Messung der Pulsausbreitungsgeschwindigkeit, Distensibilität und Dehnung in einem Abdominal Aortenaneurysm Mausmodell

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von hochfrequenter Ultraschall-Bildgebung zur Messung von Luminaldurchmesser, Pulsausbreitungsgeschwindigkeit, Distensibilität und radialer Belastung an einem Mausmodell des abdominalen Aortenaneurysmus.

Zusammenfassung

Ein abdominales Aortenaneurysm (AAA) ist definiert als eine lokalisierte Dilatation der Bauchaorta, die den maximalen intraluminalen Durchmesser (MILD) um das 1,5-fache seiner ursprünglichen Größe überschreitet. Klinische und experimentelle Studien haben gezeigt, dass kleine Aneurysmen brechen können, während eine Subpopulation großer Aneurysmen stabil bleiben kann. So kann neben der Messung des intraluminalen Durchmessers der Aorta die Kenntnis der strukturellen Merkmale der Gefäßwand wichtige Informationen liefern, um die Stabilität der AAA zu beurteilen. Aortenversteifung hat sich vor kurzem als zuverlässiges Werkzeug zur Bestimmung früher Veränderungen in der Gefäßwand herauskristallisiert. Pulsausbreitungsgeschwindigkeit (PPV) zusammen mit der Distensibilität und radialen Dehnung sind sehr nützliche Ultraschall-basierte Methoden, die für die Beurteilung der Aortensteifigkeit relevant sind. Der Hauptzweck dieses Protokolls ist es, eine umfassende Technik für den Einsatz von Ultraschall-Bildgebungssystem zur Erfassung von Bildern und Analyse der strukturellen und funktionellen Eigenschaften der Aorta, wie durch MILD, PPV, Distensivität und radiale Dehnung bestimmt bieten.

Einleitung

Ein abdominales Aortenaneurysm (AAA) stellt eine signifikante Herz-Kreislauf-Erkrankung dar, die durch eine permanente lokalisierte Dilatation der Aorta gekennzeichnet ist, die den ursprünglichen Gefäßdurchmesser um 1,5 mal¹überschreitet. AAA gehört zu den 13 häufigsten Todesursachen in den Vereinigten Staaten². Das Fortschreiten von AAA wird auf die Degeneration der Aortenwand und DerElastinfragmentierung zurückgeführt, was letztlich zu einem Aortenbruch führt. Diese Veränderungen in der Aortenwand können ohne signifikante Erhöhung des maximalen intraluminalen Durchmessers (MILD) auftreten, was darauf hindeutet, dass MILD allein nicht ausreicht, um die Schwere der Krankheit vorherzusagen³. Daher müssen zusätzliche Faktoren identifiziert werden, um erste Veränderungen in der Aortenwand zu erkennen, die zu frühen Behandlungsmöglichkeiten führen können. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen praktischen Leitfaden zur Beurteilung der aortenfunktionellen Eigenschaften mittels Ultraschallbildgebung zu liefern, die durch Messungen der Pulsausbreitungsgeschwindigkeit (PPV), Distensibilität und radialen Dehnung gekennzeichnet ist.

Ein gut charakterisiertes experimentelles Modell zur Untersuchung von AAA, das zuerst von Daugherty und Kollegen beschrieben wurde, beinhaltet eine subkutane Infusion von Angiotensin II (AngII) über osmotische Pumpen in Apoe^-/- Mäuse⁴. Die präzise Messung von MILD mittels Ultraschallbildgebung war entscheidend für die Charakterisierung von AAA in diesem Mausmodell⁵. Obwohl histologische Veränderungen während der Entwicklung von AAA ausgiebig untersucht wurden, sind Veränderungen der funktionellen Eigenschaften der Gefäßwand wie Aortensteifigkeit nicht gut charakterisiert. Dieses Protokoll betont den Einsatz von Hochfrequenz-Ultraschall in Kombination mit den ausgeklügelten Analysen als leistungsfähige Werkzeuge zur Untersuchung der zeitlichen Progression von AAA. Insbesondere ermöglichen uns diese Ansätze, die funktionellen Eigenschaften der Gefäßwand zu bewerten, gemessen durch PPV, Distensivität und radiale Dehnung.

