Medição da velocidade de propagação do pulso, destensibilidade e tensão em um modelo de rato aórtico abdominal

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para o uso de imagens de ultrassom de alta frequência para medir o diâmetro luminal, a velocidade de propagação do pulso, a destensibilidade e a tensão radial em um modelo de camundongo do aneurisma aórtico abdominal.

Resumo

Um aneurisma abdominais (AAA) é definido como uma dilatação localizada da aorta abdominal que excede o diâmetro intraluminal máximo (MILD) em 1,5 vezes do seu tamanho original. Estudos clínicos e experimentais mostraram que pequenos aneurismas podem romper, enquanto uma subpopulação de grandes aneurismas pode permanecer estável. Assim, além da medição do diâmetro intraluminal da aorta, o conhecimento dos traços estruturais da parede da embarcação pode fornecer informações importantes para avaliar a estabilidade da AAA. O endurecimento aórtico surgiu recentemente como uma ferramenta confiável para determinar mudanças precoces na parede vascular. A velocidade de propagação do pulso (PPV) juntamente com a destensibilidade e a cepa radial são métodos altamente úteis baseados em ultrassom relevantes para avaliar a rigidez aórtica. O objetivo principal deste protocolo é fornecer uma técnica abrangente para o uso do sistema de imagem de ultrassom para adquirir imagens e analisar as propriedades estruturais e funcionais da aorta determinadas por LEVE, PPV, destensibilidade e cepa radial.

Introdução

Um aneurisma abdominais (AAA) representa uma doença cardiovascular significativa caracterizada por uma dilatação localizada permanente da aorta que excede o diâmetro original do vaso em 1,5 vezes¹. A AAA está entre as 13 principais causas de mortalidade nos Estados Unidos². A progressão da AAA é atribuída à degeneração da parede aórtica e à fragmentação da elastina, levando, em última instância, à ruptura aórtica. Essas alterações na parede aórtica podem ocorrer sem um aumento significativo no diâmetro intraluminal máximo (MILD), sugerindo assim que o MILD sozinho não é suficiente para prever a gravidade da doença³. Portanto, fatores adicionais precisam ser identificados para detectar alterações iniciais na parede aórtica, o que pode orientar as opções de tratamento precoce. O objetivo geral deste protocolo é fornecer um guia prático para avaliar propriedades funcionais aórticas utilizando imagens de ultrassom caracterizadas por medições de velocidade de propagação de pulso (PPV), destensibilidade e cepa radial.

Um modelo experimental bem caracterizado para estudar AAA, descrito pela primeira vez por Daugherty e colegas, envolve infusão subcutânea de angiotensin II (AngII) através de bombas osmóticas em Apoe^-/- ratos⁴. A medição precisa do LEVE usando imagens de ultrassom tem sido fundamental para caracterizar a AAA neste mouse modelo⁵. Embora as mudanças histológicas durante o desenvolvimento da AAA tenham sido extensivamente estudadas, as mudanças nas propriedades funcionais da parede da embarcação, como a rigidez aórtica, não foram bem caracterizadas. Este protocolo enfatiza o uso de ultrassom de alta frequência em combinação com as análises sofisticadas como ferramentas poderosas para estudar a progressão temporal da AAA. Especificamente, essas abordagens nos permitem avaliar as propriedades funcionais da parede da embarcação medida pelo PPV, destensibilidade e cepa radial.

