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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben Protokolle zur Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO durch Röntgenkristallographie. Die Methoden umfassen Proteinexpression, Reinigung und Charakterisierung sowie Strategien zur erfolgreichen Kristalloptimierung und Strukturbestimmung des Proteins in seiner ungebundenen Form.

Zusammenfassung

NEMO ist ein Gerüstprotein, das eine wesentliche Rolle im NF-B-Signalweg spielt, indem es den IKK-Komplex mit den Kiinasen IKK und IKK zusammenbaut. Bei aktivierung phosphoryliert der IKK-Komplex die I-B-Moleküle, die zur NF-B-Kerntranslokation und Aktivierung von Zielgenen führen. Die Hemmung der NEMO/IKK-Wechselwirkung ist ein attraktives therapeutisches Paradigma für die Modulation der NF-B-Signalwegaktivität, was NEMO zu einem Ziel für das Design und die Entdeckung von Inhibitoren macht. Um den Prozess der Entdeckung und Optimierung von NEMO-Inhibitoren zu erleichtern, haben wir ein verbessertes Konstrukt der IKK-bindungsdomäne von NEMO entwickelt, das eine Strukturbestimmung des Proteins in der Apo-Form und gleichzeitig an kleine Molekulargewichtsinhibitoren gebunden. Hier stellen wir die Strategie für die Gestaltung, den Ausdruck und die strukturelle Charakterisierung der IKK-Bindungsdomäne von NEMO vor. Das Protein wird in E. coli-Zellen exprimiert, unter denatierenden Bedingungen solubilisiert und durch drei chromatographische Schritte gereinigt. Wir diskutieren die Protokolle zur Gewinnung von Kristallen zur Strukturbestimmung und beschreiben Datenerfassungs- und Analysestrategien. Die Protokolle werden eine breite Anwendbarkeit auf die Strukturbestimmung von Komplexen von NEMO und kleinen Molekülinhibitoren finden.

Einleitung

Der NF-B-Signalweg wird als Reaktion auf eine Vielzahl von Reizen aktiviert, einschließlich Zytokine, mikrobielle Produkte und Stress, um die Expression von Zielgenen zu regulieren, die für entzündliche und Immunantwort, Zelltod oder Überleben und Proliferation verantwortlich sind1. Pathologien wie entzündliche und Autoimmunerkrankungen und Krebs2,3,4,5 wurden mit der Hyperaktivierung des Signalwegs korreliert, die Modulation der NF-B-Aktivität zu einem Hauptziel für die Entwicklung neuer Therapien6,7gemacht hat.

Insbesondere der kanonische NF-B-Signalweg unterscheidet sich von dem nicht-kanonischen Weg, der für die Lymphorganogenese und Die B-Zell-Aktivierung verantwortlich ist, durch die Abhängigkeit des erstgenannten vom Gerüstprotein NEMO (NF-B essential modulator8) für die Montage des IKK-Komplexes mit den Kiinasen IKK. Der IKK-Komplex ist verantwortlich für die Phosphorylierung von I-B (Inhibitor von B), die auf den Abbau abzielt, wodurch die NF-B-Dimere in den Kern für die Gentranskription1 transloziert werden können und ist daher ein attraktives Ziel für die Entwicklung von Inhibitoren zur Modulation der NF-B-Aktivität.

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Charakterisierung der Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen NEMO und IKK, die auf NEMO für die Entwicklung kleiner Moleküle Inhibitoren der IKK-Komplexbildung abzielt. Die minimale Bindungsdomäne von NEMO, die zur Bindung von IKK benötigt wird, umfasst die Rückstände 44-111, und ihre Struktur wurde komplex mit einem Peptid bestimmt, das der IKK-Sequenz 701-7459entspricht. NEMO und IKK bilden ein Vier-Helix-Bundle, in dem der NEMO-Dimer die beiden Helices von IKK(701-745) in einer länglichen offenen Nut mit einer erweiterten Interaktionsschnittstelle unterbringt. Der ikK(734-742), auch bekannt als NEMO-Bindungsdomäne (NBD), definiert den wichtigsten Hot-Spot für die Bindung, an dem die beiden wesentlichen Tryptophans (739,741) tief in der NEMO-Tasche vergraben sind. Die Details der komplexen Struktur können bei der strukturbasierten Gestaltung und Optimierung von kleinen Molekülinhibitoren helfen, die auf NEMO abzielen. Gleichzeitig ist es schwierig, dass die Bindung eines kleinen Moleküls oder Peptids in NEMO die vollständige Konformationsänderung (d. h. die umfangreiche Öffnung des NEMO-Spulendimers) durch Bindung des langen IKK(701-745), wie im Kristall beobachtet, wieder aufbaut und die Struktur eines ungebundenen NEMO oder NEMO, der an einen kleinen Molekülinhibitor gebunden ist, ein besseres Ziel für die strukturbasierte Entwicklung und Optimierung darstellen kann.

