Überwachung der eIF4F-Montage durch Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen vor, das es dem Anwender ermöglichen würde, die medikamentöse Störung der komplexen EIF4F-Dynamik in Screening-Formaten zu bewerten.

Zusammenfassung

Die Bildung des eIF4F-Komplexes hat sich als der wichtigste nachgeschaltete Knoten für die Konvergenz von Signalsignalen erwiesen, die häufig beim Menschen onkoogene Aktivierung erfahren. eIF4F ist ein Cap-Bindungskomplex, der an der mRNA-ribossomeRekrutierungsphase der TranslationInitiation beteiligt ist. In vielen zellulären und präklinischen Krebsarten führt die Deregulierung von eIF4F zu einer verstärkten Übersetzung spezifischer mRNA-Teilmengen, die an der Proliferation und dem Überleben von Krebs beteiligt sind. eIF4F ist ein heterotrimerkomplex, der aus der Kappenbindungs-Untereinheit eIF4E, dem Helicase eIF4A und der Gerüstuntereinheit eIF4G gebaut wurde. Entscheidend für die Montage aktiver eIF4F-Komplexe ist die Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen eIF4E- und eIF4G-Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der eIF4F-Assembly, das den Status der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen überwacht. Der eIF4e:4G zellbasierte Protein-Protein-Interaktionstest ermöglicht auch eine genaue und zuverlässige Bewertung medikamentös induzierter Veränderungen in der komplexen Integrität von eIF4F. Wir stellen uns vor, dass diese Methode zur Überprüfung der Aktivität kommerziell erhältlicher Verbindungen oder zum weiteren Screening neuartiger Verbindungen oder Modalitäten angewendet werden kann, die die Bildung des eIF4F-Komplexes effizient stören.

Einleitung

Die Kontrolle der Genexpression spielt eine zentrale Rolle bei der korrekten Ausführung zellulärer Programme wie Wachstumsproliferation und Differenzierung. Ein regulatorischer Kontrollmechanismus kann entweder auf der Ebene der Gentranskription oder auf der Ebene der mRNA-Translation ausgeübt werden. In den letzten zehn Jahren ist es immer offensichtlicher geworden, dass die translationale Kontrolle durch Modulation des Initiationsprozesses und nicht durch die späteren Schritte der Dehnung und Beendigung die Synthese bestimmter Teilmengen von Proteinen, die eine breite Palette biologischer Funktionen spielen, fein regulieren kann.

Erhöhte Übersetzung von mRNAs, die am Überleben beteiligt sind, antiautophagische und anti-apoptotische Reaktionen wurden in mehrere Krebsarten verwickelt und wurden auch ursächlich mit der abnormen Aktivierung oder dem Ausdruck von Translationsinitiationsfaktoren in Verbindung gebracht¹.

Der eIF4F-Komplex ist ein Master-Regulator der Übersetzungsinitiierung. Durch die Bindung der Cap-Struktur am 5' Ende von mRNAs treibt eIF4F die anfängliche mRNA-ribossome Rekrutierung voran und erhöht damit die mRNA-Translationseffizienz von schwach übersetzten eukaryotischen mRNAs². EIF4F vermittelte Übersetzung von krebsbedingten mRNAs wurde für viele Krebsmodelle berichtet, die eine abnorme Aktivierung von RAS/MAPK- oder AKT/TOR-Signalwegen beherbergen, was darauf hindeutet, dass Krebszellen eIF4F hochregulieren, um ihre eigene proneoplastische Aktivität zu steigern. Die Störung dieser Einspeiseschleife durch Hemmung der eIF4F-Komplexbildung ist damit eine sehr vielversprechende therapeutische Strategie^3,4.

