raggiunto un livello medio bilanciato nei serbatoi e iniettare 20 g di un anticorpo coniugato specifico di VWF in un volume di 200L PBS (pH 7.4) nel ECGMS-medium utilizzando una porta di iniezione. Se non è disponibile alcuna porta di iniezione, l'anticorpo può essere aggiunto alternativamente pipetting nel mezzo dei serbatoi di pompa. Ciò si traduce in una concentrazione finale di anticorpi di 1,3 g/mL.
  3. Per la scansione microscopica di diversi campi visivi in breve tempo, utilizzare l'unità di fluorescenza del microscopio con un dispositivo di fluorescenza Xenon al 30% di potenza e una fotocamera a epiorescenza. Monitorare la forma e la morfologia del livello HUVEC con la modalità campo luminoso per selezionare le celle rappresentative adatte per la visualizzazione delle stringhe VWF.
  4. Per la visualizzazione delle stringhe VWF fluorescenti verdi, selezionare un obiettivo di olio 63x/1.40 e un filtro di rilevamento di 470 nm nel menu dell'unità di fluorescenza del software al microscopio (LasX). Creare istantanee di stack z di almeno 50 viste di campo rappresentative, ognuna contenente circa 10 HUVEC morfologicamente intatto. Per la quantificazione delle stringhe VWF fluorescenti verdi in punti temporali diversi, eseguire la scansione di diversi campi visivi.

5. Valutazione microscopica dell'attaccamento batterico alle stringhe VWF in flusso in tempo reale

  1. Quantificare l'attaccamento pneumococcico alle stringhe VWF generate sulle superfici cellulari HUVEC tramite il rilevamento dell'immunofluorescenza.
    1. Tenere il flusso e iniettare pneumococci di 1,35 x 108 CFU/mL RFP in un volume massimo di 1 mL nel mezzo ECGMS utilizzando la porta di iniezione. In alternativa, pipette i batteri nel mezzo nel serbatoio della pompa. Riavviare lo stress di taglio a 10 dyn/cm2 per far circolare i batteri all'interno del sistema di pompaggio.
    2. Selezionare un obiettivo di immersione dell'olio 63x per l'ingrandimento del microscopio e regolare le impostazioni del filtro a fluorescenza nel software del microscopio sul canale RFP (filtro di rilevamento 540 nm) per il rilevamento di pneumococci che esprime RFP.
    3. Per la quantificazione dell'attaccamento batterico alle stringhe VWF, arrestare il flusso e creare istantanee di stack z di almeno 30 viste di campo rappresentative, ognuna contenente circa 10 HUVEC morfologicamente intatti, e contare la quantità di pneumococci.
    4. Utilizzare l'algoritmo delle statistiche unfattoriali ANOVA per valutare i dati, seguito da un test di campione non accoppiato a due code post hoc per un confronto statistico dettagliato. I valori P di <0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