Estudos clínicos recentes em indivíduos humanos com AAA, bem como no modelo AAA induzido por elastase murina, sugerem uma correlação positiva entre rigidez aórtica e diâmetro aórtico^6,7. O PPV, indicador de rigidez aórtica, é aceito como uma excelente medida para quantificar mudanças na rigidez na parede do vaso^6,8. O PPV é calculado medindo o tempo de trânsito da forma de onda de pulso em dois locais ao longo da vasculatura, proporcionando assim uma avaliação regional da rigidez aórtica. Recentemente demonstramos que o aumento da rigidez aórtica medida pelo PPV, e no nível celular determinado usando microscopia de força atômica, correlaciona positivamente com o desenvolvimento do aneurisma⁹. Além disso, a literatura sugere que a rigidez aórtica pode preceder a dilatação aneurismal e, portanto, pode fornecer informações úteis sobre propriedades intrínsecas regionais da parede do navio durante o desenvolvimento da AAA¹⁰. Da mesma forma, destensibilidade e medidas de tensão são as ferramentas de quantificação para medir mudanças anteriores do condicionamento arterial. Artérias saudáveis são flexíveis e elásticas, enquanto com aumento da rigidez e menos elasticidade, destensibilidade e tensão são diminuídas. Aqui, fornecemos um guia prático e protocolo passo a passo para o uso de um sistema de ultrassom de alta frequência para medir leve, PPV, destensibilidade e tensão radial em camundongos. O protocolo fornece abordagens técnicas que devem ser utilizadas em conjunto com as informações básicas fornecidas por manuais para instrumentos específicos de ultrassom e o tutorial de vídeo que acompanha. É importante ressaltar que, em nossas mãos, o protocolo de imagem descrito fornece dados reprodutíveis e precisos que parecem valiosos no estudo do desenvolvimento e progressão da AAA experimental.

Para demonstrar ainda mais a utilidade da imagem de ultrassom, fornecemos imagens e medições de exemplo retiradas de nossos próprios estudos com o objetivo de usar abordagens farmacológicas para prevenir o AAA¹¹experimental . Especificamente, a sinalização de entalhe foi proposta para estar envolvida em múltiplos aspectos do desenvolvimento vascular e inflamação¹². Usando haploinsuficiência genética e abordagens farmacológicas, já demonstramos anteriormente que a inibição de notch reduz o desenvolvimento de AAA em camundongos, prevenindo a infiltração de macrófagos no local de lesão vascular^13,14,15. Para o artigo atual, utilizando a abordagem farmacológica para inibição de Notch focamos na relação entre rigidez aórtica e fatores relacionados à AAA. Esses estudos ilustram que a inibição do notch reduz a rigidez aórtica, que é uma medida da progressão AAA¹¹.

Protocolo

O protocolo de manuseio de camundongos e ultrassom foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Missouri (protocolo animal número 8799) e foi conduzido de acordo com a AAALAC International.

1. Configuração de equipamentos e preparação de camundongos

1. Configuração de equipamentos
   1. Ligue o instrumento de ultrassom, o aquecedor de gel ultrassônico e a almofada de aquecimento.
   2. Abra o programa de ultrassom e digite o nome do estudo e informações descritivas para cada mouse.
   3. Selecione o aplicativo como Imagem Geral.
   4. Escolha o transdutor adequado para imagem abdominal (Figura 1B,C). Neste experimento, o transdutor MS400 é usado.
   5. Certifique-se de anestesia isoflurane e os níveis de oxigênio são adequados para cada sessão experimental.
   6. Limpe a plataforma de imagem animal de ultrassom.
2. Preparação do mouse
   1. Coloque a gaiola do rato em cima de uma almofada de aquecimento (36,5 a 38,5 °C).
   2. Segure suavemente o rato pela base traseira e coloque na câmara de isoflurano cheia de oxigênio.
   3. Direcione o fluxo de isoflurano e oxigênio para a câmara de indução.
   4. Ligue o vaporizador isoflurano e configure o nível de isoflurano para 1-2% vol/vol. Ligue a pressão do tanque de oxigênio para 1-2 L/min.
   5. Após ~2 min, confirme a profundidade adequada da anestesia pela ausência de reflexos de retirada ao beliscar a almofada do pé do rato.
   6. Em seguida, desligue o ramo de abastecimento da câmara de indução e ligue o galho direcionado ao cone do nariz da anestesia.
   7. Transfira o rato da câmara de indução para o estágio de ultrassom e posicione o cone de anestesia sobre o nariz do animal.
   8. Incline a plataforma de imagem animal em torno de 10° para o canto inferior direito para uma varredura ideal(Figura 1B).
   9. Coloque uma gota de solução oftálmica estéril em ambos os olhos de camundongos para evitar a secagem anestesia.
   10. Posicione o mouse na posição supina com o nariz inserido no cone da anestesia.
   11. Aplique o gel de eletrodo nas quatro patas usando um cotonete de algodão e fita as patas para os cabos de cobre na plataforma de imagem animal para leituras de eletrocardiograma(Figura 1C).
   12. Use cortadores para raspar cabelo no local de imagem e, em seguida, aplique creme depilatório para remover peles restantes. Deixe por menos de 1 min.
   13. Limpe suavemente o creme e o cabelo com uma toalha de papel úmida.
   14. Monitore a respiração e certifique-se de que a frequência cardíaca seja mantida entre 450-550 batidas/min. Se abaixo desse nível, reduza o fluxo de isoflurano e espere até que a frequência cardíaca se recupere.
   15. Aplique gel ultrassônico pré-aquecido (37 °C) ao local da pele preparado e conecte o transdutor ao seu suporte e abaixe até que ele toque o gel(Figura 1C).