Jüngste klinische Studien an Humanpatienten mit AAA sowie im murinen Elastase-induzierten AAA-Modell deuten auf eine positive Korrelation zwischen Aortensteifigkeit und Aortendurchmesser^6,7hin. PPV, ein Indikator für Aortensteifigkeit, wird als hervorragende Messung zur Quantifizierung von Steifigkeitsänderungen in der Gefäßwand^6,8akzeptiert. PPV wird berechnet, indem die Transitzeit der Pulswellenform an zwei Stellen entlang der Vaskulatur gemessen wird, wodurch eine regionale Beurteilung der Aortensteifigkeit erfolgt. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass erhöhte Aortensteifigkeit, gemessen durch PPV, und auf zellulärer Ebene, wie durch Atomkraftmikroskopie bestimmt, positiv mit der Aneurysmaentwicklung^{korreliert 9}. Darüber hinaus legt die Literatur nahe, dass aortenhafte Steifigkeit der aneurysmalen Dilatation vorausgehen kann und somit nützliche Informationen über regionale intrinsische Eigenschaften der Gefäßwand während der Entwicklung von AAA¹⁰liefern kann. In ähnlicher Weise sind Distensivitäts- und Dehnungsmessungen die Quantifizierungswerkzeuge, um frühere Veränderungen der arteriellen Fitness zu messen. Gesunde Arterien sind flexibel und elastisch, während bei erhöhter Steifigkeit und weniger Elastizität die Distensibilität und Belastung verringert wird. Hier bieten wir einen praktischen Leitfaden und Schritt für Schritt Protokoll für den Einsatz eines hochfrequenten Ultraschallsystems zur Messung von MILD, PPV, Distensivität und radialer Dehnung bei Mäusen. Das Protokoll enthält technische Ansätze, die in Verbindung mit den grundlegenden Informationen verwendet werden sollten, die in Handbüchern für spezifische Ultraschall-Bildgebungsinstrumente und dem dazugehörigen Video-Tutorial bereitgestellt werden. Wichtig ist, dass das beschriebene Bildgebungsprotokoll in unseren Händen reproduzierbare und genaue Daten liefert, die bei der Untersuchung der Entwicklung und des Fortschreitens experimenteller AAA wertvoll erscheinen.

Um den Nutzen der Ultraschall-Bildgebung weiter zu demonstrieren, stellen wir Beispielbilder und Messungen aus eigenen Studien zur Verwendung pharmakologischer Ansätze zur Verhinderung experimenteller AAA¹¹zur Verfügung. Insbesondere wurde vorgeschlagen, Kerbsignalisierung in mehreren Aspekten der Gefäßentwicklung und Entzündung¹²beteiligt werden . Mit Gen-Haploinsuffizienz und pharmakologischen Ansätzen haben wir zuvor gezeigt, dass Notch-Hemmung die Entwicklung von AAA bei Mäusen reduziert, indem die Infiltration von Makrophagen an der Stelle der Gefäßverletzung^13,14,15verhindert wird. Für den aktuellen Artikel konzentrieren wir uns mit dem pharmakologischen Ansatz für Notch-Hemmung auf die Beziehung zwischen Aortensteifigkeit und Faktoren im Zusammenhang mit AAA. Diese Studien zeigen, dass Notch-Hemmung die Aortensteifigkeit reduziert, was ein Maß für aAA Progression¹¹ist.

Protokoll

Das Protokoll für den Umgang mit Mäusen und Ultraschall-Bildgebung wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Missouri (Tierprotokoll Nummer 8799) genehmigt und nach AAALAC International durchgeführt.

