Produzione, cristallizzazione e determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO

Riepilogo

Descriviamo protocolli per la determinazione della struttura del dominio iKK-binding di NEMO dalla cristallografia a raggi X. I metodi includono l'espressione proteica, la purificazione e la caratterizzazione, nonché strategie per il successo dell'ottimizzazione dei cristalli e la determinazione della struttura della proteina nella sua forma non associata.

Abstract

NeMO è una proteina di impalcatura che svolge un ruolo essenziale nel percorso NF-B assemblando il complesso IKK con le chinasi IKK e IKK. Al momento dell'attivazione, il complesso ifosofolaIKK le molecole IB che portano alla traslocazione nucleare NF-B e all'attivazione dei geni bersaglio. L'inibizione dell'interazione NEMO/IKK è un paradigma terapeutico interessante per la modulazione dell'attività del percorso NF-B, rendendo NEMO un bersaglio per la progettazione e la scoperta degli inibitori. Per facilitare il processo di scoperta e ottimizzazione degli inibitori NEMO, abbiamo progettato un costrutto migliorato del dominio di NEMO che lega IKK di NEMO che consentirebbe la determinazione della struttura della proteina nella forma apoe e mentre è legato a piccoli inibitori del peso molecolare. Qui, presentiamo la strategia utilizzata per la progettazione, l'espressione e la caratterizzazione strutturale del dominio iKK-binding di NEMO. La proteina è espressa in cellule di E. coli, solubilificate in condizioni di detonazione e purificate attraverso tre passaggi cromatografici. Discutiamo i protocolli per ottenere cristalli per la determinazione della struttura e descriviamo le strategie di acquisizione e analisi dei dati. I protocolli troveranno ampia applicabilità alla determinazione della struttura di complessi di NEMO e piccoli inibitori di molecole.

Introduzione

La via NF-B viene attivata in risposta a una varietà di stimoli, tra cui citochine, prodotti microbici e stress, per regolare l'espressione dei geni bersaglio responsabili della risposta infiammatoria e immunitaria, della morte o della sopravvivenza cellulare e della proliferazione¹. Le patologie, tra cui malattie infiammatorie e autoimmuni e cancro^2,3,4,5 sono state correlate all'iperattivazione del percorso, che ha reso la modulazione dell'attività nF-B un obiettivo primario per lo sviluppo di nuove terapie^6,7.

La via canonica NF-B, in particolare, si distingue dalla via non canonica, responsabile dell'antanalgenesi e dell'attivazione delle cellule B, dalla dipendenza del primo dalla proteina di scaffolding NEMO (NF-B^modulatoreessenziale 8 ) per l'assemblaggio del complesso IKK con le chinasi IKK e IKK. Il complesso di IKK è responsabile della fosforilazione dell'IB, che lo prende di mira per la degradazione, liberando i dimeri NF-B da traslocare nel nucleo per la trascrizione genica¹ ed è quindi un bersaglio attraente per lo sviluppo di inibitori per modulare l'attività NF-B.

La nostra ricerca si concentra sulla caratterizzazione dell'interazione proteina-proteina tra NEMO e IK, mirando a NEMO per lo sviluppo di piccoli inibitori molecolari della formazione complessa di IKK. Il dominio di legame minimo di NEMO, necessario per legare IKK, comprende i residui 44-111, e la sua struttura è stata determinata in complesso con un peptide corrispondente alla sequenza di IKK - 701-745⁹. NeMO e IKK formano un fascio di quattro elica in cui il dimero NEMO ospita le due eliche di IKK (701-745) in una scanalatura aperta allungata con un'interfaccia di interazione estesa. Il dominio legante NEMO (NBD), IKKà (734-742), definisce il punto caldo più importante per l'associazione, dove i due tritofori essenziali (739,741) seppelliscono profondamente all'interno della tasca NEMO. I dettagli della struttura complessa possono aiutare nella progettazione e nell'ottimizzazione basata sulla struttura degli inibitori delle piccole molecole mirati a NEMO. Allo stesso tempo, è difficile che il legame di una piccola molecola o peptide ricrei in NEMO l'intero cambiamento conformazionale (cioè, un'ampia apertura del dimero neMO a bobina) causato dal legame del lungo IKK (701-745), come osservato nel cristallo, e la struttura di NEMO o NEMO non legato a un inibitore della piccola molecola può rappresentare un migliore obiettivo per la progettazione e l'ottimizzazione dei farmaci basati sulla struttura.