NEMO- und kleinere Schnittkonstrukte in voller Länge, die die IKK-Bindungsdomäne umfassen, haben sich über Röntgenkristallographie und Kernspinresonanz (NMR)-Methoden10als unlösbar für die Strukturbestimmung in der ungebundenen Form erwiesen, was uns dazu veranlasste, eine verbesserte Version der IKK-Bindungsdomäne von NEMO zu entwerfen. Tatsächlich ist NEMO (44-111) in ungebundener Form nur teilweise gefaltet und durchläuft einen Konformationsaustausch, und deshalb haben wir uns vorgenommen, seine dimerische Struktur, die gewickelte Spulenfalte und die Stabilität zu stabilisieren und gleichzeitig die Bindungsaffinität für IKK zu erhalten. Durch das Anhängen von drei Heptads mit idealen dimeren Coil-Spulensequenzen11 an der N- und C-Termini des Proteins und einer Reihe von Vierpunktmutationen erzeugten wir NEMO-EEAA, ein Konstrukt, das vollständig dimer und in einer gewickelten Spule gefaltet wurde und die IKK-Bindungsaffinität zum Nanomolar-Bereich rettete, wie bei NEMO12in voller Länge beobachtet. Als zusätzlichen Vorteil hofften wir, dass die Coiled-Coil-Adapter (basierend auf der GCN4-Sequenz) die Kristallisation erleichtern und schließlich bei der Bestimmung der Röntgenstruktur durch molekularen Ersatz helfen würden. Coiled-Coil-Adapter wurden in ähnlicher Weise verwendet, um sowohl die Stabilität zu erhöhen, das Lösungsverhalten zu verbessern und die Kristallisation für trimergewickelte Coils und Antikörperfragmente zu erleichtern13,14. NEMO-EEAA ist leicht exprimiert und gereinigt von Escherichia. coli-Zellen mit einem setakeablen Histidin-Tag, ist löslich, in einer stabilen dimeren gewickelten Spule gefaltet und leicht kristallisiert, mit Beugung bis 1,9 °C. Das Vorhandensein der geordneten Coiled-Coil-Regionen von GCN4 könnte zusätzlich dazu führen, dass die Daten aus Kristallen von NEMO-EEAA durch molekularen Ersatz unter Verwendung der bekannten Struktur von GCN415schrittweise abgespult werden.

Angesichts der Ergebnisse, die mit apo-NEMO-EEAA erzielt wurden, glauben wir, dass die hier beschriebenen Protokolle auch auf die Kristallisation von NEMO-EEAA in Gegenwart von kleinen Peptiden (wie dem NBD-Peptid) oder kleinen Molekülinhibitoren angewendet werden könnten, mit dem Ziel, die Anforderungen an die NEMO-Hemmung und die strukturbasierte Optimierung von anfänglichen Bleiinhibitoren auf eine hohe Affinität zu verstehen. Angesichts der Plastizität und Dynamik vieler Coiled Coil-Domänen16könnte der Einsatz der Coiled-Coil-Adapter eine allgemeinere Anwendbarkeit bei der Unterstützung der Strukturbestimmung finden.

Protokoll

1. Konstruktion des Konstrukts für die Kristallographie

  1. Klonen Sie die Sequenz von NEMO-EEAA wie in der vorherigen Publikation12 in einem Vektor für die Expression in E. coli mit dem T7-Promotor, einschließlich eines N-terminalen Hexa-Histidin-Tags und einer Protease-Spaltungsstelle.
    HINWEIS: In diesem Protokoll haben wir einen Vektor verwendet, der modifiziert wurde, um ein N-Terminal-Hexa-Histidin-Tag und eine Tobacco Etch Virus (TEV) Spaltungsstelle10einzuschließen. Dieser Vektor erleichtert die Spaltung des His-Tags zur Proteinkristallisation und hinterlässt nur die kurze Verlängerung von GSW-Rückständen vor Beginn der gewünschten Proteinsequenz. Der Vektor, von dem dies abgeleitet wurde, und alternative Vektoren sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt. In diesem Protokoll wurden nachfolgende Änderungen an der ursprünglichen NEMO(44-111)-Sequenz schrittweise eingeführt, wie zuvor10beschrieben, mit seitlichgerichteter Mutagenese. Wir haben zunächst versucht, den NEMO Coiled-Coil Dimer zu stabilisieren, der die idealen Coiled-Coil-Adapter (in einer Länge von mindestens drei Heptads) an das N-Klemmen- oder C-Klemmenende oder an beides anh. Die doppelgewickelte Spule war die vielversprechendste aus früheren Kristallisationsversuchen und wurde anschließend modifiziert, indem mutationen eingeführt wurden, um die Kristallisation zu verbessern, wie zuvorbeschrieben 12.