2. Ultrassom de imagem da aorta abdominal

1. Posicione o transdutor horizontalmente (ou seja, perpendicular à linha média do mouse).
2. Alise o gel ultrassônico e remova bolhas usando a vara de madeira de um cotonete de algodão.
3. Abaixe o transdutor e coloque 0,5 a 1 cm abaixo do diafragma depois de tocar o gel. Agora comece a observar as imagens.
4. Visualize a aorta abdominal na visão do eixo curto (Figura 1C).
   NOTA: O modo B é o modo padrão e mais eficaz para localizar anatomicamente a aorta e posicionar o transdutor. A aorta abdominal é identificada pela presença de fluxo pulsátil usando modos doppler colorido e doppler de potência no eixo curto (ou seja, a seção transversal circunferencial da aorta). Ajuste os micromanipuladores no palco animal e o transdutor para levar a seção transversal da aorta para o centro da imagem.
5. Gire suavemente o transdutor 90° no sentido horário e ajuste lentamente o botão micromanipulador do eixo X para visualizar a aorta em visão longa do eixo (seção longitudinal da aorta).
   NOTA: Em muitos casos, gases gastro-intestinais podem interferir na imagem, ou a aorta pode não estar no ângulo ideal para permitir uma visão clara do eixo longo. Ajuste o ângulo do transdutor lentamente e horizontalmente até que uma visão de eixo longo aceitável seja obtida. Se os problemas persistirem, elevam o transdutor, verifique se há bolhas de ar o transdutor, ajuste ligeiramente o ângulo inclinado do estágio animal, reaplique géis e repita todos os passos novamente.
6. Defina a zona de foco e a profundidade na região da aorta utilizando os alternadores focus zone e Focus Depth, respectivamente. Ajuste o tempo de compensação deslizante manualmente para escurecer o lúmen da aorta para alcançar um contraste ideal da parede aorta.
7. Ajuste o manipulador do eixo Y para visualizar os pontos de ramificação das artérias renais superiores e renais certas. Use a artéria renal direita como um marco para capturar a imagem da aorta suprarrenal (Figura 2A).
8. Grave pelo menos 100 quadros de imagens do modo B na aorta suprarrenal.
9. Pressione a cinestore para salvar as imagens do modo B.
10. Pressione o botão do modo M no teclado do instrumento para ativar a gravação do modo M. Enrole a bola do cursor para levar a linha indicadora amarela para uma seção normal de aorta com imagem clara da parede da embarcação, ou para as seções onde o diâmetro máximo do aneurisma é observado.
11. Pressione o alternador do SV/portão e ajuste a bola do cursor para garantir que as paredes do vaso estejam incluídas no suporte de medição. Pressione a atualização para gravar medições do modo M e pressione a cinestore a capturar(Figura 2A,B).
    NOTA: O diâmetro máximo do aneurisma pode não estar no mesmo plano de imagem da visão ideal do eixo longo da aorta. Ajuste ligeiramente o botão manipulador do eixo X para cada medição do modo M para garantir que o LEVE de cada seção seja capturado.
12. Para obter imagens de Visualização Kilohertz (EKV) portadas pelo ECG, pressione o botão do modo B para voltar à gravação do modo B.
    NOTA: Se as imagens não estiverem afiadas, ajuste o manipulador do eixo X para alcançar a imagem mais nítida da parede superior do lúmen sobre um comprimento de seção (ou seja, > 6 mm).
13. Pressione o botão Configurações de Fisioterapia no teclado e selecione Gating respiration. Ajuste a marcha Delay and Window manualmente para registrar os dados apenas durante as partes mais lisonjeiras da onda de respiração. As seções de gravação serão mostradas como blocos coloridos no rastreamento da onda de respiração.
    NOTA: Sem o ajuste da gating de respiração, as imagens do EKV serão borradas devido ao movimento normal do animal durante a respiração.
14. Pressione o botão EKV para ativar o modo EKV. No menu apropriado, selecione Resolução Padrão e taxa de quadros 3000 ou superior. Selecione proceder para gravar imagens EKV. Pressione a cinestore para salvar as imagens. Use a imagem do modo EKV para obter medições de velocidade de propagação de pulso (PPV), destensibilidade e cepa radial.
    NOTA: A gravação do EKV pode falhar se houver flutuações anormais na respiração, o animal está repirando muito rapidamente, ou as configurações das taxas de quadros são muito altas. Nesse caso, defina a taxa de quadros mais baixa e aguarde a respiração animal para estabilizar. Definir a taxa de quadros em 3000 geralmente é apropriado para ratos e ratos.