I costrutti di troncamento a lunghezza intera NEMO e di troncamento più piccoli che comprendono il dominio di associazione IKK si sono dimostrati intrattabili per la determinazione della struttura in forma non integrata tramite la cristallografia a raggi X e i metodi di risonanza magnetica nucleare (NMR)¹⁰, il che ci ha spinto a progettare una versione migliorata del dominio di legame IKK di NEMO. Infatti, NEMO (44-111) nella forma non associata è solo parzialmente piegato e subisce uno scambio conformazionale e quindi abbiamo deciso di stabilizzare la sua struttura dimeica, piega e stabilità della bobina, pur conservando l'affinità vincolante per IKK. Aggiungendo tre eptadi di sequenze ideali dimericed coil¹¹ al n-e C-termini della proteina, e una serie di quattro mutazioni punti, abbiamo generato NEMO-EEAA, un costrutto completamente dimerico e piegato in una bobina a bobina, che ha salvato l'affinità IKK-legante alla gamma nanomolare come osservato per la lunghezza completa NEMO¹². Come ulteriore vantaggio, speravamo che gli adattatori a bobina (basati sulla sequenza GCN4) avrebbero facilitato la cristallizzazione e infine aiutato nella determinazione della struttura a raggi X attraverso la sostituzione molecolare. Adattatori a bobina sono stati utilizzati in modo simile sia per aumentare la stabilità, migliorare il comportamento della soluzione e facilitare la cristallizzazione per bobine a bobina trimeree e frammenti di anticorpi^13,14. NeMO-EEAA è facilmente esprimente e purificato dalle cellule di Escherichia. coli con un'etichetta histidina sfilsiabile, è solubile, piegato in una bobina a bobina dimeric stabile ed è facilmente cristallizzato, con diffrazione a 1,9 . La presenza delle regioni ordinate a bobina di GCN4 potrebbe inoltre aiutare a far rientrare i dati provenienti dai cristalli di NEMO-EEAA mediante sostituzione molecolare utilizzando la struttura nota di GCN4¹⁵.

Dati i risultati ottenuti con apo-NEMO-EEAA, crediamo che i protocolli qui descritti potrebbero essere applicati anche alla cristallizzazione del NEMO-EEAA in presenza di piccoli peptidi (come il peptide NBD) o di inibitori di piccole molecole, con l'obiettivo di comprendere i requisiti per l'inibizione NEMO e l'ottimizzazione basata sulla struttura degli inibitori iniziali del piombo ad alta affinità. Data la plasticità e la natura dinamica di molti domini a bobina¹⁶, l'uso degli adattatori a bobina-coil potrebbe trovare un'applicabilità più generale nell'aiutare la determinazione strutturale.

Protocollo

1. Progettazione del costrutto per la cristallografia

1. Clonare la sequenza di NEMO-EEAA come nella precedente pubblicazione¹² in un vettore per l'espressione in E. coli utilizzando il promotore T7, tra cui un tag esa-issidina N-terminale e un sito di cleavazione proteasi.
   NOTA: In questo protocollo, abbiamo usato un vettore modificato per includere un tag esa-istidina A N-terminale e un sito di scissione Tobacco Etch Virus (TEV)¹⁰. Questo vettore facilita la scissione del suo tag per la cristallizzazione delle proteine e lascia solo la breve estensione dei residui di GSW prima dell'inizio della sequenza proteica desiderata. Il vettore da cui è stato derivato e i vettori alternativi sono elencati nella tabella dei materiali. In questo protocollo, le successive modifiche alla sequenza originale NEMO(44-111) sono state introdotte passo dopo passo, come descritto in precedenza¹⁰, utilizzando la mutagenesi laterale diretta. Inizialmente abbiamo tentato di stabilizzare il dimero NEMO a bobina che aggiunge gli adattatori a bobina (in una lunghezza di almeno tre heptads) all'estremità N-terminal o C-terminalo o a entrambi. La doppia bobina a bobina è stata la più promettente da precedenti prove di cristallizzazione ed è stata successivamente modificata introducendo mutazioni per migliorare la cristallizzazione come descritto in precedenza¹².