2. Großformatige Auspräginege seiner6 mit NEMO-EEAA versehenen

  1. Transformieren Sie Konstrukt in BL21(DE3) kompetente Zellen. Bei -80 °C als Zellglycerinvorrat lagern.
  2. Tag 1 – Bereiten Sie eine Zellstarterkultur vor. In einem 125 ml Erlenmeyerkolben 20 ml Terrific Broth-Lösung und 20 l eines 100 mg/ml-Bestands an Ampicillin hinzufügen. Fügen Sie ein paar Mikroliter Zellglycerinbestand hinzu (von -80 °C Lagerung von BL21(DE3) kompetenten Zellen mit Vektor transformiert).
  3. Schütteln Sie die 10 ml Starterkultur über Nacht bei 37 °C, 220 Rpm (ca. 15 h).
  4. Tag 2 – Vom Starter auf einen OD600 = 0,1 in 250 ml Terrific Broth verdünnen. Fügen Sie Ampicillin zu einer Endkonzentration von 100 g/ml hinzu. Wachsen Sie zu einem OD600 = 0.8-1.0.
    1. Fügen Sie Isopropyl -D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu 500 m hinzu und wachsen Sie 4 h bei 37 °C.
    2. Maßnahme OD600 der induzierten Kultur nach 4 h. Kultur sollte eine OD600 = 6-10 erreichen.

3. Reinigung seiner6 mit NEMO-EEAA versehenen NEMO-EEAA

  1. Spin-Zellkultur bei 3.800 x g für 20 min bei 4 °C.
  2. Speichern Sie das Zellpellet und entsorgen Sie das Medium.
    HINWEIS: Das Zellpellet kann an dieser Stelle bei -20 °C gespeichert und zur späteren Reinigung gelagert werden.
  3. Die Zellen in 40 ml Lysepuffer mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 2 mM MgCl2,0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 2 mM Dithiothreitol (DTT) und 3 l Benzonase-Nuklease wieder aufsetzen.
    HINWEIS: Die verwendete Nickel-Immobilisierte Metall-Ionen-Affinitätschromatographie (IMAC) ist mit 2 mM DTT kompatibel. Alternativ können 0,2 mM Tris(2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP) verwendet werden.
  4. Teilen Sie resuspendierte Zellen in zwei 20-25 ml Aliquots auf.
  5. Lyse die Zellen mit französischer Presse (ungefährdruck 25.000 psi), wiederholung2-3 mal für jedes Aliquot (im Kalten Raum).
    HINWEIS: Alternativ können Zellen durch Beschallung lysiert werden (nicht in diesem Protokoll getestet).
  6. Harnstoff zu einer Endkonzentration von 8 M hinzufügen, auf einer Schaukelplattform für mindestens 2 h oder bis über Nacht brüten lassen. Diese und alle folgenden Reinigungsschritte, mit Ausnahme der Dialyse, können bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
  7. Tag 3 – Übertragen Sie das Lysat auf Ultrazentrifugenrohre und das Gleichgewichtsgewicht, wodurch sichergestellt wird, dass Lysat-Füllungen die Rohre mindestens 3/4 voll sind. Drehen Sie das Lysat bei 125.000 x g für 45 min bei 25 °C. Dekantieren Sie den Überstand in einen 100 ml Becher zum Laden auf die Säule.
    HINWEIS: Zentrifugieren bei 4 °C führt dazu, dass Harnstoff abstürzt.
  8. Bei einem schnellen Flüssigchromatographiesystem Ethanol aus der IMAC 5 ml-Säulemit 25 ml Reinst-H2 O bei 5 ml/min entfernen, gefolgt von 25 ml Elutionspuffer mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM Imidazol, 2 mM DTT, pH 8,0, dann 25 ml Bindungspuffer mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 2 mM DTT, 8 M Harnstoff, pH 8,0.
  9. Inkubationsstand mit 3 ml/min auf die IMAC-Säule geladen und den Durchfluss gesammelt. Waschen Sie die Spalte für 10 Spaltenvolumes mit Bindungspuffer bei 3 ml/min.
  10. NEMO-EEAA-Konstrukt auf Säule durch Waschen von Säule mit Umfaltungspuffer für 20 Säulenvolumen bei 3 ml/min, mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 2 mM DTT, pH 8,0.
  11. Durchführen der Gradientenelution von NEMO-EEAA, von 10 bis 500 mM Imidazol über einen 12-säulenigen Volumengradienten, bei dem alle Eluate in Bruchsammelplatte (1 ml Fraktionen) gesammelt werden.
  12. Fortsetzung der Elution bei 500 mM Imidazol für zwei Säulenvolumina, weiter zu sammeln.
  13. Führen Sie Natriumdodecylsulfat (SDS)- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) von Fraktionen aus, um die NEMO-EEAA-Präsenz in Elutionsfraktionen zu bestimmen.
    HINWEIS: Wir haben 10% Acrylamid, MES-Puffer verwendet.
  14. Poolfraktionen, die reines Zielprotein enthalten.
  15. Messen Sie die Proteinkonzentration durch Bradford Assay17.
    HINWEIS: Dies ist notwendig, um die Menge an Protease für Tag-Spaltung zu schätzen.