1. Ausrüstungsaufbau und Vorbereitung von Mäusen

1. Ausrüstungsaufbau
   1. Schalten Sie das Ultraschallgerät, den Ultraschall-Gelwärmer und das Heizkissen ein.
   2. Öffnen Sie das Ultraschallprogramm und geben Sie den Studiennamen und die beschreibenden Informationen für jede Maus ein.
   3. Wählen Sie die Anwendung als General Imagingaus.
   4. Wählen Sie den geeigneten Messumformer für die Bauchbildgebung (Abbildung 1B,C). In diesem Experiment wird der MS400-Wandler verwendet.
   5. Stellen Sie sicher, dass der Anästhesie-Isofluran- und Sauerstoffgehalt für jede Versuchssitzung ausreichend ist.
   6. Reinigen Sie die Ultraschall-Tierbildplattform.
2. Mausvorbereitung
   1. Legen Sie den Mauskäfig auf ein Heizkissen (36,5 bis 38,5 °C).
   2. Halten Sie die Maus vorsichtig an der Schwanzbasis und legen Sie sie in die sauerstoffgefüllte Isoflurankammer.
   3. Richten Sie den Isofluran- und Sauerstofffluss in die Induktionskammer.
   4. Schalten Sie den Isofluran-Verdampfer ein und stellen Sie den Isofluran-Spiegel auf 1-2% Vol.-V/Vol. Schalten Sie den Sauerstofftankdruck auf 1-2 L/min ein.
   5. Nach 2 min bestätigen Sie die ausreichende Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen von Entzugsreflexen beim Kneifen des Fußpolsters der Maus.
   6. Als nächstes schalten Sie den Induktionskammerversorgungszweig aus und schalten Sie den zweig, der auf den Anästhesie-Nasenkegel gerichtet ist.
   7. Übertragen Sie die Maus aus der Induktionskammer auf das Ultraschall-Bildgebungsstadium und positionieren Sie den Anästhesiekegel über der Nase des Tieres.
   8. Neigen Sie die Tierbildplattform um 10° in die untere rechte Ecke für ein optimales Scannen (Abbildung 1B).
   9. Legen Sie einen Tropfen steriler ophthalmologischer Lösung in beide Augen von Mäusen, um eine Trocknung unter Anästhesie zu verhindern.
   10. Positionieren Sie die Maus in der Supine-Position mit der Nase in den Anästhesiekegel eingesetzt.
   11. Tragen Sie das Elektrodengel auf alle vier Pfoten mit einem Wattestäbchen auf und kleben Sie die Pfoten auf die Kupferleitungen auf der Tierbildplattform für Elektrokardiogrammmessungen (Abbildung 1C).
   12. Verwenden Sie Clippers, um Haare an der Bildstelle zu rasieren und dann Enthaarungscreme auftragen, um das verbleibende Fell zu entfernen. Weniger als 1 min.
   13. Wischen Sie die Creme und das Haar vorsichtig mit einem feuchten Papiertuch ab.
   14. Überwachen Sie die Atmung und stellen Sie sicher, dass die Herzfrequenz zwischen 450-550 Schlägen/min gehalten wird. Wenn unter diesem Niveau, reduzieren Sie den Isofluran-Fluss und warten, bis sich die Herzfrequenz erholt.
   15. Vorgewärmtes Ultraschallgel (37 °C) auf die vorbereitete Hautstelle auftragen und den Messumformer an seinem Halter und tiefer befestigen, bis er das Gel berührt (Abbildung 1C).