2. Espressione su larga scala del suo₆ etichettato NEMO-EEAA

1. Trasforma costrutto in celle competenti BL21(DE3). Conservare a -80 gradi centigradi come brodo di glicerolo cellulare.
2. Giorno 1 – Preparare una coltura di avviamento cellulare. In una fiaschetta Erlenmeyer da 125 mL, aggiungere 20 mL di soluzione Terrific Broth e 20 -L di uno stock di 100 mg/mL di Ampicillin. Aggiungere alcuni microlitri di scorta di glicerolo cellulare (da -80 gradi centigradi di celle competenti BL21(DE3) trasformate con vettore).
3. Agitare la coltura di avviamento da 10 mL per tutta la notte a 37 gradi centigradi, 220 giri/m (circa 15 h).
4. Giorno 2 – Dall'antipasto, diluire a un OD₆₀₀ x 0,1 in 250 mL di Terrific Broth. Aggiungete l'ampicillina ad una concentrazione finale di 100 g/mL. Crescere fino a un OD₆₀₀ - 0,8-1,0.
   1. Aggiungete l'isopropile a 500 M e fate crescere per 4 h a 37 gradi centigradi.
   2. Misurare OD₆₀₀ di coltura indotta dopo 4 h. La coltura dovrebbe raggiungere un OD₆₀₀ - 6-10.

3. Purificazione dei suoi₆ etichettati NEMO-EEAA

1. Ruotare la coltura cellulare verso il basso a 3.800 x g per 20 min a 4 gradi centigradi.
2. Salvare il pellet cellulare e scartare il mezzo.
   NOTA: Il pellet cellulare può essere salvato e conservato a -20 gradi centigradi a questo punto, per la purificazione in un secondo momento.
3. Risospendere le cellule in 40 mL di buffer di lisi contenente 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM MgCl₂, 0,5 mth phenylmethylsulfonyl fluoruro, 2 mM Dithiothreitol (DTT) e 3 -L di Benzonase Nuclease.
   NOTA: la cromatografia di affinità iostico iomaciolato (IMAC) iografica immobilizzata Nickel è compatibile con 2 mM DTT. In alternativa, è possibile utilizzare 0,2 mM tris(2 carboxyethyl)phosphine (TCEP).
4. Dividere le celle risospese in due 20-25 mL.
5. Lyse le cellule utilizzando la stampa francese (pressione approssimativa 25.000 psi), ripetendo 2-3 volte per ciascuno (nella stanza fredda).
   NOTA: In alternativa, le cellule potrebbero essere lised dalla sonicazione (non testate in questo protocollo).
6. Aggiungere urea al lisa e la cellula ad una concentrazione finale di 8 M, consentire di incubare su una piattaforma a dondolo per un minimo di 2 h o fino a una notte. Questo e tutti i seguenti passaggi di purificazione, ad eccezione della dialisi, possono essere eseguiti a temperatura ambiente.
7. Giorno 3 – Trasferire il lisato ai tubi di ultracentrifuga e il peso dell'equilibrio, garantendo il lisato riempie i tubi ad almeno 3/4 pieno. Girare il lisato a 125.000 x g per 45 min a 25 gradi centigradi. Decant il supernatante in un becher da 100 mL per il caricamento su colonna.
   NOTA: Centrifugatura a 4 gradi centigradi causerà l'arresto anomalo dell'urea.
8. In un sistema di cromatografia liquida veloce, rimuovere l'etanolo dalla colonna IMAC 5 mL con 25 mL di ultrapure H₂O a 5 mL/min, seguito da 25 mL di buffer di eluizione contenente 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0, quindi 25 mL di buffer di rilegatura contenente 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM DTT, 8 M.
9. Caricare l'urea incubato supernatante a 3 mL/min sulla colonna IMAC, raccogliendo il flusso attraverso. Lavare la colonna per 10 volumi di colonne con buffer di associazione a 3 mL/min.
10. Ripiegare il costrutto NEMO-EEAA su colonna lavando la colonna con buffer di ripiegatura per 20 volumi di colonne a 3 mL/min, contenente 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0.
11. Eseguire l'eluizione del gradiente di NEMO-EEAA, da 10 a 500 mM Imidazole su un gradiente di volume di 12 colonne, raccogliendo tutti eluati nella piastra di raccolta frazione (1 mL frazioni).
12. Proseguire eluizione a 500 mM imidazole per due volumi di colonne, continuando a raccogliere.
13. Eseguire l'elettroforesi del gel di sodio dodecyl (SDS) - poliacrilamina (PAGE) per determinare la presenza NEMO- EEAA nelle frazioni di eluizione.
    NOTA: Abbiamo usato il 10% di acrilammide, buffer MES.
14. Frazioni da biliardo contenenti proteine bersaglio pure.
15. Misurare la concentrazione di proteine da Bradford saggio¹⁷.
    NOTA: Questo è necessario per stimare la quantità di proteasi per il tag scissione.