4. Seine6 Tag Spaltung und Reinigung

  1. Fügen Sie TEV in einem Gewichtsverhältnis von 1:10 von TEV:NEMO-EEAA Protein hinzu, um das His6-Tag zu spalten. Die TEV-Protease wurde im Haus gereinigt.
    HINWEIS: Optimieren Sie die Menge an TEV, Zeit und Temperatur, die für die vollständige Spaltung separat erforderlich ist.
    1. Express TEV Protease, S219V mutiert18 in BL21(DE3)-RIL Zellen und reinigen wie zuvor beschrieben19. Wachsen Sie die Zellen, wie in Schritt 2 beschrieben, lyse von der französischen Presse und reinigen Sie mit einer IMAC-Säule. Endprotein in 25 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 20% v/v Glycerin lagern.
  2. Dialysieren Sie die Probe über Nacht (ca. 15 h) in 4 L von 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0, um Spaltung zu ermöglichen und überschüssiges Imidazol aus der Probe für die anschließende Reinigung zu entfernen.
  3. Tag 4 – Entfernen Sie die Probe aus der Dialyse. Führen Sie ein SDS-PAGE-Gel der Probe aus TEV-Spaltung aus, um sicherzustellen, dass die Spaltung abgeschlossen ist.
  4. Bei einem schnellen Flüssigchromatographiesystem Ethanol aus einer IMAC 5 ml-Säule mit 25 ml reinemH2O bei 5 ml/min entfernen, gefolgt von 25 ml Elutionspuffer mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM Imidazol, 2 mM DTT, pH 8,0, dann Bindungspuffer mit 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 2 mM DTT, pH 8,0.
  5. Laden Sie die Säule bei 1 ml/min mit TEV-spaltendem NEMO-EEAA. Cleaved NEMO-EEAA wird im Durchfluss elute: sammeln in einem 96 Brunnen Fraktion Sammelplatte (1 ml Fraktionen). Waschen Sie die Säule für fünf Säulenvolumen von 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM Imidazol bei 1 ml/min, weiter in Bruchsammelplatte zu sammeln.
  6. Elute TEV und uncleaved Seine6-NEMO-EEAA mit drei Säulenvolumen von 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM Imidazol, 2 mM DTT, pH 8.0, Sammeln elution in einem 50 mL Kolben.
  7. Führen Sie das SDS-PAGE-Gel von Durchflussfraktionen aus, um das Vorhandensein von gespalteten NEMO-EEAA zu bestimmen.
  8. Durchflussfraktionen, die geballte NEMO-EEAA enthalten, mit einem Rührzellenkonzentrator auf 5 ml konzentrieren. Membran-Molekulargewichts-Cut-off (MWCO) = 3 kDa.
  9. Mit einer 3 kDa MWCO Membran, Dialyse konzentrierte Probe in 2 L von 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0 für 2 h. Ändern Sie den Dialysepuffer auf 2 L frischen Dialysepuffer für die Nachtdialyse (ca. 15 h), bei 4 °C.
  10. Tag 5 – 5 ml der Dialysed-Probe auf eine Größenausschlusschromatographie (SEC) 16 mm x 60 cm Säule (34 m durchschnittliche Partikelgröße) bei 1 ml/min in 2 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0. Wiederholen Sie dies mit zusätzlichen Spalten, je nach Beispielvolumen.
  11. Bündeln Sie die Fraktionen, die der dimerischen NEMO-EEAA entsprechen.
    HINWEIS: NEMO-EEAA eluiert zwischen 60-65 ml, was einem größeren Molekulargewichtsprotein entspricht, aufgrund der länglichen Natur der dimeren gewickelten Spule.
  12. Konzentrat mit einem Rührzellenkonzentrator und einer MWCO = 3 kDa Membran auf eine Endkonzentration von 113 m (1,65 mg/ml).
  13. Aliquot das Protein und speichern Sie bei 4 °C (stabil für über 1 Monat).

5. Sparse-Matrix-Screening

HINWEIS: Das Protokoll führt Kristallisationsversuche mit handelsüblichen Bildschirmen durch und richtet Sitztropfenexperimente mit einem Kristallisationsroboter ein. Kristallbilder werden automatisch von einem Imager gesammelt.