2. Ultraschall-Bildgebung der Bauchaorta

1. Positionieren Sie den Messumformer horizontal (d. h. senkrecht zur Mittellinie der Maus).
2. Glätten Sie das Ultraschallgel und entfernen Sie Blasen mit dem Holzstab eines Wattestäbchens.
3. Senken Sie den Messumformer und legen Sie 0,5 - 1 cm unter das Zwerchfell, nachdem Sie das Gel berührt haben. Nun beginnen Sie, die Bilder zu beobachten.
4. Visualisieren Sie die Bauchaorta in der kurzen Achsenansicht (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Der B-Modus ist der standard- und effektivste Modus, um die Aorta anatomisch zu lokalisieren und den Messumformer zu positionieren. Die Abdominal-Aorta wird durch das Vorhandensein von pulsatile Mließströmung mit Farbdoppler und Power Doppler Modi in der kurzen Achse (d.h. der umfanglendiale Querschnitt der Aorta) identifiziert. Passen Sie die Mikromanipulatoren auf der Tierbühne und den Wandler an, um den Querschnitt der Aorta in die Bildmitte zu bringen.
5. Drehen Sie den Messumformer vorsichtig um 90° im Uhrzeigersinn, und stellen Sie den x-Achsen-Mikromanipulatorknopf langsam ein, um die Aorta in der langen Achsenansicht (Längsschnitt der Aorta) zu visualisieren.
   HINWEIS: In vielen Fällen können Magen-Darm-Gase das Bild stören, oder die Aorta ist möglicherweise nicht im optimalen Winkel, um eine klare lange Achsenansicht zu ermöglichen. Passen Sie den Winkel des Messumformers langsam und horizontal an, bis eine akzeptable Lange-Achsen-Ansicht erhalten ist. Wenn weiterhin Probleme auftreten, heben Sie den Messumformer, überprüfen Sie luftblasen unter dem Messumformer, passen Sie den Neigungswinkel der Tierstufe leicht an, tragen Sie Gele erneut auf, und wiederholen Sie alle Schritte erneut.
6. Legen Sie die Fokuszone und -tiefe im Bereich der Aorta mithilfe der Umschalter Fokuszone bzw. Fokustiefe fest. Passen Sie den Zeitgewinnkompensationsregler manuell an, um das Lumen der Aorta zu verdunkeln, um einen optimalen Kontrast der Aortawand zu erzielen.
7. Passen Sie den y-Achsenmanipulator an, um die Verzweigungspunkte der überlegenen mesenterischen und der rechten Nierenarterien zu visualisieren. Verwenden Sie die rechte Nierenarterie als Landmark, um das Bild der suprarenalen Aorta zu erfassen (Abbildung 2A).
8. Zeichnen Sie mindestens 100 Bilder mit B-Modus auf der suprarenalen Aorta auf.
9. Drücken Sie cinestore, um die B-Modus-Bilder zu speichern.
10. Drücken Sie die M-Modus-Taste auf der Instrumententastatur, um die M-Modus-Aufnahme zu aktivieren. Rollen Sie den Cursorball, um die gelbe Indikatorlinie zu einem normalen Aorta-Abschnitt mit klarem Gefäßwandbild zu bringen, oder zu den Abschnitten, in denen der maximale Durchmesser des Aneurysmus beobachtet wird.
11. Drücken Sie den SV/Gate-Umschalter und passen Sie den Cursorball an, um sicherzustellen, dass Gefäßwände in der Messhalterung enthalten sind. Drücken Sie das Update, um M-Modus-Messungen aufzuzeichnen, und drücken Sie cinestore, um sie zu erfassen (Abbildung 2A,B).
    HINWEIS: Der maximale Durchmesser des Aneurysmus befindet sich möglicherweise nicht in derselben Bildebene wie die optimale Lange-Achsen-Ansicht der Aorta. Passen Sie den x-Achsen-Manipulatorknopf für jede M-Modus-Messung leicht an, um sicherzustellen, dass die MILD jedes Abschnitts erfasst wird.
12. Um EKG-Gated Kilohertz Visualization (EKV) Bilder zu erhalten, drücken Sie die B-Modus-Taste, um zur B-Modus-Aufnahme zurückzukehren.
    HINWEIS: Wenn die Bilder nicht scharf sind, passen Sie den x-Achsenmanipulator an, um das schärfste Bild der oberen Wand des Lumens über eine Schnittlänge (d. h. > 6 mm) zu erhalten.
13. Drücken Sie die Taste Physio-Einstellungen auf der Tastatur und wählen Sie Atemschutz-Gating. Passen Sie die Gating-Verzögerung und das Fenster manuell an, um die Daten nur während der flacheren Teile der Atmungswelle aufzuzeichnen. Die Aufnahmeabschnitte werden als farbige Blöcke auf der Rückverfolgung der Atmungswelle angezeigt.
    HINWEIS: Ohne die Einstellung des Atmungs-Gatings werden die EKV-Bilder aufgrund der normalen Bewegung des Tieres während der Atmung verwischt.
14. Drücken Sie die EKV-Taste, um den EKV-Modus zu aktivieren. Wählen Sie im entsprechenden Menü Standardauflösung und Bildrate 3000 oder höheraus. Wählen Sie fortfahren, um EKV-Bilderaufzuzeichnen. Drücken Sie cinestore, um die Bilder zu speichern. Verwenden Sie das EKV-Modusbild, um Messungen der Pulsausbreitungsgeschwindigkeit (PPV), der Distensibilität und der radialen Dehnung zu erhalten.
    HINWEIS: EKV-Aufzeichnung kann fehlschlagen, wenn es ungewöhnliche Schwankungen in der Atmung, Tier ist zu schnell atmen, oder Bildraten Einstellungen sind zu hoch. Legen Sie in diesem Fall die Bildrate niedriger fest und warten Sie, bis sich die Atmung des Tieres stabilisiert. Die Einstellung der Bildrate auf 3000 ist in der Regel sowohl für Mäuse als auch für Ratten geeignet.