4. Il suo₆ tag scissione e purificazione

1. Aggiungi TEV in un rapporto di peso 1:10 della proteina TEV:NEMO-EEAA per fendere il tag His_6. La proteasi TEV è stata purificata in casa.
   NOTA: Ottimizzare la quantità di TEV, tempo e temperatura necessari per la scissione completa separatamente.
   1. Esprimere proteasi TEV, S219V mutante¹⁸ in cellule BL21(DE3)-RIL e purificare come descritto in precedenza¹⁹. Far crescere brevemente le cellule come descritto al punto 2, lisci dalla stampa francese e purificare utilizzando una colonna IMAC. Conservare la proteina finale in 25 mM di sodio fosfato tampone, pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 20% v/v glicerol.
2. Dialisci il campione durante la notte (circa 15 h) in 4 L di 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8.0, per consentire la scissione e rimuovere l'imidazolo in eccesso dal campione per la successiva purificazione.
3. Giorno 4 – Rimuovere il campione dalla dialisi. Eseguire un gel SDS-PAGE del campione dalla scissione TEV per assicurarsi che la scissione sia completata.
4. In un sistema di cromatografia liquida veloce, rimuovere l'etanolo da una colonna IMAC 5 mL con 25 mL di ultrapure H₂O a 5 mL/min, seguito da 25 mL di buffer di eluizione contenente 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0, quindi buffer di rilegatura contenente 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0.
5. Caricare la colonna a 1 mL/min con NEMO-EEAA con taglio TEV. Cleaved NEMO-EEAA eluirà nel flow-through: raccogliere in una piastra di raccolta 96 frazioni di pozzo (1 mL di frazioni). Lavare la colonna per cinque volumi di colonne di 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole a 1 mL/min, continuando a raccogliere in piastra di raccolta frazione.
6. Elute TEV e uncleaved His₆-NEMO-EEAA con tre volumi di colonne di 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0, raccogliendo eluizione in un pallone da 50 ml.
7. Eseguire il gel SDS-PAGE di frazioni flow-through per determinare la presenza di NEMO-EEAA a cleosa.
8. Frazioni di flusso della piscina contenenti costrutto NEMO-EEAA a cleaved e concentrato utilizzando un concentratore di cellule mescolate a 5 mL. Taglio del peso molecolare della membrana (MWCO) - 3 kDa.
9. Utilizzando una membrana MWCO da 3 kDa, dialyze concentrato campione in 2 L di 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8.0 per 2 h. Modificare il buffer di dialisi a 2 L di tampone di dialisi fresco per la dialisi notturna (circa 15 h), a 4 gradi centigradi.
10. Giorno 5 – Caricare 5 mL del campione dializzato su una cromatografia di esclusione di dimensioni (SEC) 16 mm x 60 cm colonna (34 m media di particelle) a 1 mL/min in 2 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8.0. Ripetere l'operazione con colonne aggiuntive a seconda del volume del campione.
11. Raggruppare le frazioni corrispondenti a dimeric NEMO-EEAA.
    NOTA: NEMO-EEAA elui s'impegna tra 60-65 mL, corrispondente a una proteina di peso molecolare più grande, a causa della natura allungata della bobina oculata dimeric.
12. Concentrate utilizzando un concentratore di cellule agitate e un MWCO - 3 kDa membrana ad una concentrazione finale di 113 M (1,65 mg/mL).
13. Aliquota e conservare a 4 gradi centigradi (stabile per oltre 1 mese).

5. Screening della matrice sparse

NOTA: il protocollo esegue prove di cristallizzazione utilizzando schermi disponibili in commercio e configurando esperimenti di blocco mediante un robot di cristallizzazione. Le immagini in cristallo vengono raccolte automaticamente da un imager.