  1. Mit handelsüblichen spärlichen Matrix-Bildschirmen (siehe Materialtabelle), Pipette 60 l spärliche Matrixlösung in jede der 96 Brunnen einer 2 Tropfenkammerkristallisationsplatte für sitztropfendampfdiffusion (Reservoirlösung).
  2. Mit einem Roboter-Tropfensetter 100 nL Proteinlösung bei 1,65 mg/ml im Verhältnis 1:1 mit Reservoirlösung in Tropfen 1 für ein Endvolumen von 200 nL abgeben; dann 66 nL Proteinlösung mit 134 nL Reservoirlösung für ein Endvolumen von 200 nL in Tropfen 2 (1:2 Verhältnis).
  3. Versiegeln Sie die Platte mit 3 Zoll breitem Dichtband sofort nach dem Dosieren.
    HINWEIS: Tropfen trocknen aus, wenn sie länger als 2-3 min der Atmosphäre ausgesetzt sind.
  4. Bewahren Sie die Schalen im Crystallization Imager-Speicher bei 20 °C auf und überprüfen Sie die automatisch gesammelten Bilder ab zwei Tagen auf Kristallpräsenz.
    HINWEIS: Das Kristallisationsscreening wurde parallel zur Konstruktoptimierung durchgeführt. Ausgangskristalle, die unter folgenden Bedingungen gebildet werden (kommerzielle Siebe, die in der Materialtabelleaufgeführt sind): a) 0,1 M Tris, pH 8,0, 30 % v/v Polyethylenglykol (PEG) MME 550, 5 % Poly-Glutaminsäure, 200-400 kDa Niedermolekularpolymer (PGA -LM); b) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG MME 2k, 5% PGA-LM; c) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG 3350, 5% PGA-LM. Sparse Matrix Siebkristalle haben schlechte Gittergleichmäßigkeit; daher werden sie mit kreuzpolarisierter Bildgebung schlecht aussehen. Verwenden Sie UV-Bildgebung, um sicherzustellen, dass die Kristalle Protein enthalten. Der folgende Schritt zur Samenstammgenerierung ist notwendig, um die endgültige Beugungsqualität kristallisiert zu erhalten.

6. Saatgut-Bestandsgenerierung

HINWEIS: Wir erhalten reproduzierbar Kristalle für die Samenerzeugung in 0,1 M Tris pH 8,0, 5% PGA-LM, 3,6% w/v PEG 20k. Kristalle weisen jedoch eine hohe Mosaikität auf und sind in diesem Stadium für die Datenerfassung ungeeignet.

  1. Mit einem Kit für die Saatguterzeugung bereiten Sie den Samenbestand vor, indem Sie den gesamten Tropfen mit Kristall präsentieren, und legen Sie in 50 l Kristallisationsbedingungslösung in die mitgelieferte Durchstechflasche.
  2. Wirbel nieren Sie den Samenvorrat für 3 min, pulsierend 20 s auf und 10 s aus.
  3. Der Saatgutbestand wird in 1:10-Schritten seriell auf 1:10.000 erhöht. Alle Verdünnungen bei 4 °C lagern, für die weitere Verwendung.

7. Feine Bildschirme

  1. Entwerfen Sie feine Bildschirme, die die Bedingungen für Tris, PGA-LM und PEG variieren. Vary PEG Länge für einzelne Schalen.
    ANMERKUNG: Der feinfeine Bildschirm, der den Kristall erzeugte, der für die Strukturbestimmung von NEMO-EEAA verwendet wurde, verwendete die folgenden Bedingungen: 0,1 M Tris pH 8; PGA-LM variierte von 8 bis 0% in den Spalten 1-12. Die Zeilen A-H zeigten verschiedene PEGs, wobei die Konzentrationen in den Spalten 1-12 wie folgt variierten. A: PEG 200 (0-40% v/v); B: PEG 400 (0-40% v/v); C: PEG MME 500 (0-40% v/v); D: PEG 1000 (0-30% w/v); E: PEG 3350 (0-30% w/v); F: PEG 6k (0-30% w/v); G: PEG 10k (0-20% w/v); H: PEG 20k (0-20% w/v). Der Kristall erschien gut H4 (5.45% w/v PEG 20k, 5.8% w/v PGA-LM). In diesem Protokoll wurde ein Proteinkristallographie-Sieb-Flüssigkeitshandler verwendet, um die Bildschirme zu bauen.
  2. Samen sie einen Proteinbestand in einem Volumenverhältnis von 1:25 von 1:1.000 Samenverdünnung.
    HINWEIS: Die Konzentration von NEMO-EEAA wird leicht sinken, aber Kristalle werden sich immer noch bilden.
  3. Wiederholen Sie Schritt 2 mit 1:10.000 Samenverdünnung, gleiches 1:25 Volumenverhältnis.
  4. Mit dem Tropfensetter 100 nL Proteinlösung bei 1,65 mg/ml, mit 1:1.000 Verdünnung des Saatgutbestands in ein 1:1-Verhältnis mit Reservoirlösung in Tropfen 1 für ein Endvolumen von 200 nL geben. Wiederholen Sie dies für Tropfen 2, jedoch mit 1:10.000 Verdünnung des Saatgutbestands vorhanden.
  5. Versiegeln Sie die Platte mit 3 Zoll breitem Dichtband sofort nach dem Dosieren.
    HINWEIS: Tropfen trocknen aus, wenn sie länger als 2-3 min der Atmosphäre ausgesetzt sind.
  6. Bewahren Sie die Schalen im Imager-Speicher bei 20 °C auf und überprüfen Sie die nach zwei Tagen gesammelten Bilder auf Kristallpräsenz.
  7. Überprüfen Sie die Kristalle mit dem Cross-Polarizer-Imager auf Gittergleichmäßigkeit, um für einzelne Bedingungen zu wählen, um folgende Schalen einzurichten.