3. Post-Imaging-Schritte

1. Wischen Sie das Ultraschallgel vorsichtig aus dem Bauchbereich der Maus mit einem mit warmem Wasser befeuchteten Papiertuch ab.
2. Legen Sie die Maus wieder in ihren Hauskäfig auf einem Heizkissen.
3. Schalten Sie die Isofluran-Maschine aus, reinigen Sie die Tierbildplattform und den Wandler mit feuchten Tüchern.
4. Übertragen Sie die während des Ultraschallscans gesammelten Bilddaten auf die Festplatte.
5. Schalten Sie das Ultraschallgerät aus.
6. Nachdem sich die Maus von der Anästhesie erholt hat und wachsam ist, entfernen Sie das Heizkissen und geben Sie den Käfig an das Tierhausregal zurück.

4. Analyse von Abdominalaortenbildern

1. Analyse von M-Modus-Bildern zur Messung von MILD
   1. Öffnen Sie das Ultraschallprogramm und geben Sie den Studiennamen und die beschreibenden Informationen für jede Maus ein.
   2. Öffnen Sie die Ultraschalldaten in der Analysesoftware, öffnen Sie das M-Modus-Bild und halten Sie den Herzschlag an.
   3. Klicken Sie auf Messungen.
   4. Wählen Sie das Gefäßpaket aus den Dropdown-Optionen aus. Klicken Sie auf Tiefe und zeichnen Sie eine Linie über das Aortenlumen, das sich von Innenwand zu Wand erstreckt (Abbildung 2C,D).
      HINWEIS: Aus Gründen der Konsistenz sollten die Messungen in der systolischen Phase des Herzzyklus durchgeführt werden, wenn die Aorta maximal erweitert wird. Zeichnen Sie drei Linien über drei verschiedene Herzschläge, um genaue und durchschnittliche Messungen von MILD zu erhalten. In AAA werden die Messungen bei der maximalen Dilatation der Aorta durchgeführt. Es ist auch ratsam, die Tiere 4-6 h vor dem Sammeln von Bildern zu fasten, um Interferenzen durch Darmbewegung zu vermeiden und Bildklarheit zu gewährleisten.
2. Analyse der Pulsausbreitungsgeschwindigkeit (PPV)
   1. Öffnen Sie das EKV-Bild, und halten Sie den Takt an.
   2. Öffnen Sie ein neues Fenster der Analysesoftware (z.B. Vevo Vac), indem Sie auf das Namenssymbol klicken.
   3. Klicken Sie auf die PPV-Option (Pfeil in Abbildung 3D). Ein kleines Fenster wird weiter mit dem Bild der Aorta erscheinen.
   4. Zeichnen Sie einen rechteckigen Kasten, indem Sie auf die obere Gefäßwand klicken und den Zeiger für etwa 4 mm ziehen, der beide Wände der suprarenalen Aorta bedeckt.
      HINWEIS: Halten Sie die Länge der Box konsistent (ca. 4 mm) für alle Bilder. Der Benutzer kann den rechteckigen Kasten anpassen, indem er sich dreht, um die Box auszurichten, und die Linie auswählt und dann an eine neue Position auf dem analysierten Gefäß zieht, um die am besten geeignete und klare Beugung der Pulswelle zu erhalten. Die vertikalen Datenlinien aus dem Rechteck werden als linkes (oberes Bild) und Rechts (unteres Bild) auf dem ROI angezeigt und identifiziert. Für eine bessere Visualisierung der Beugung der Pulswelle ist es manchmal nützlich, die Zugbox nur an der oberen Wand zu verwenden, wie in Abbildung 3dargestellt. Die Software berechnet automatisch die PPV (m/s). Es ist jedoch immer besser, die violetten Linien manuell anzupassen, um den genauen Biegepunkt auf den Pulswellen einzustellen und PPV wird sich entsprechend ändern.
   5. Wählen Sie schließlich den Befehl Akzeptieren aus, um die PPV-Werte zu speichern. Exportieren Sie die Zahlen und die Daten auf das Datenspeicherlaufwerk.
3. Analyse auf Distensivität und radiale Dehnung
   1. Öffnen Sie das EKV-Bild, und halten Sie den Takt an.
   2. Klicken Sie auf das Software-Symbol. Die Software öffnet ein neues Fenster.
   3. Klicken Sie auf den neuen ROI der Spur und zeichnen Sie einen rechteckigen Kasten an den beiden Wänden des Schiffes. Die Software verfolgt automatisch die oberen und unteren Wände des Schiffes. Der Benutzer kann die Spurart anpassen, um sie an der Wand auszurichten, indem er auf grüne Punkte klickt (Abbildung 4A,B).
   4. Akzeptieren Sie nun die Ablaufverfolgung. Die Software berechnet die Distensibilität (1/Mpa) im ausgewählten ROI.
   5. Wählen Sie für die radiale Dehnungsmessung die entsprechende Dehnungsoption aus den Menüleisten oben links aus. Die Bilder für radiale Dehnung und tangentiale Dehnung werden geöffnet.
   6. Erhalten Sie den Wert für radiale Dehnung (%) durch Bewegen des Cursors auf der Spitze der Kurve. Exportieren Sie die Daten als Bilder oder im Videoformat (Abbildung 4A,B).