Der eIF4F-Komplex besteht aus (i) eIF4E, der kappenbindenden Untereinheit von eIF4F, die mit der Cap-Struktur der 5' UTR von mRNA interagiert, (ii) eIF4A, dem RNA-Helicase und (iii) eIF4G, dem Gerüstprotein, das sowohl mit eIF4A als auch mit eIF4E interagiert und schließlich die 40S-Riboso-Subunit⁵rekrutiert. EIF4G-Assoziation mit eIF4E ist der preisbegrenzende Schritt für die Montage funktioneller eIF4F-Komplexe und wird durch die eIF4E-bindenden Proteine (4EBPs, Mitglieder 1, 2 und 3)^{negativ reguliert.} Durch den Wettbewerb mit eIF4G-Bindung an eIF4E über eine Schnittstelle, die aus kanonischen und nicht-kanonischen eIF4E-Bindungssequenzen^7,8,9 (Region aa 604-646 auf Human eIF4E) besteht, reduziert 4EBP den Pool von eIF4E, der aktiv an der Übersetzung und Der Verhinderung von eIF4F-Komplexbildung beteiligt ist. Das Zusammenspiel dieser Protein-Protein-Wechselwirkungen wird hauptsächlich durch das Säugetierziel der rapamycin (mTOR)-vermittelten Phosphorylierung von 4EBP reguliert. Bei mitogenen Reizen phosphorisiert mTOR die Mitglieder der 4E-BP-Proteinfamilie direkt, verringert ihre Verbindung mit eIF4E und fördert damit die EIF4E-eIF4G-Interaktion und die Bildung funktioneller eIF4F-Komplexe¹⁰.

Trotz der großen Anstrengungen bei der Entwicklung von Verbindungen, die auf die komplexe Integrität von eIF4F abzielen, hat das Fehlen von Assays zur Messung der direkten Störung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen die Suche nach zellulären aktiven Schlagverbindungen eingeschränkt. Wir haben einen Luziferase-Assay auf Basis eines Coelenterazin-Analogas (z. B. Nanoluc-basierter Komplementierungs-Assay) angewendet, um den Status der eIF4F-Integrität durch die eIF4E-eIF4G-Interaktion in Echtzeit zu überwachen. Das Luziferase-Komplementierungsproteinsystem besteht aus einem 18 kDa-Proteinfragment (SubA) und 11 Aminosäure-Peptidfragment (SubB), das für minimale Selbstassoziation und Stabilität optimiert ist¹¹. Einmal als Fusionsprodukt mit dem menschlichen EIF4E und der eIF4E-Interaktionsdomäne aus dem menschlichen eiF4G1 (aa 604-646) ausgedrückt, werden die beiden interagierenden Proteine das SubA- und SubB-Fragment in die Nähe voneinander bringen und die Bildung der aktiven Luziferase induzieren, die in Gegenwart eines zelldurchlässigen Substrats schließlich ein helles Leuchtsignal erzeugen wird (Abbildung 1). Wir haben an anderer Stelle über den Bau und die Validierung des EIF4E:eIF4G^604-646 Ergänzungssystems¹⁶berichtet.

Hier beschreiben wir, wie das komplementäre System eIF4E:eIF4G^604-646 (auf Anfrage erhältlich) angewendet werden kann, um 4EBP1-vermittelte eIF4E-eIF4G-Störungen in lebenden Zellen genau zu messen. Darüber hinaus zeigen wir seinen Nutzen, indem wir die Wirkung mehrerer mTOR-Inhibitoren messen, die sich derzeit in klinischen Studien als potenzielle Krebstherapeutika befinden¹². Da Off-Target-Effekte oft die medikamentöse Aktivität verschleiern, beschreiben wir auch, wie die Vielseitigkeit der EIF4E:eIF4G^604-646 Systemmessung mit orthogonalen Messungen der zellulären Lebensfähigkeit erweitert werden kann, um diese zu berücksichtigen.

Protokoll

HEK293 Zelllinie wurde für das Protokoll verwendet und wurde in Dulbecco modifizierte Adler Medium ergänzt mit 10% Fetal Bovine Serum, 2 mM L-Glutamin, und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin kultiviert. Die Zellen wurden bei 37 °C mit 5%_CO2 in einer befeuchteten Umgebung kultiviert.