3. Passos pós-imagem

1. Limpe suavemente o gel ultrassônico da área abdominal do mouse com uma toalha de papel umedecida com água morna.
2. Coloque o rato de volta em sua gaiola em uma almofada de aquecimento.
3. Desligue a máquina de isoflurano, limpe a plataforma de imagem animal e transdutor com lenços umedecidos.
4. Transfira os dados de imagem coletados durante o ultrassom para o disco rígido.
5. Desligue o instrumento de ultrassom.
6. Depois que o rato se recuperar da anestesia e estiver alerta, remova a almofada de aquecimento e devolva a gaiola ao rack de habitação animal.

4. Análise de imagens aórticas abdominais

1. Análise de imagens do modo M para medir O MILD
   1. Abra o programa de ultrassom e digite o nome do estudo e informações descritivas para cada mouse.
   2. Abra os dados de ultrassom no software de análise e abra a imagem do modo M e pause o batimento cardíaco.
   3. Clique em Medidas.
   4. Selecione o pacote vascular nas opções de entrega. Clique em Profundidade e desenhe uma linha através do lúmen aórtico que se estende da parede interna à parede(Figura 2C,D).
      NOTA: Para consistência, as medidas devem ser tomadas na fase sistolica do ciclo cardíaco quando a aorta é ampliada. Desenhe três linhas em três batimentos cardíacos diferentes para obter medições precisas e médias de MILD. Na AAA, as medidas são tomadas na dilatação máxima da aorta. Também é aconselhável jejuar os animais de 4 a 6h antes de coletar imagens para evitar interferências da motilidade intestinal e garantir clareza de imagem.
2. Análise para velocidade de propagação de pulso (PPV)
   1. Abra a imagem do EKV e pare o batimento cardíaco.
   2. Abra uma nova janela no software de análise (por exemplo, Vevo Vac) clicando no ícone do nome.
   3. Clique na opção PPV (seta na Figura 3D). Uma pequena janela aparecerá ainda mais com a imagem da aorta.
   4. Desenhe uma caixa retangular clicando na parede superior do vaso e arrastando o ponteiro por cerca de 4 mm cobrindo ambas as paredes da aorta suprarrenal.
      NOTA: Mantenha o comprimento da caixa consistente (~4 mm) para todas as imagens. O usuário pode ajustar a caixa retangular girando para alinhar a caixa e selecionando a linha e arrastando para uma nova posição na embarcação que está sendo analisada para obter a inflexão mais apropriada e clara da onda de pulso. As linhas verticais de dados do retângulo serão exibidas e identificadas como a esquerda (imagem superior) e direita (imagem inferior) no ROI. Para uma melhor visualização da inflexão da onda de pulso, às vezes é útil para a caixa de desenho apenas na parede superior, como mostrado na Figura 3. O software calculará automaticamente o PPV (m/s). No entanto, é sempre melhor ajustar manualmente as linhas roxas para definir o ponto exato de inflexão nas ondas de pulso e o PPV mudará de acordo.