1. Utilizzando schermi a matrice di tipo sparse disponibili in commercio (vedere Tabella dei materiali),pipetta 60 - L di soluzione a matrice sparse in ciascuno dei 96 pozzi di una piastra di cristallizzazione a 2 camere a goccia per la diffusione del vapore a goccia seduta (soluzione di serbatoio).
2. Utilizzando un setter a goccia robotico, erogare 100 nL di soluzione proteica a 1,65 mg/mL in un rapporto 1:1 con soluzione serbatoio in goccia 1 per un volume finale di 200 nL; quindi 66 nL di soluzione proteica con 134 nL di soluzione serbatoio per un volume finale di 200 nL in goccia 2 (rapporto 1:2).
3. Sigillare la piastra utilizzando nastro adesivo largo 3 pollici subito dopo l'erogazione.
   NOTA: Le gocce si prosciugano se lasciate esposte all'atmosfera per più di 2-3 min.
4. Conservare i vassoi nella memoria dell'immagine di cristallizzazione, a 20 gradi centigradi, controllando le immagini raccolte automaticamente per la presenza di cristalli, a partire da due giorni.
   NOTA: lo screening di cristallizzazione ha proceduto in parallelo con l'ottimizzazione del costrutto. Cristalli iniziali formati nelle seguenti condizioni (schermi commerciali elencati nella Tabella dei Materiali):a) 0,1 M Tris, pH 8.0, 30 % v/v polyetilene glicole (PEG) MME 550, 5% di acido poli-z-glutammico, 200-400 kDa polimero a basso peso molecolare (PGA -LM); b) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG MME 2k, 5% PGA-LM; c) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG 3350, 5% PGA-LM. I cristalli dello schermo a matrice sparsa avranno scarsa uniformità reticolare; quindi, sembreranno poveri utilizzando l'imaging polarizzato incrociato. Utilizzare l'imaging UV per garantire che i cristalli contengano proteine. La seguente fase di generazione delle scorte di semi è necessaria per ottenere i cristalli di qualità di diffrazione finale.

6. Produzione di scorte di semi

NOTA: Otteniamo riproducibilmente cristalli per la generazione di semi in 0,1 M Tris pH 8,0, 5% PGA-LM, 3,6% w/v PEG 20k. Tuttavia, i cristalli mostreranno un'elevata mosaicità e non sono adatti per la raccolta dei dati in questa fase.

1. Utilizzando un kit per la generazione di semi, preparare il brodo di semi pipeting out intera goccia con cristallo presente, e mettere in 50 - L di soluzione di condizione di cristallizzazione nella fiala fornita.
2. Vorticare il brodo di semi per 3 min, pulsando 20 s su e 10 s off.
3. Diluire in serie le scorte di semi in 1:10 incrementi fino a 1:10.000. Conservare tutte le diluizioni a 4 gradi centigradi, per un ulteriore utilizzo.

7. Schermi fini

1. Progettare schermi di dimensioni diverse, variando le condizioni per Tris, PGA-LM e PEG. Variare la lunghezza del PEG per i singoli vassoi.
   NOTA: Lo schermo fine che ha prodotto il cristallo utilizzato per la determinazione della struttura di NEMO-EEAA impiegava le seguenti condizioni: 0.1 M Tris pH 8; PGA-LM variava dall'8 allo 0% nelle colonne 1-12. Le righe A-H hanno esaminato diversi TAG, con concentrazioni variabili nelle colonne 1-12 come indicato di seguito. A: PEG 200 (0-40% v/v); B: PEG 400 (0-40% v/v); C: PEG MME 500 (0-40% v/v); D: PEG 1000 (0-30% w/v); E: PEG 3350 (0-30% w/v); F: PEG 6k (0-30% w/v); G: PEG 10k (0-20% w/v); H: PEG 20k (0-20% w/v). Il cristallo è apparso in ben H4 (5.45% w/v PEG 20k, 5.8% w/v PGA-LM). In questo protocollo, un gestore di liquidi generatore di schermo di cristallografia proteica è stato utilizzato per costruire gli schermi.
2. Seme uno stock proteico in un rapporto di volume 1:25 di 1:1,000 diluizione dei semi.
   NOTA: la concentrazione del NEMO-EEACadrà leggermente, ma i cristalli continueranno a formarsi.
3. Ripetere il passaggio 2 utilizzando la diluizione del seme 1:10,000, stesso rapporto di volume 1:25.
4. Utilizzando il setter a goccia, erogare 100 nL di soluzione proteica a 1,65 mg/mL, con 1:1.000 diluizione di stock di semi in un rapporto 1:1 con soluzione serbatoio in goccia 1 per un volume finale di 200 nL. Ripetere per la goccia 2, ma con 1:10,000 diluizione di stock di semi presenti.
5. Sigillare la piastra utilizzando nastro adesivo largo 3 pollici subito dopo l'erogazione.
   NOTA: Le gocce si prosciugano se lasciate esposte all'atmosfera per più di 2-3 min.
6. Conservare i vassoi nella memoria dell'imager, a 20 gradi centigradi, controllando le immagini raccolte dopo due giorni per la presenza dei cristalli.
7. Controllare i cristalli con l'imager polarizzatore incrociato per uniformità del reticolo, per selezionare per singole condizioni per impostare i vassoi seguenti.