1. Quantitative Bewertung der komplexen Störung des eIF4F über eIF4E:eIF4G^604-646 Complementation Assay

1. Zellkultur und transiente Transfektion von eIF4E:eIF4G^604-646 Komplementierungstest
   1. Verwenden Sie frisch aufgetaute Zellen mit weniger als 20 Passagen für alle Experimente. Bestimmen Sie am ersten Tag die Zellennummer mithilfe eines Standardzellenzählers, und zählen Sie die gesamten lebensfähigen Zellen mit der Trypan Blue Exclusion Methode¹³.
   2. Samen 6-Well-Platten mit 0,9 - 1,2 x 10⁶ HEK 293 Zellen pro Brunnen in 2 ml Standardwachstumsmedium.
      HINWEIS: Um die beste Transfektionseffizienz innerhalb der oben angegebenen Zelllinien zu erreichen, stellen Sie sicher, dass die vergoldeten Zellen am Tag nach der Aussaat 70-90% konfluent sind.
   3. Am Morgen des 2. Tages werden Zellen mit SubA-eIF4E und eIF4G^604-646-SubB-Plasmid mit einem lipidbasierten Transfektionsreagenz (siehe Materialtabelle) wie unten beschrieben, mittransfekt.
      1. Verdünnen Sie 9 l Liposomenlösung in einem Rohr, das 125 l reduziertes Serummedium ohne Phenolrot enthält (siehe Materialtabelle)für jede Transfektion und inkubieren Bei Raumtemperatur für 5 min.
      2. Bereiten Sie den Master-Mix der DNA vor, indem Sie für jedes Transfektionsrohr 3 g jedes Plasmids in 125 l reduziertem Serummedium verdünnen.
      3. Fügen Sie dem DNA-Master-Mix-Rohr 12 l Enhancer-Reagenzien hinzu, mischen Sie sie gut und fügen Sie sofort die DNA hinzu: Enhancer Master-Mix zu jeder Tube verdünnter Liposomen im Verhältnis 1:1. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      4. Fügen Sie den DNA-Lipid-Komplex zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C-Inkubator mit 5%_CO2 für 24 h.
   4. Am Morgen des 3. Tages, spülen Sie jeden Brunnen mit 1 ml PBS.
   5. Entfernen Sie die PBS und inkubieren Zellen in jedem Brunnen mit 0,3 ml Trypsin für 5 min bei 37 °C.
   6. Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 2 ml des reduzierten Serummediums ohne Phenolrot, das 0% FCS in jedem Brunnen enthält, hinzufügen und transfizierte Zellen in ein 15 ml-Rohr übertragen.
      HINWEIS: Phenolrot kann die Luziferase-Aktivität stören; Daher müssen die Zellen von diesem Schritt an in Medium ohne Phenolrot behandelt werden.
   7. Zellen für 5 min bei 290 x g abdrehen und das Medium ansaugen. Setzen Sie die Zellen in 2 ml des reduzierten Serummediums ohne Phenolrot mit 0% FCS aus. Zählen Sie wie in Schritt 1.1 beschrieben.
   8. Samen transfizierte HEK 293 Zellen in 96 gut undurchsichtigen Platten mit einer Dichte von 30.000 Zellen pro Bohrkörper in 90 l Medium ohne Phenolrot, das 0% FCS enthält. Um 3 technische Replikationen innerhalb des gleichen Experiments für 3 verschiedene Verbindungen zu erhalten, säen 60 Brunnen der Platten mit Zellen, die die Brunnen an den Rändern ausschließen.
   9. Unmittelbar nach dem Aussaat der transfizierten Zellen 10 L mit 10 % DMSO-Verbindungslösung hinzufügen (siehe Schritt 1.2).
2. Compound-Vorbereitung
   1. Bereiten Sie 1 mM Compound-Aktienlösungen vor, indem Sie die Zinsverbindung in 100% DMSO (v/v) auflösen. Um 3 Replikationen für jede zusammengesetzte Titration zu erhalten, verwenden Sie 8 l der 1 mM Compound-Stammlösung.
      HINWEIS: Das Volumen von 1 mM Stammmasse verwendet wird, ist mehr als das, was es benötigt wird. Dies geschieht, um Pipettierfehler zu berücksichtigen, falls vorhanden.
   2. Führen Sie eine 2-fache serielle Verdünnung der Stammverbindungslösung mit 4 l des 1 mM-Bestands in 4 l von 100 % DMSO für jeden Titrationspunkt durch.