6. Valutazione microscopica dell'attaccamento batterico alle corde VWF dopo la fissazione del campione

  1. Campionare la fissazione prima della colorazione dell'immunofluorescenza.
    1. Arrestare il flusso, rimuovere 10 mL di ECGMS-medio dai serbatoi di pompaggio, e aggiungere 10 mL di PBS integrato con 5% paraformaldeide (PFA). Lasciare circolare la soluzione PFA per 10 min ad uno stress di taglio di 10 dyn/cm2.
    2. Scollegare lo scivolo del canale dall'unità di pompa.
  2. Bloccare siti di legame non specifici sulla superficie cellulare ed eseguire il rilevamento immuno-rilevamento delle stringhe VWF e dei batteri collegati.
    1. Preparare 4 mL di una soluzione di lavaggio contenente 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) integrata con il 4% di saccarosio per tutte le fasi di lavaggio. Preparare 1 mL di una soluzione di blocco contenente 100 mM Na2CO3 (pH 9.2) integrata con il 4% di saccarosio e il 2% di albumina di siero bovino (BSA) per il blocco di siti di legame non specifici.
    2. Lavare lo scivolo a canale 3x incubato pFA utilizzando una siringa Luer da 1 mL per iniettare 200 l della soluzione di lavaggio e incubare lo scivolo per 120 min a RT con soluzione di blocco di 200 .L.
    3. Preparare 4 mL di un'altra soluzione di blocco contenente 100 mM Na2CO3, (pH 9.2) integrata con il 4% di saccarosio e lo 0,5% di BSA per la diluizione degli anticorpi. Utilizzare 200 - L di questa soluzione di blocco per diluire l'antisiero di coniglio specifico per lo pneumococco 1:100. Utilizzare 200 l di questa soluzione di blocco per diluire l'anticorpo del mouse specifico di VWF 1:50 per creare una concentrazione di anticorpi specifica di VWF pari a 4 g/mL. Diluire l'anticorpo secondario coniugato AlexaFluor488 da una soluzione di riserva da 2 mg/mL 1:100 in 200 -L di PBS (pH 7.4) per generare una concentrazione finale di 20g/mL.
      NOT: Nelle impostazioni di immunofluorescenza descritte, il rilevamento degli anticorpi ha fornito risultati ottimali quando gli anticorpi sono stati diluiti nel suddetto buffer di carbonato alcalino. Sulla base dei risultati precedenti, le soluzioni di blocco consigliate e la quantità di anticorpi sono adatte per molte applicazioni. Tuttavia, diversi esperimenti potrebbero richiedere l'ottimizzazione individuale della combinazione di anticorpi, concentrazione di anticorpi, tempo di incubazione e costituzione del buffer di blocco. In alternativa, un sistema con buffer di fosfato con un intervallo di pH neutro potrebbe essere adatto o addirittura preferito come buffer di incubazione. In caso di deboli segnali di fluorescenza, la concentrazione di anticorpi secondari dovrebbe essere aumentata. Se viene rilevato troppo rumore di fondo a fluorescenza non specifica, la quantità di sostanze bloccanti deve essere aumentata.
    4. Per la colorazione VWF-immunofluorescence, lavare la diapositiva del canale utilizzando una siringa Luer da 1 mL iniettando 200 l della soluzione di lavaggio 3x e incubare il vetrino con l'anticorpo specifico VWF diluito 1:50 per 30 min a RT. In seguito, lavare nuovamente il canale 3x con 200 Ll della soluzione di lavaggio e incubare lo scivolo con l'anticorpo diluito AlexaFluor488-formigò specifico del mouse per 30 min a RT. Infine, lavare di nuovo lo scivolo del canale 3x con 200 l della soluzione di lavaggio.
      NOT: Gli AlexaFluor-fluorofori sono sensibili allo sbiancamento. Pertanto, il vetrino deve essere protetto tenendolo in una camera oscura durante le fasi di incubazione con gli anticorpi coniugati a fluoroforo.
    5. Per l'immunorilevamento degli pneumococchi, incubare lo scivolo con un anticorpo di coniglio specifico per pneumococcus diluito per 30 min a RT. Successivamente, lavare la diapositiva del canale 3x con 200 L della soluzione di lavaggio e incubare lo scivolo con 1:100 diluito Anticorpo specifico per coniglio coniugato AlexaFluor568 per 30 min a RT. Lavare nuovamente lo scivolo del canale 3x con 200 l della soluzione di lavaggio.
    6. Per macchiare il citoscheletro di actina cellulare con phalloidina fluorescente, permeabilizzare l'HUVEC per incubazione con 120 gradi L dello 0,1% Triton X-100 per 5 min a RT. Lavare lo scivolo del canale 3x con 200 gradi l della soluzione di lavaggio e incubare lo scivolo con 120 . Phalloidingiugone alfaficata AlexaFluor350. Questa fase di incubazione visualizzerà il citoscheletro actina polimerizzato e permetterà il monitoraggio della forma cellulare e dei possibili cambiamenti morfologici indotti dallo stress.
    7. Lavare lo scivolo del canale 3x con 200 l della soluzione di lavaggio. Infine, lavare la diapositiva 4x con 200 s L ddH2O e visualizzare le corde VWF fluorescenti verdi, i batteri fluorescenti rossi e il citoscheletro afluorescente blu utilizzando le impostazioni di filtro appropriate al microscopio a fluorescenza.