8. Generazione di cristalli per la raccolta dei dati

1. Progetta schermi a singola condizione intorno a Tris, PGA-LM e PEG che producevano cristalli uniformi analizzati da immagini polarizzate e i cristalli più grandi possibili.
   NOTA: I cristalli di queste condizioni hanno una forma irregolare, per lo più fogli sottili rettangolari. È fondamentale selezionare una condizione in cui i bordi del cristallo sono ben definiti e hanno il massimo spessore possibile.
2. Fare 20 mL di condizione di cristallizzazione a mano.
3. Utilizzando un pipettor multicanale, erogare 60 l per bene in una piastra di cristallizzazione a 2 gocce, 96 pozzi per la diffusione del vapore a goccia seduto.
4. Preparare il supporto di semi come descritto nel passaggio 6.2.
5. Distribuisci la proteina come descritto al punto 6.3.
6. Sigillare la piastra utilizzando nastro adesivo largo 3 pollici subito dopo l'erogazione.
   NOTA: Le gocce si prosciugano se lasciate esposte all'atmosfera per più di 2-3 min.
7. Conservare i vassoi nell'imager a 20 gradi centigradi e controllare ogni giorno le immagini per verificare la presenza di cristalli.
8. Controllare le immagini polarizzate dei cristalli per l'uniformità del reticolo, per selezionare i cristalli per la raccolta dei dati.

9. Determinazione del crio-protettore

1. Per testare i crio-protettori, creare soluzioni azionarie corrispondenti alle condizioni di cristallizzazione ma contenenti una concentrazione 30%, 20%, 10% e 5% superiore di ogni componente. L'aggiunta del volume crio-protettore si tradurrà in una concentrazione finale di componenti che è lo stesso come le condizioni di cristallizzazione.
   NOTA: Per testare un crio-protettore ad una concentrazione del 30% per volume per una condizione di cristallizzazione di 0,1 M, iniziare con una soluzione di stock di 0,143 M Tris, prima di aggiungere il crioprotettore.
2. Da un kit crio-reagenti, creare 10 L di campione per il test crio-protetto mescolando il 30% per volume di crio condizione nel 70% della soluzione di stoccaggio delle condizioni di cristallizzazione, per una concentrazione finale del 30% crio-protettrice in condizioni di cristallizzazione originali. Mescolare accuratamente.
   1. Utilizzando una pipetta da 10 luna, prendere 5 ll di soluzione crio-protetta di prova e immergere la punta del tubo in azoto liquido. Se si osserva ghiaccio, scartare.
   2. Prova tutti i crio-protettori al 30%. Per le soluzioni di successo, ripetere il processo al 20%, quindi al 10% e al 5% del crioprotettore.
   3. Utilizzando la soluzione crio-protettrice di successo con la più piccola percentuale di crio-protettore, aggiungere 0,5 l di soluzione in una goccia di prova con cristalli presenti. Osservare al microscopio, la tempistica quanto tempo il cristallo dura nella condizione, se non indefinito.
      NOTA: Questi cristalli sono solo per il test e verranno scartati. Per NEMO-EEA, il 12% 1,2-propanediolo è la soluzione ottimale per il crio-protettore. Il 12% tiene conto della diluizione che la soluzione crio-protettrice sperimenterà quando viene aggiunta al calo di cristallo di circa 100 nL, per una concentrazione finale approssimativa di 1,2-propanediolo del 10%.