Ergebnisse

Repräsentative M-Modus-Bilder der normalen und aneurysmalen Bauchaorta von Mäusen sind in Abbildung 2A bzw. Abbildung 2Bdargestellt. Die suprarenale Bauchaorta wird durch ihre Lage neben der rechten Nierenarterie und der überlegenen mesenterischen Arterie identifiziert (Abbildung 2A). Repräsentative Bilder, die für die Berechnung von MILD verwendet werden, bei drei verschiedene...

Diskussion

Ultraschall-Bildgebung bietet eine leistungsstarke Technik zur Bestimmung der funktionellen Eigenschaften der Aorta durch Messungen von PPV, Distensivität und radialer Dehnung. Diese Messungen sind besonders lehrreich für die Untersuchung von Mausmodellen von AAA und der In-vivo-Ansatz ermöglicht die Sammlung von Längsdaten, die potenziell wichtig sind, um die zeitliche Entwicklung der Aortenpathologie zu verstehen. Insbesondere werden Messungen der In-vivo-Aortensteifigkeit lokal in der Bauchaorta durch PPV, Distens...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensin II	Sigma	A9525
Apoe-/- mice	The Jackon lab
Clippers	WAHL	1854
Cotton swab	Q-tips
DAPT	Sigma	D5942
Depilatory cream	Nair	LL9038
Electrode cream	Sigma	17-05
Gel warmer	Thermasonic (Parker)	82-03 (LED)
Heating pad	Stryker	T/pump professional
Isoflurane	VetOne	Fluriso TM
Isoflurane vaporizer	Visualsonics	VS4244
Lubricating ophthalmic ointment	Lacri-lube
Osmotic pumps	Alzet	Model 2004
Oxygen tank	Air gas
Tranducer	Visualsonics	MS-400 or MS550D
Ultrasonic gel	Parker	Aquasonic clear
Ultrasound Imaging System	Visualsonics	Vevo 2100
Vevo Vasc Software	Visualsonics