      HINWEIS: Für eine vollständige zusammengesetzte Titration führen Sie 9 serielle Verdünnungen aus dem Ausgangsbestand in 100% DMSO durch. Wenn mehrere Verbindungen getestet werden müssen, verwenden Sie eine 96-Well-Platte und eine Mehrkanalpipette, um diesen Schritt und nachfolgende Verdünnungen zu erleichtern.
   3. Fügen Sie für jeden Punkt der 2-fachen seriellen Verdünnung 36 l Sterilwasser der HPLC-Klasse hinzu, um eine 40-L-L-10-fache Arbeitslösung in 10 % DMSO (v/v) zu erstellen (d. h. 100 bis 0,39 M 10 % DMSO-Stammserie, die zu einer von 10 bis 0,039 M,in 1 % DMSO führt, wenn zellenzugesetzt wird). Wie für die Behandlungskontrolle, bereiten Sie auch eine 10% DMSO nur Lagerlösung in HPLC-Grade sterilen Wasser.
   4. Fügen Sie den Zellen in der 96 gut opaken Platte 10 l 10 l 10 l 10 l 10-L-Arbeitslösungen hinzu, um die beabsichtigte Endkonzentration mit einer Rest-DMSO-Konzentration von 1% (v/v) bei einem Gesamtvolumen von 100 l zu erzielen und 3 h bei 37 °C mit 5% v/v atmosphärischem CO₂zu brüten.
3. Luziferase-Komplementierung und Lebensfähigkeitstest
   1. Nach 3 h Arzneimittel herstellung das Luziferase-Substratreagenz durch Kombination von 1 Volumen Substrat mit 19 Volumen des Verdünnungsreagenzes (siehe Herstelleranleitung).
      HINWEIS: Der Luziferase-Test wird mit einem handelsüblichen Kit durchgeführt (siehe Tabelle der Materialien).
   2. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um sofort 25 L Substratreagenz hinzuzufügen.
   3. Schütteln Sie die Platte bei 350 Umdrehungen von Euro/ Mittel 50 min auf einem Orbital-Shaker bei Raumtemperatur.
   4. Bewerten Sie die Lumineszenz mit einem Plattenleser. Stellen Sie dazu den Spiegelleser auf Lumineszenz und den Emissionsfilter auf 455. Verwenden Sie eine Messhöhe von 6,5 mm mit einer Messzeit von 1 s.
   5. Um die Zelllebensfähigkeit zu beschwichtigen, fügen Sie 33 L des Lebensfähigkeits-Assay-Reagenz hinzu und messen Sie dann die Lumineszenz nach 15 min bei Raumtemperatur mit dem Plattenleser erneut.
   6. Bewerten Sie die Lumineszenz mit dem Plattenleser, indem Sie den Spiegelleser auf Lumineszenz und den Emissionsfilter auf 600 nm einstellen. Verwenden Sie eine Messhöhe von 6,5 mm mit einer Messzeit von 1 s.
      HINWEIS: Die Lebensfähigkeit wird durch Messung des intrazellulären ATP-Spiegels bei der Zelllyse gemäß den Anweisungen des Herstellers beurteilt. Multiplexing ist in diesem Fall möglich, da der Lebensfähigkeitstest eine andere Luziferase mit einer anderen Emissionswellenlänge verwendet.
   7. Verwenden Sie die Daten, um die IC50-Werte jeder Verbindung durch Kurve zu bestimmen, die die Daten an eine 4-Parameter-Anpassungskurvengleichung anpasst:
      Y = ((A-D)/(1+((x/C)))) + D
      Die numerischen Werte D und A müssen im Kurvenanpassungsprozess eingeschränkt werden:
      D = Leuchtwert auf der Y-Achse für minimale Kurvenasymptote oder minimale theoretische Reaktionsstufe, die vom eIF4E:4G-Komplementierungstest erwartet wird.
      A = Lumineszenzwert auf der Y-Achse für maximale Kurvenasymptote oder maximale theoretische Antwortvariablen, die vom eIF4E:4G-Komplementierungstest erwartet werden.
      ANMERKUNG: Der Wert für die minimale Reaktion wird aus der 1% DMSO (v/v) Kontrollbehandlung abgeleitet, und der Wert für die maximale Reaktion wird von der maximalen Reaktion eines mTOR-Inhibitors mit hoher Affinität abgeleitet, der ohne Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit plateaued hat.