8. Erzeugung von Kristallen zur Datenerfassung

  1. Entwerfen Sie Einzelbedingungsbildschirme um Tris, PGA-LM und PEG Zustand, die einheitliche Kristalle produzierten, die durch kreuzpolarisierte Bilder analysiert wurden, und die größtmöglichen Kristalle.
    HINWEIS: Kristalle aus diesen Bedingungen sind unregelmäßig in der Form, meist rechteckige dünne Blätter. Es ist der Schlüssel, um einen Zustand zu wählen, in dem die Kanten des Kristalls gut definiert sind und die größtmögliche Dicke haben.
  2. Machen Sie 20 ml Kristallisationszustand von Hand.
  3. Mit einem Mehrkanal-Pipettor, geben Sie 60 l pro Brunnen in einer 2 Tropfenkammer, 96 gut Kristallisationsplatte für Sitzen Drop Dampf Diffusion.
  4. Bereiten Sie den Samenbestand wie in Schritt 6.2 beschrieben vor.
  5. Geben Sie das Protein wie in Schritt 6.3 beschrieben.
  6. Versiegeln Sie die Platte mit 3 Zoll breitem Dichtband sofort nach dem Dosieren.
    HINWEIS: Tropfen trocknen aus, wenn sie länger als 2-3 min der Atmosphäre ausgesetzt sind.
  7. Bewahren Sie die Schalen bei 20 °C im Imager auf und überprüfen Sie die Bilder täglich auf Kristallpräsenz.
  8. Überprüfen Sie kreuzpolarisierte Bilder der Kristalle auf Gittergleichmäßigkeit, um Kristalle für die Datenerfassung auszuwählen.

9. Bestimmung des Kryoschutzmittels

  1. Um die Kryoschutzmittel zu testen, erstellen Sie Lagerlösungen, die den Kristallisationsbedingungen entsprechen, aber 30 %, 20 %, 10 % und eine um 5 % höhere Konzentration jeder Komponente enthalten. Die Zugabe des kryoschützenden Volumens führt zu einer endgültigen Konzentration von Komponenten, die den Kristallisationsbedingungen entspricht.
    HINWEIS: Beginnen Sie zum Testen eines Kryoschutzmittels mit einer Volumenkonzentration von 30 % für eine Kristallisationsbedingung von 0,1 M Tris mit einer Lagerlösung von 0,143 M Tris, bevor Sie das Kryoschutzmittel hinzufügen.
  2. Erstellen Sie aus einem Kryo-Reagenzien-Kit 10 L Probe für den Kryo-Schutz-Test, indem Sie 30 Volumenprozent Kryozustand in 70% kristallisationsbedingter Lagerlösung mischen, für eine Endkonzentration von 30% Kryoschutzmittel unter ursprünglichen Kristallisationsbedingungen. Mischen Sie gründlich.
    1. Mit einer 10-L-Pipette nehmen Sie 5 l der testkryogeschützten Lösung und tauchen Sie die Pipettenspitze in flüssigen Stickstoff. Wenn Eis beobachtet wird, entsorgen.
    2. Testen Sie alle Kryoschutzmittel mit 30%. Für die erfolgreichen Lösungen, wiederholen Sie den Prozess bei 20%, dann 10% und 5% des Kryo-Schützen.
    3. Unter Verwendung der erfolgreichen Kryoschutzlösung mit dem geringsten Anteil an Kryoschutz, fügen Sie 0,5 l Lösung in einen Testtropfen mit vorhandenen Kristallen hinzu. Beobachten Sie unter dem Mikroskop, Timing, wie lange Kristall in der Bedingung dauert, wenn nicht unbestimmt.
      HINWEIS: Diese Kristalle sind nur zum Testen und werden verworfen. Für NEMO-EEAA ist 12% 1,2-Propandiol die optimale Kryo-Schutzlösung. 12% sind für die Verdünnung der kryoschützenden Lösung, wenn sie dem Kristalltropfen von ca. 100 nL zugesetzt wird, für eine ungefähre Endkonzentration von 1,2-Propanediol von 10%.