10. Looping di cristallo

1. Cristalli loop 1-2 giorni prima della spedizione al sincrotrone.
   NOTA: I cristalli hanno un diametro di circa 60-100 m: gli anelli da 0,05 a 0,10 mm sono ideali per l'looping.
2. Tagliare il nastro dalla parte superiore del pozzo.
3. Aggiungete al pozzo 0,5 l di soluzione di cristallizzazione contenente il 12% 1,2-propanediolo crioprotettore direttamente.
   NOTA: la concentrazione finale di 1,2 propadiolo è ora di circa il 10%, a causa della diluizione da parte di 100 nL della soluzione di caduta (riduzione approssimativa del volume di caduta da 200 nL iniziale, a causa della diffusione del vapore).
4. Loop il cristallo dal pozzo.
   NOTA: I cristalli crescono spesso sul fondo del pozzo, ma si sloggiano con una leggera spinta dal loop. Una volta sloggiato, loop.
5. Conservare il cristallo contenente crio-loop in dischi immersi nel liquido N₂.
6. Conservare questi dischi nel liquido N₂ nel pallone Dewar fino a quando non sono pronti per la spedizione per la diffrazione a raggi X al sincrotrone.

11. Raccolta dei dati

1. Raccogliere i dati di diffrazione a raggi X. In questo protocollo, utilizzare AMX beamline (ID: 17-ID-1), National Synchrotron Light Source II.
   NOTA: i dati sono stati raccolti in loco ma possono essere raccolti in remoto. Raccogliere dati nella regione del cristallo che hanno mostrato l'uniformità del reticolo in immagini polarizzate incrociate. Posizionare i cristalli nel loop in modo che la raccolta dei dati non coinvolga le regioni "povere" del cristallo mentre il cristallo ruota nel goniometro. I dati che fornivano la migliore risoluzione provenivano dalla raccolta sul bordo di un'estensione di un cristallo di circa 5 x 5 m di dimensione. Utilizzare rastering per identificare le migliori aree sul cristallo per raccogliere²⁰.

12. Elaborazione dei dati a raggi X

1. Elabora il set di dati alla massima risoluzione raccolta (1,8 ) con il programma XDS IDXREF per determinare il contenuto di gruppi di spazi, celle unita e solventi.
2. Integrare i dati utilizzando il programma XDS INTEGRATE.
3. Intensità in scala di processo dal programma XDS XSCALE utilizzando STARANISO Server, utilizzando la media di taglio I/I di 1,2 per la superficie del limite di diffrazione per i dati.
   NOTA: i dati non verranno tagliati in vera ellissoide. Conservare tutti i dati al di sopra dell'I/II del limite di 1,2. Le statistiche sui dati calcolati per la completezza sferica saranno scarse, a causa del troncamento non sferico. La completezza dell'ellittica è stata dell'88% con le risoluzioni più alte di: 1,88 , 2,10 e 2,55 gradi, rispettivamente lungo l'asse a , b , b e c.

13. Soluzione struttura

1. Utilizzare la struttura a raggi X di GCN4 (PDB: 4DMD)¹⁵ come modello di ricerca per la sostituzione molecolare utilizzando MRage²¹ in PHENIX²². La struttura 4DMD è stata definita in MRage come un "insieme", e la soluzione MRage ha costruito con successo la porzione di struttura corrispondente all'adattatore a bobina a dispone del terminale N di NEMO-EEAA, omologa al modello di ricerca, per entrambe le catene nel dimero.
   NOTA: disattivare la correzione anisotropia in PHASER o i dati verranno ulteriormente ridimensionati.
2. Utilizzare i cicli successivi di Autobuild²³ in PHENIX e la costruzione manuale (utilizzando le mappe 2F_o-F_c e F_o-F_c, in Coot²⁴) per costruire il resto della struttura.
3. Costruire manualmente i residui ancora mancanti nel modello sulla base delle mappe 2F_o-F_c e F_o-F_c, utilizzando Coot²⁴.
   NOTA: L'ultima fase ha comportato la costruzione dei 4 residui di terminali N e 4 residui di terminali C per ogni monomero. Anche il posizionamento sidechain è stato regolato manualmente in base alle esigenze.
4. Calcolare una mappa di omoglia composita utilizzando PHENIX e un'omissione del 10% della struttura.