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Risultati

La culminazione dell'HUVEC primario in un flusso unidirezionale costante comporta la formazione di uno strato cellulare confluente e strettamente imballato che promuove la generazione di MDB cellulari riempiti con il VWF meccanosensibile13,14. Questo protocollo descrive l'uso di un sistema di ricircolo senza impulsi basato sulla pressione dell'aria per l'analisi delle infezioni che richiede di imitare la situazione di stress da taglio nel flusso sanguigno umano.<...

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Discussione

La simulazione dell'interazione batterica con proteine ospiti meccanosensibili come VWF richiede un sistema di coltura cellulare perffubile che consente la generazione di un flusso definito, unidirezionale e continuo di liquidi, generando così uno stress di taglio affidabile . Sono già stati descritti diversi sistemi di pompe microfluidiche. Una revisione completa di Bergmann et al. riassume gli aspetti chiave dei diversi modelli di coltura cellulare bidimensionali e tridimensionali17.

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Il progetto è stato finanziato dal DFG (BE 4570/4-1) a S.B.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Luer-syringeFisher Scientific10303002with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringeSarstedt9077136For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
AccutaseeBioscience now thermo fisher00-4555-56protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated PhalloidinAbcamab176751no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µL of a 1:1,000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibodyThermo Fisher SientificA11001stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibodyThermo Fisher ScientificA-11011stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-BrothBecton Dickinson GmbHBD 249210complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma AldrichA2153-25Gsolubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filterTPP90026subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12RBeckman Coulter Life Sciences392304spinning down of bacteria (volumes of >2mL)
Centrifuge Allegra X-30Beckman Coulter Life SciencesB06314spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MKHermle305.00 V05 - Z 216 Mspinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
ChloramphenicolCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3886.2used in a concentration of 0.2 mg/mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubingibidi10821for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-IncubatorFisher ScientificMIDI 40incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37 °C and 5% CO2
CO2-IncubatorSanyoMCO-18 AICfor incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37 °C
Colombia blood agar platesBecton Dickinson GmbHPA-254005.06agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
ComputerDellLatitude 3440Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)LeicaDMi8An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe3904.1used for PBS buffer
Drying materialMerck101969orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement MixPromocellC-39215supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng/mL epidermal growth factor, 1 ng/mL basic fibroblast growth factor, 90 µg/mL heparin, 1 µg/mL Hydrocortisone
ECGMSPromocellC-22010ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)PromocellC-22010culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS)biochrome now MerckS 0415supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibodyAbcamab8822stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unitibidi10903fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG-1890-100gfor precoating of microslide channel surface
Histamine dihydrochlorideSigma AldrichH-7250-10MGfor induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)PromocellC-12203 Lot-Nr. 396Z042primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)Santa Cruzsc73268stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Portibidi10820for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscopeZeissAxiovert 35Minverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40x water objective allowing 400x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)ibidi80176physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)Sigma AldrichM7506-500GFor preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pumpibidi10905air pressure pump
Neubauer cell counting chamberKarl Hecht GmbH&Co KG40442002microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA)Electron Microscopy Sciences15710-Sfor cross linking of samples
Perfusion Setibidi10964Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37 °C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS)the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettesSarstedt67,741(2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserumPinedaraised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam platethis is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe6781.1used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)ibidiv1.5.4Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
Reaction tubes 1.5/2.0 mLSarstedt72.706/ 72.695.500required for antibody dilutions
Reaction tubes with 50 mL volumeSarstedt6,25,48,004
RFP-expressing pneumococciNational Collection of Type Cultures, Public Health England10,319Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
Serological pipets 5, 10 mLSarstedt86.1253.025/ 86.1254.025for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)Sigma Aldrich451614-25Gfor preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)Carl Roth GmbH + Co. KG, KarlsruheP030.2used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22Biochrom80-2115-20measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
SucroseSigma AldrichS0389-500Gfor preparation of blocking buffer
Triton X-100Sigma AldrichT9284-500MLUsed in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extractoxoidLP0021bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY

Riferimenti

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