   5. Por fim, selecione o comando Aceitar para salvar os valores do PPV. Exporte os números e os dados para a unidade de armazenamento de dados.
3. Análise para destensibilidade e cepa radial
   1. Abra a imagem do EKV e pare o batimento cardíaco.
   2. Clique no ícone do software. O software abrirá uma nova janela.
   3. Clique no traço do novo ROI e desenhe uma caixa retangular nas duas paredes do vaso. O software rastreará automaticamente as paredes superior e inferior da embarcação. O usuário pode ajustar o traço para se alinhar na parede clicando em pontos verdes (Figura 4A,B).
   4. Agora aceite o rastro. O software calculará a distensibilidade (1/Mpa) no ROI selecionado.
   5. Para a medição da tensão radial, selecione a opção de tensão apropriada nas barras do menu na parte superior esquerda. As imagens para tensão radial e tensão tangencial serão abertas.
   6. Obtenha o valor para a cepa radial (%) movendo o cursor no pico da curva. Exporte os dados como imagens ou em formato de vídeo (Figura 4A,B).

Resultados

Imagens representativas do modo M da aorta abdominal normal e aneurisma dos camundongos são mostradas na Figura 2A e Figura 2B,respectivamente. A aorta abdominal suprarrenal é identificada por sua localização ao lado da artéria renal direita e a artéria mesentérica superior(Figura 2A). Imagens representativas utilizadas para o cálculo do MILD, em três batimentos cardíacos ...

Discussão

A imagem de ultrassom fornece uma técnica poderosa para determinar propriedades funcionais da aorta através de medições de PPV, destensibilidade e cepa radial. Essas medidas são particularmente instrutivas para estudar modelos de camundongos da AAA e a abordagem in vivo permite a coleta de dados longitudinal que são potencialmente importantes para entender o desenvolvimento temporal da patologia aórtica. Especificamente, as medidas de rigidez aórtica in vivo são determinadas localmente na aorta abdominal por PPV...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Angiotensin II	Sigma	A9525
Apoe-/- mice	The Jackon lab
Clippers	WAHL	1854
Cotton swab	Q-tips
DAPT	Sigma	D5942
Depilatory cream	Nair	LL9038
Electrode cream	Sigma	17-05
Gel warmer	Thermasonic (Parker)	82-03 (LED)
Heating pad	Stryker	T/pump professional
Isoflurane	VetOne	Fluriso TM
Isoflurane vaporizer	Visualsonics	VS4244
Lubricating ophthalmic ointment	Lacri-lube
Osmotic pumps	Alzet	Model 2004
Oxygen tank	Air gas
Tranducer	Visualsonics	MS-400 or MS550D
Ultrasonic gel	Parker	Aquasonic clear
Ultrasound Imaging System	Visualsonics	Vevo 2100
Vevo Vasc Software	Visualsonics