2. Korrelierende eIF4E:eIF4G^604-646 Assay-Hemmung mit eIF4F-komplexer Störung in Zellen

1. Um zu bestätigen, dass das vom Test gemessene Signal der physikalischen Störung der eIF4E-eIF4G-Wechselwirkung durch die Verbindung, Samenzellen, wie in Schritt 1.1 beschrieben, entspricht.
2. Ersetzen Sie am Tag danach das Medium durch 1 ml reduziertes Serummedium, das kein Phenolrot enthält, und brüten sie 4 h durch die Verbindung von Interesse. Stellen Sie eine Rest-DMSO-Konzentration von 1% (v/v) bei einem Gesamtvolumen von 1 ml sicher.
   ANMERKUNG: Um eine Korrelation mit dem Ergebnis zu ermöglichen, verwenden Sie zusammengesetzte Konzentrationen am Anfang, Mittelpunkt und Endpunkt der gemessenen Komplementierungs-Assay-Titrationskurve.
3. Lyse-Zellen und durchgeführt m⁷GTP ziehen nach unten, um eIF4F und eIF4E:4EBP1 Komplexe zu isolieren. Detaillierte Verfahren zur Durchführung des m⁷GTP Pull-Down-Experiments finden Sie an anderer Stelle¹⁴.
4. Detektieren Sie m⁷GTP-gebundene eIF4G-, eIF4E- und 4EBP1-Proteinspiegel durch Western-Blot-Analyse und korrelieren Sie dann mit eIF4F-komplexer Störung mit Komplement-Assay-Signalhemmung.

Ergebnisse

Um die Empfindlichkeit des Komplementierungssystems eIF4E:eIF4G^604-646 zu validieren, wurde die 4EBP1-vermittelte Hemmung der eIF4F-Komplexbaugruppe mit mTOR-Inhibitoren bewertet. Durch hemmende mTORC1-Kinase-abhängige Phosphorylierung der 4EBP-Proteinfamilie verbessert die mTOR-Hemmung die 4EBP1-Assoziation mit eIF4E und damit eIF4F-Demontage¹⁵. Es wurden zwei Klassen mechanistisch unterschiedlicher MTOR-Kinasen getestet: Rapalogs (z.B. Rapamycin), die...

Diskussion

Die in diesem Artikel beschriebene Methode nutzt einen luziferase-basierten Komplementierungstest zur quantitativen Überwachung der komplexen EIF4F-Montage durch direkte Messung der eIF4G-eIF4E-Interaktion in lebenden Zellen. Wir haben Einzelheiten für die Verwendung des eIF4E-eIF4G-Komplementierungssystems zur Verfügung gestellt und auch gezeigt, dass das System bei der Messung der medikamentös induzierten 4EBP1-vermittelten Dissoziation der eIF4E-eIF4G-Interaktion¹⁶extrem genau ist. Um den D...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT cells	Thermo Fisher Scientific	R70007
Cell culture microplate 96 well, F-Bottom	greiner bio-one	655083
Cell titer Glo 2.0	PROMEGA	G9241
Envision Multilabel Reader	PerkinElmer	not applcable
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml	Thermo Fisher Scientific	4662070
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml	Thermo Fisher Scientific	4662050
FUGENE6	PROMEGA	E2692
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
NanoBiT PPI Starter Systems	PROMEGA	N2014
Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	11058021
Orbital shaker	Eppendorf	not appicable
γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose	Jena Bioscience	AC-155S