14. Affinamento della struttura

1. Perfezionare le strutture con PHENIX Refine. Eseguire i perfezionamenti iniziali rispetto ai pesi di solvente e stereochimica alla rinfusa, rilassando i vincoli RMSbond e RMSangle rispettivamente a 0,01 e 1,0. Continuare il perfezionamento su singoli fattori B, parametri TLS e occupanze.

Risultati

Clonazione, espressione e purificazione del dominio iKK-binding di NEMO.
Il protocollo è seguito in questo studio per ottenere la sequenza finale di NEMO-EEAA(Figura 1A), che produceva cristalli di qualità di diffrazione, che prevedeva l'espressione e la caratterizzazione di tutti i costrutti intermedi, inclusa l'aggiunta degli adattatori a bobina a N- e o C-terminus, le mutazioni C76A, C95S e le mutazioni E56A, E57A. Figura 1

Discussione

I tentativi di cristallizzazione di NEMO in forma non associata non hanno avuto successo, inclusi i tentativi di utilizzo della proteina a lunghezza intera e diversi costrutti di troncamento che comprendono il dominio di legame IKK. La nostra caratterizzazione biofisica del dominio iKK-binding di NEMO (residui 44-111) da dichroismo circolare, spettroscopia NMR e anisotropia fluorescenza ha indicato che il costrutto, anche se in grado di legare IKK, esisteva in uno stato di scambio conformativo, non adatto per la cristall...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM)	Molecular Dimensions	MD2-100-150	For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane	Spectra/Por	132724	For dialysis removal of imidazole
Amicon Stirred Cell	Millipose Sigma	UFSC 05001	For protein concentration
Ammonium Chloride	Millipore Sigma	G8270	For minimal media labeling
Benzonase Nuclease	Millipore Sigma	9025-65-4	For digestion of nucleic acid
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells	Agilent Technologies	Model: 230245	TEV expression
CryoPro	Hampton Research	HR2-073	Cryo-protectants kit
D-Glucose (Dextrose)	Millipore Sigma	A9434	For minimal media labeling
Difco Terrific Broth	ThermoFisher	DF043817	For culture growth
Dithiothreitol > 99%	Goldbio	DTT25	For reduction of disulfides
E. coli: Rosetta 2 (DE3)	Novagen	71400-3	Expression of unlabeled NEMO-EEAA
FORMULATOR	Formulatrix		Liquid handler/ screen builder
HCl – 1.0 M Solution	Hampton Research	HR2-581	For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg	GE Healthcare	28989333	For size exclusion purification
HisTrap HP 5 mL column	GE Healthcare	17524802	For purification of His-tagged NEMO-EEAA
HT 96 MIDAS	Molecular Dimensions	MD1-59	For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
HT 96 Morpheous	Molecular Dimensions	MD1-46	For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
Imidazole	ThermoFisher	288-32-4	For elution from His-trap column
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside	Goldbio	I2481C5	For induction of cultures
MRC2 crystallization plate	Hampton Research	HR3-083	Crystallization plate
NT8 - Drop Setter	Formulatrix		Crystallization
pET-16b	Millipore Sigma	69662	For cloning of NEMO-EEAA
pET-45b	Millipore Sigma	71327	For cloning of NEMO-EEAA
Phenylmethylsulfonyl fluoride	ThermoFisher	36978	For inhibition of proteases
Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti	Beckmann Coulter	339160	Ultracentrifuge bottle
Polyethylene Glycol 20,000	Hampton Research	HR2-609	For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
pRK793 (TEV)	Addgene	Plasmid 8827	For TEV production
QuikChange XL II	Agilent Technologies	200522	Site directed mutagenesis
Required Cap Assembly:	Beckmann Coulter	355623	Ultracenttrifuge bottle cap
ROCK IMAGER	Formulatrix		Crystallization Imager
Seed Bead Kit	Hampton Research	HR2-320	Seed generation
Sodium Chloride ≥ 99%	Millipore Sigma	S9888	For buffering of purification solutions
TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride)	Goldbio	TCEP1	Reducing agent
The Berkeley Screen	Rigaku	MD15-Berekely	For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
The PGA Screen	Molecular Dimensions	MD1-50	For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Tris – 1.0 M Solution	Hampton Research	HR2-589	For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (powder format)	Thermofisher	15504020	For buffering of purification solutions
Urea	ThermoFisher	29700	For denaturation of NEMO-EEAA