10. Kristallschleifen

  1. Loop-Kristallen 1-2 Tage vor dem Versand an Synchrotron.
    HINWEIS: Kristalle haben einen Durchmesser von ca. 60-100 m: 0,05 – 0,10 mm Schlaufen sind ideal für Loopings.
  2. Schneiden Sie das Band von der Oberseite des Brunnens.
  3. Fügen Sie 0,5 l Kristallisationslösung mit 12% 1,2-Propandiol-Kryo-Schutzmittel direkt in den Brunnen.
    ANMERKUNG: Die Endkonzentration von 1,2-Propandiol liegt jetzt bei etwa 10%, aufgrund einer Verdünnung um 100 nL Tropfenlösung (ungefähre Tropfenvolumenreduktion von ursprünglich 200 nL, bedingt durch Dampfdiffusion).
  4. Schleifen Sie den Kristall aus dem Brunnen.
    HINWEIS: Kristalle wachsen oft auf der Unterseite des Brunnens, werden sich aber mit einem sanften Nudge aus der Schleife lösen. Einmal aufgelöst, Schleife.
  5. Bewahren Sie den Kristall mit Kryoschleifen in Inden, die in Flüssigkeit N2eingetaucht sind, auf.
  6. Bewahren Sie diese Pucks in flüssigem N2 in Dewar-Flasche auf, bis sie für die Röntgenbeugung am Synchrotron versandfertig sind.

11. Datenerhebung

  1. Sammeln Sie Röntgenbeugungsdaten. Verwenden Sie in diesem Protokoll AMX beamline (ID: 17-ID-1), National Synchrotron Light Source II.
    HINWEIS: Die Daten wurden vor Ort gesammelt, können aber aus der Ferne gesammelt werden. Sammeln Sie Daten im Bereich des Kristalls, die Die vergitterte Gleichmäßigkeit in kreuzpolarisierten Bildern zeigten. Positionieren Sie die Kristalle in der Schleife so, dass die Datenerfassung keine "armen" Bereiche des Kristalls umfasst, während sich der Kristall im Goniometer dreht. Daten, die die beste Auflösung lieferten, stammten aus der Sammlung am Rande einer Erweiterung eines Kristalls mit einer Größe von etwa 5 x 5 m. Verwenden Sie Rastering, um die besten Bereiche auf dem Kristall zu identifizieren, um20zu sammeln.

12. Röntgendatenverarbeitung

  1. Verarbeiten Sie das Dataset mit dem XDS IDXREF-Programm auf die höchste Auflösung, die mit dem XDS IDXREF-Programm gesammelt wurde, um Raumgruppe, Einheitszelle und Lösungsmittelgehalt zu bestimmen.
  2. Integrieren Sie Daten mit dem XDS INTEGRATE-Programm.
  3. Prozessskalierte Intensitäten aus dem XDS XSCALE-Programm mit STARANISO Server, mit i/i-Cutoff-Mittel wert 1,2 für die Beugungsbegrenzungsoberfläche für die Daten.
    HINWEIS: Daten werden nicht in echtes Ellipsoid geschnitten. Bewahren Sie alle Daten über dem I/I von 1,2 Cutoff auf. Die Statistiken über die Daten, die für die sphärische Vollständigkeit berechnet werden, sind aufgrund der nicht-sphärischen Kürzung schlecht. Die elliptische Vollständigkeit betrug 88 % mit den höchsten Auflösungen von: 1,88 % , 2,10 % und 2,55 % entlang der A*-, b*- und c-Achse.

13. Strukturlösung

  1. Nutzen Sie die Röntgenstruktur von GCN4 (PDB: 4DMD)15 als Suchmodell für molekularen Ersatz mit MRage21 in PHENIX22. Die 4DMD-Struktur wurde in MRage als "Ensemble" definiert, und die MRage-Lösung baute erfolgreich den Strukturteil entsprechend dem N-Klemmen-Spulenadapter von NEMO-EEAA, homologe zum Suchmodell, für beide Ketten im Dimer.
    HINWEIS: Deaktivieren Sie die Anisotropiekorrektur in PHASER, oder die Daten werden weiter zurückskaliert.
  2. Nutzen Sie aufeinanderfolgende Runden von Autobuild23 in PHENIX und manuelles Bauen (mit 2Fo-Fc und Fo-Fc Karten, in Coot24), um den Rest der Struktur zu bauen.
  3. Erstellen Sie die noch fehlenden Rückstände manuell in das Modell basierend auf 2Fo-Fc und Fo-Fc Karten mit Coot24.
    HINWEIS: In der letzten Phase wurden die 4 N-Klemmenrückstände und 4 C-Klemmenrückstände für jedes Monomer gebaut. Die Sidechain-Platzierung wurde bei Bedarf ebenfalls manuell angepasst.
  4. Berechnen Sie eine zusammengesetzte Weglassen-Karte mit PHENIX und eine 10% Auslassung der Struktur.

14. Strukturverfeinerung

  1. Verfeinern Sie die Strukturen mit PHENIX Verfeinern. Führen Sie die anfänglichen Verfeinerungen gegen Massenlösungsmittel- und Stereochemiegewichte aus, wodurch die RMSbond- und RMSangle-Einschränkungen auf 0,01 bzw. 1,0 gelockert werden. Fahren Sie mit der Verfeinerung einzelner B-Faktoren, TLS-Parameter und Okupaszen fort.

Ergebnisse

Klonen, Ausdruck und Reinigung der IKK-bindungsdomäne von NEMO.
Das Protokoll, das in dieser Studie folgte, um die endgültige Sequenz von NEMO-EEAA (Abbildung 1A) zu erhalten, die Beugungsqualitätskristalle erzeugte, beinhaltete die Expression und Charakterisierung aller Zwischenkonstrukte, einschließlich der Zugabe der Spulenadapter bei N- und C-Terminus, der Mutationen C76A, C95S und der Mutationen E56A, E57A. Abbildung 1

Diskussion

Kristallisationsversuche von NEMO in ungebundener Form waren erfolglos, einschließlich Versuchen, das proteinvolle Protein in voller Länge und mehrere Abschneidekonstrukte zu verwenden, die die IKK-Bindungsdomäne umfassen. Unsere biophysikalische Charakterisierung der IKK-bindungsdomäne von NEMO (Rückstände 44-111) durch kreisförmigen Dichroismus, NMR-Spektroskopie und Fluoreszenz-Anisotropie zeigte, dass das Konstrukt, wenn auch in der Lage, IKK zu binden, in einem Zustand des Konformationsaustauschs existierte, ...

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Wir danken Prof. D. Madden für viele hilfreiche Diskussionen während dieses Projekts. Wir danken Prof. D. Bolon für die Gabe des Plasmids, das die optimierte GCN4-Spule enthält. Wir danken Dr. B. Guo für NEMO-Plasmide. Wir danken Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili und Amy E. Kennedy für die Demonstration des Verfahrens. Wir danken der BioMT Crystallography Core Facility und den Abteilungen für Chemie und Biochemie & Zellbiologie in Dartmouth für den Einsatz der Kristallographiegeräte und des BioMT-Personals für ihre Unterstützung. Diese Forschung verwendete die AMX-Beamline des National Synchrotron Light Source II, einer VomO-Abteilung für Energie (DOE) des US-Amerikanischen Energieministeriums (DOE), die für das DOE Office of Science vom Brookhaven National Laboratory unter Vertrag Nr. DE-SC0012704. Wir danken den Mitarbeitern von NSLS II für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch die NIH-Stipendien R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 und P20GM113132 sowie ein Munck-Pfefferkorn Roman- und Interaktives Stipendium finanziert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM)Molecular DimensionsMD2-100-150For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO Dialysis MembraneSpectra/Por132724For dialysis removal of imidazole
Amicon Stirred CellMillipose SigmaUFSC 05001For protein concentration
Ammonium ChlorideMillipore SigmaG8270For minimal media labeling
Benzonase NucleaseMillipore Sigma9025-65-4For digestion of nucleic acid
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent CellsAgilent TechnologiesModel: 230245TEV expression
CryoProHampton ResearchHR2-073Cryo-protectants kit
D-Glucose (Dextrose)Millipore SigmaA9434For minimal media labeling
Difco Terrific BrothThermoFisherDF043817For culture growth
Dithiothreitol > 99%GoldbioDTT25For reduction of disulfides
E. coli: Rosetta 2 (DE3)Novagen71400-3Expression of unlabeled NEMO-EEAA
FORMULATORFormulatrixLiquid handler/ screen builder
HCl – 1.0 M SolutionHampton ResearchHR2-581For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pgGE Healthcare28989333For size exclusion purification
HisTrap HP 5 mL columnGE Healthcare17524802For purification of His-tagged NEMO-EEAA
HT 96 MIDASMolecular DimensionsMD1-59For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
HT 96 MorpheousMolecular DimensionsMD1-46For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
ImidazoleThermoFisher288-32-4For elution from His-trap column
Isopropyl-beta-D-thiogalactosideGoldbioI2481C5For induction of cultures
MRC2 crystallization plateHampton ResearchHR3-083Crystallization plate
NT8 - Drop SetterFormulatrixCrystallization
pET-16bMillipore Sigma69662For cloning of NEMO-EEAA
pET-45bMillipore Sigma71327For cloning of NEMO-EEAA
Phenylmethylsulfonyl fluorideThermoFisher36978For inhibition of proteases
Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 TiBeckmann Coulter339160Ultracentrifuge bottle
Polyethylene Glycol 20,000Hampton ResearchHR2-609For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
pRK793 (TEV)AddgenePlasmid 8827For TEV production
QuikChange XL IIAgilent Technologies200522Site directed mutagenesis
Required Cap Assembly:Beckmann Coulter355623Ultracenttrifuge bottle cap
ROCK IMAGERFormulatrixCrystallization Imager
Seed Bead KitHampton ResearchHR2-320Seed generation
Sodium Chloride ≥ 99%Millipore SigmaS9888For buffering of purification solutions
TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)GoldbioTCEP1Reducing agent
The Berkeley ScreenRigakuMD15-BerekelyFor sparse matrix screening of NEMO-EEAA
The PGA ScreenMolecular DimensionsMD1-50For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Tris – 1.0 M SolutionHampton ResearchHR2-589For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (powder format)Thermofisher15504020For buffering of purification solutions
UreaThermoFisher29700For denaturation of NEMO-EEAA

Referenzen

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